Pruebas Bioquímicas Para Enterobacterias.docx

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA ENTEROBACTERIAS IDENTIFICACIÓN MICROBIANA Se entiende por identificación microbiana al conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los podemos clasificar en:      

Métodos basados en criterios morfológicos Métodos basados en tinción diferencial Métodos basados en pruebas bioquímicas Métodos basados en tipificación con fagos Métodos basados en pruebas serológicas Métodos basados en detección molecular

MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS  Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias.  Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. Por ejemplo, las bacterias entéricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogéneo cuyo hábitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos.  Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su género podemos seguir el siguiente esquema. PRUEBAS BIOQUÍMICAS        

Citrato Ureasa Voges-Proskauer Rojo de metilo Sulfuro Indol Movilidad (SIM) Movilida, Indol, Ornitina (MIO) Triple azúcar Herro (TSI) Agar Lisina Hierro (LIA)

Citrato  COLOR: VERDE INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO PRINCIPIO Es una sal del ácido cítrico. Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas de la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como única fuente de carbono.  La medición de esta característica es importante para identificar muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a probar debe carecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono.  La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la producción de subproductos alcalinos.  El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo que produce la alcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido de amonio (NH4OH).  El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6. MEDIO DE CULTIVO El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta). La fórmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente:         

Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g Fosfato dipotasico 1 g Cloruro de sodio 5 g Citrato de sodio 2 g Sulfato de magnesio 0 ,20 g Agar 15 g Azul de bromotimol 0 ,08 g Agua destilada 1 L pH final = 6,9

PROCEDIMIENTO Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48 horas. RESULTADOS La prueba positiva está representada por la producción de color azul oscuro en el término de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de productos alcalinos.

 La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es válido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase logarítmica de crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado carbono y nitrógeno. Microorganismos Positivos Salmonella Arizona Citrobacter Enterobacter Klebsiella Serratia licuefaciensis Pseudomonas cepacia

Microorganismos Negativos Edwarsiella Yersinia enterocolítica Escherichia coli Shigella Yersinia pseudotuberculosis Otras especies de Moraxella Proteus morganii

Ureasa  COLOR: ROSADO  INDICADOR: ROJO FENOL  SUSTRATO PRINCIPAL: UREA PRINCIPIO  Es una diamida del ácido carbónico  Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono.  El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del medio. MEDIOS DE CULTIVO Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen. PROCEDIMIENTO El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar. La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas. RESULTADOS Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o más. Las reacciones son las siguientes:  Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.  Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio. Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.

 Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

Microorganismos positivos Klebsiella Proteus (rápido)

Microorganismos negativos Escherichia coli Providencia

Voges- Proskauer  El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de acetoina (acetil metil carbinol)  Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia producen acetoina como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos.  En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoina se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo. MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) según la fórmula de Clark y Lubs. PROCEDIMIENTO Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar.     

Incubar 24 horas a 35 °C. Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

RESULTADOS  Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o más después del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la acetoina. La prueba no debe leerse más allá de una hora después de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso. Microorganismos positivos Klebsiella pneuminiae Yersinia enterocolítica

Microorganismos negativos Escherichia coli K. ozaenae

Rojo de Metilo PRINCIPIO  El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo).  El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho más bajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de ácido del sustrato de hidratos de carbono que se utilice.  La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de ácido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos fuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa. MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) según la fórmula de Clark y Lubs. PROCEDIMIENTO  Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio.  Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas).  Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al caldo. RESULTADOS  Positivo: El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente producción de ácido como para disminuir el pH a 4,4.  Negativo: Como otros microorganismos pueden producir pequeñas cantidades de ácido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prueba positiva. Microorganismos positivos Escherichia coli Especies de Yersinia -----------

Microorganismos negativos Enterobacter aerógenes Enterobacter cloacae Klebsiella

TSI: Triple azúcar Hierro MEDIO DE CULTIVO Agar hierro de klinger (AHK)  Composición: Extracto de carne, Extracto de levadura Peptona Proteasa Lactosa Dextrosa Sulfato ferroso Cloruro de Na Tiosulfato de Na Agar Agua destilada Indicador: Rojo fenol Ácido: amarillo Alcalino: Rojo Medio no inoculado: naranja rojizo, pH 7.4

PRINCIPIO  Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico. La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior)  El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y concentración 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar. Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.  El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol. A 6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán un color amarillo (fermentador de glucosa)  Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermentador de glucosa) Si el color rojo es mas intenso que el original, hay alcalinización (no es miembro de la familia enterobacteriaceae)  Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa. Después de 1824 hrs, el medio permanece amarillo, reacción ácido sobre ácido (A/A). Fermentador de lactosa. La producción de gas romperá el agar o lo empujara hacia arriba. Reacción A/A más gas.  Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos. El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante. 18-24 hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina sobre ácido K/A. PROCEDIMIENTO  Inoculación: picadura y estría en pico de flauta. Tiempo: 18-24 hrs Temperatura:35-37°C RESULTADOS  K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida). Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella.  A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida).Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.  K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa

LIA: Agar Lisina Hierro  COLOR: LILA  INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL  SUSTRATOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUCOSA

MEDIO DE CULTIVO Base de descarboxilasa de Moller Composición:         

Peptona Extracto de carne Piridoxal L-lisina Citrato de amonio Tiosulfato de sodio Glucosa Agua destilada Agar Indicador de pH: Purpura de bromocresol Ácido: Amarillo pH 5.2 Alcalino: Púrpura pH 6.8 Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0

PRINCIPIO Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente alcalinidad. PROCEDIMIENTO  Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano. Temperatura: 35-37°C Tiempo 18-24 hrs RESULTADOS    

A: ácido K: alcalino N: neutra R: Rojo (desaminación oxidativa)

Agar sangre El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) el cual tiene un agregado de 5 % de sangre ovina, (también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales y cloruro sódico.  Se usa para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: Alfa: halos verdosos Beta: halos incoloros Gamma: inexistencia de halos.  Hemólisis alfa: la hemolisis alfa se reduce a partir de una zona parda o verdosa alrededor de las colonias  Hemólisis beta: en la hemolisis beta, las bacterias sintetizan una hemolisina que origina una zona de lisis transparente alrededor de las mismas  Hemólisis Gamma