Centrifugación-diferencial.docx

Nombre de la práctica: Práctica Centrifugación 8 Diferencial Realizó: Jorge Luis Copado Romero Michelle Aylín Guerrero Ángeles Cristopher Brayan Jaimes Gómez Fernando Omar Mendieta González Jessica Jazmín Silva Tovar Fecha de realización: Fecha de entrega 23 de octubre de 2018 30 de octubre de 2018 CONTENIDO

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I. INTRODUCCIÓN II. OBJETIVO III. METODOLOGÍA III.1. Material y equipo. III.2. Reactivos y soluciones. III.3. Procedimiento. IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA I.INTRODUCCIÓN La separación centrífuga es desde hace más de un siglo una de las operaciones unitarias más importantes en procesos claves de las industrias químicas, farmacéuticas, tratamiento de efluentes, purificación de aceites combustibles y lubricantes y suspensiones en general. En el campo de la tecnología de la separación mecánica las separadoras y decantadoras se catalogan dentro de las centrifugadoras, se emplean para la concentración de sólidos, clarificación de suspensiones y separación de mezclas de líquidos con eliminación simultánea de sólidos. Esencialmente la centrifugación es una decantación selectiva de los componentes insolubles de una mezcla bajo condiciones de gravedad artificial. El principio de separación por centrifugación diferencial se basa en las diferentes velocidades de sedimentación de las partículas. En el caso de homogenizados biológicos las diferentes articulas celulares suelen ser separadas por centrifugación diferencial. Es el proceso que tiene como resultado la obtención de un sobrenadante y un material sedimentado. Adicionalmente pueden emplearse fundamento de sedimentación combinados, como el caso de la centrifugación mediante un gradiente de densidades.

Este tipo de centrifugación es un proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. El método es un poco más elaborado que la centrifugación diferencial, no obstante, presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y la realización de medidas analíticas. El método de gradiente de densidades implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, o sales de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas). El objetivo de la metodología consiste en obtener separación de diferentes sólidos presentes en muestras de alimentos. Lo anterior se realizará con centrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Esta práctica ha sido modificada para los alumnos del área de ingeniería de alimentos pues generalmente se usa en el área de Biología Molecular.

II.OBJETIVO: III.

METODOLOGIA:

IV.

RESULTADOS: Se prepararon 4 soluciones de sacarosa con diferentes concentraciones peso/ volumen (20%, 40%, 60% y 80%) y se tiñeron con colores naranja, azul, amarillo y verde, respectivamente (Figura 1) para formar un gradiente en un tubo falcon como se observa en la figura 2.

Figura 1. Soluciones a diferentes concentraciones w/v de sacarosa. De izquierda a derecha: 20%, 40%, 60% y 80%

Figura 2. Gradiente diferencial

Figura 3. Gradiente diferencial posterior a la centrifugación

Figura 4. Sedimento de partículas sólidas del agua de horchata

Se depositaron 4ml de nuestra muestra (agua de horchata) en la última capa del gradiente y se centrifugó a 4000rpm durante 11 minutos. Posterior a la centrifugación, en la Figura 3 y 4 se observan las diversas bandas en el tubo falcon con el gradiente diferencial, las cuales contienen las partículas sólidas de nuestra muestra y el sedimento de aquellas más pesadas, que en este caso, son partículas de arroz y canela molidas (de acuerdo a la receta con la que se elaboró el agua de horchata). Cuando se coloca una pequeña cantidad de la disolución con las moléculas que se quieren caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un tubo de centrifugación, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte superior del gradiente y cuando se centrifuga el tubo las moléculas de la capa superior sedimentan a través del gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentación sedimentarán en una estrecha franja, sin embargo, si hay moléculas con distintos coeficientes de sedimentación, se separaran unas de otras a medida que se produzca la centrifugación y finalmente los diferentes componentes se resolverán en una serie de zonas o bandas (Griffith).

La velocidad de avance de las partículas (y, por tanto, el mecanismo de la separación) depende de su tamaño, forma y densidad; todos estos parámetros se combinan

en el coeficiente de sedimentación, que se mide en unidades svedberg (1 S = 10−13 segundos) (Biomodel) Coeficiente de sedimentación = s =velocidad de sedimentación / aceleración centrífuga

El gradiente de densidad se crea mediante un gradiente de concentración. La sacarosa posee propiedades para ser un ideal medio para la formación de gradiente y es el más utilizado en la centrifugación zonal. Este material tiene aplicación en el fraccionamiento de organelos celulares y virus. La razón de su gran utilidad es su comportamiento inerte ante la presencia del material biológico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentración y viscosidad, densidad e índice de refracción en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugación para la separación de un gran tipo de muestras biológicas (Griffith).

V.

DISCUSIÓN:

La separación de los compartimientos celulares es un paso importante para estudiar una estructura intracelular, proteína u orgánulo específico, o para investigar posibles asociaciones entre estas estructuras macromoleculares. El fraccionamiento subcelular utiliza una o más propiedades de cada compartimento, tales como la densidad de flotación, densidad de carga superficial, forma y tamaño, y se basa principalmente en la centrifugación diferencial en medios de alta viscosidad a 4°C. Los medios utilizados para la centrifugación diferencial son principalmente sacarosa, manitol, glicerol, Ficoll 400 (un polímero de sacarosa), Percoll (sílica coloidal) y iodixanol (OptiPrep). La sacarosa es ampliamente utilizada porque es económica (Nikos, 2013). En la práctica se utilizó el principio de centrifugación por gradientes que de acuerdo a lo reportado en la literatura permite la separación de organelos o macromoléculas de acuerdo a la afinidad con los componentes fisicoquímicos de cada gradiente. Para ello, se realizaron soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones, factor que permitió generar un gradiente discontinúo de densidades para la separación (20, 30, 40, 50 y 60% peso/volumen de sacarosa) para finalmente adicionarles 4 sustancias o sólidos: cabellos (de 2-3 mm aproximadamente), sólidos de jugo de verdura marca del Valle, cuadritos de papel, y sólidos disueltos de agua de horchata. Tras la centrifugación a 4000 rpm/ 11 min, se pudo observar que las 4 sustancias añadidas quedaron sedimentadas en la parte inferior del tubo en la fracción del gradiente de sacarosa al 20%. Esto último se debe a la densidad de las partículas sedimentadas. En la siguiente figura, se muestra la densidad de soluciones de sacarosa en relación a la temperatura, haciendo uso de los grados brix y atendiendo a lo dicho en la literatura, os grados Brix son una unidad de cantidad (símbolo °Bx) y sirven para determinar el cociente total de materia seca (generalmente azúcares) disuelta en un líquido. Una solución de 25 °Bx contiene 25 g de sólido disuelto por 100 g de disolución total.

Figura 3. Densidad de soluciones de sacarosa a diferente concentración a temperatura ambiente (25°C). (Zavaleta, 2010) En la figura anterior se observa que, a una temperatura fija, la densidad de las soluciones es proporcional al aumento de la concentración de sacarosa, como puede observarse en la figura 1 y 2 la solución verde corresponde a la de mayor concentración 80%, cuya densidad es mayor a 1.36 g/L. La densidad del papel en promedio es de 0.5 g/L. Sin embargo, se observó en la zona de mayor densidad debido a que se humedeció y con ello aumentó su peso, favoreciéndose su sedimentación. En la figura 2, los sólidos del fondo corresponden a la canela del agua de horchata, seguidos por los del jugo del Valle, el papel y los cabellos, los cuales están en orden de densidad, de mayor a menor. Esto último ejemplifica el objetivo de la separación por gradientes cuya aplicación molecular es de importancia para la separación de partes celulares específicas, con fracciones constituidas de reactivos específicos y que mejoran la eficiencia del proceso.

VI.

CONCLUSIONES:

VII.

BIBLIOGRAFIA:

Anguerell I., Casamitjana N., Caubet A. (2017). Centrifugación. Operaciones Básicas en el laboratorio de química. Universitat de Barcelona. Disponible en: http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/centrifugacio.html. Consultado el 29 de octubre de 2018. Biomodel. Centrifugación. [En línea]. Disponible en: http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm. Consultado el 29 de octubre de 2018.

Griffith, O. M., Techniques of Preparative, Zonal, and Continuous Flow Ultracentrifugation. Beckman Instruments Zavaleta, R. (2010). Sucrose syrup preparation by volumetric measurements. ACTA NOVA; 5(1): pp. 110-137, ISSN: 1683-0768. Nikos, P. (2013). Fraccionamiento celular. Institute Jacques Monod, Paris, France. dx.doi.org/10.13070/mm.es.3.562.