Validación De Hidroxipireno .docx

INTRODUCCIÓN Los

hidrocarburos aromático policiclicos (PAH´s) constituyen un grupo de

compuestos de dos o más anillos, formados a partir de la combustión incompleta de la materia orgánica (Mastandrea et al., 2005). Son sólidos a temperatura ambiente con alto punto de fusión, de ebullición y baja presión de vapor, lipofílicos tanto mayor cuanto mayor sea su peso molecular, por lo que suelen ser insolubles en agua (Albers, 1995). Tienen un coeficiente de reparto octanol-agua alto (3,46,5) lo que indica que pueden ser absorbidos a través de los diferentes tejidos biológicos, tales como la piel (Oliveira, 2010).

El estudio de PAH´s en estaciones de servicio se debe a que estos lugares de trabajo están expuestos directamente a este tipo de compuestos y ya que los principales agentes químicos que pueden estar presentes provienen de la gasolina, que es una mezcla compleja de compuestos, principalmente parafinas, olefinas, naftenos e hidrocarburos aromáticos y del diesel que es una mezcla de hidrocarburos aromáticos,

parafínicos, olefínicos, nafténicos y aromáticos

policiclicos (Rossell et al. 2007).

Los PAH´s son motivo de preocupación por sus propiedades inmunosupresoras y carcinogénicas halladas en sus compuestos y metabolitos. Son contaminantes orgánicos volátiles en mayor o menor medida en función de su masa molecular y con gran capacidad de adsorción en partículas atmosféricas capaces de alcanzar elevadas concentraciones en el aire en zonas con alta circulación de vehículos y fuentes directas de combustión (Pérez-Morales et al. 2016).

Por lo tanto uno de los aspectos fundamentales para la prevención y el control de los efectos sobre la salud de los HAP’s es la medición de los niveles de estos en el organismo (Koss et al. 1999). Entre ellos el monitoreo biológico es una herramienta utilizada para evaluar la exposición de los trabajadores a HAP’s, mediante la determinación de la concentración de sus metabolitos en fluidos

biológicos (Fernández, 1999). Uno de esos metabolitos utilizados es el 1hidroxipireno. En Colombia la determinación de 1-hidroxipireno en muestras de orina ha sido estudiada por diferentes autores por las

características mutagenicas

y

carcinogénicas de los HAP’s, entre estos estudios tenemos la cuantificación de hidrocarburos aromáticos policiclicos urinarios en la industria de la goma (Piñero et al., 2013), en la policía metropolitana de Bogotá (Díaz-Merchán, Urrego-Novoa, Rojas, Rodríguez-Pulido, & Prieto-Suarez, 2013), y estudios sobre los efectos genotóxicos de las mezclas complejas

de hidrocarburos

en estaciones de

servicio de gasolina en Barranquilla (González Torres, Moreno Rossi, & Quintana Sosa, 2015).

Si bien se han realizado algunos estudios sobre este tipos de compuestos en el país, en la ciudad de montería no existe ningún reporte sobre la exposición ocupacional acerca de este tipo de contaminantes y ya que no se tienen reportes no se conoce cuál es el grado de exposición a HAP´s de los trabajadores de las estaciones de servicio de la ciudad de montería, además de que existe desconocimiento por parte de los trabajadores sobre este tipo de sustancias y de las enfermedades que puede ocasionar la exposición a largo plazo y debido a que en Colombia el sistema de salud es pobre y que los trabajadores de estos lugares son personas de estratos 1 por lo general , que no cuenta con asistencia médica inmediata y especializada para el tratamiento de las enfermedades que puedan generarse, hace esta problemática aún más compleja. Por todo lo anteriormente expuesto en este estudio se evaluó la exposición ocupacional a HAP’s en trabajadores de estaciones de servicio, determinándose 1-hidroxipireno en orina como indicador biológico de exposición a HAP’s.

METODOLOGÍA

1-HIDROXIPIRENO Para la determinación del metabolito urinario se tomó como referencia el método desarrollado por Jongeneelen et al en 1987 con ligeras modificaciones. Para lo cual Se validó una metodología analítica en muestras de orina para posteriormente evaluar la exposición a HAP´s

TOMA Y PRESERVACIÓN DE LA MUESTRA La toma y preservación de la muestra se hizo de acuerdo al método desarrollado por Jongeneelen et al en 1987.

EQUIPOS Y MATERIALES 

Cromatógrafo líquido de ultra alta eficiencia con detector de fluorescencia molecular (HPLC-FLD) Ultimate 3000 marca Thermo Dionex



Columna Ultra AQC18 Restek® de 5µm de tamaño de partícula y 150 x 4.6 mm de longitud y diámetro interno respectivamente



Transfer-pipetas de 10-100 μL.



Transfer-pipetas 100-1000 μL.



Transfer-pipetas de 5mL



Beackers de 50 y 100 mL



Matraces aforados de 1 mL



Balones volumétricos de 20 mL



SPE



Cartuchos HYPERSEP Retain PEP

REACTIVOS 

Agua deshionizada



MeOH grado HPLC



Acetonitrilo grado HPLC



MeOH grado análisis



Ácido acético



Acetato de sodio



Enzima β-glucoronidasa/arilsulfatasa



Solución estándar de 1-Hidroxipireno: se preparó a partir de un estándar certificado una solución de 690 mg/L en acetonitrilo. Se inyecto un volumen de la solución en el sistema cromatografico bajo las condiciones de trabajo con el fin de verificar los tiempos de retención del metabolito y la respuesta del equipo.



Estándar de trabajo: A partir de la solución estándar se preparó un estándar de trabajo de 5mg/mL utilizando como solvente acetonitrilo.

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS El equipo se programó para detectar y cuantificar el 1-hidroxipireno, para ello se realizaron varias pruebas inyectando el estándar para verificar su tiempo de retención en la columna, utilizando como fase móvil MeOH: H2O. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE 1HIDROXIPIRENO. Para la determinación de 1-hidroxipreno se realizó la validación del método analítico, basado en el desarrollado por jongeneelen et al en 1987 con algunas modificaciones. El método utilizado es un método aceptado por el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo (INSHT) y que ha sido sometido a un protocolo de validación por organizaciones oficiales competentes en el área de normalización de métodos analíticos. En esta fase de la validación se evaluaron las etapas de preparación de la muestra y de análisis instrumental. Como criterios de aceptación se establecieron los descritos por la NOM-177-SSA1-1998. Los parámetros utilizados para validar

el método fueron: linealidad, exactitud, precisión, límite de cuantificación y límite de detección. MÉTODO DE EXTRACCIÓN Se prepararon alícuotas de 10 mL de orina

a cada una se les agregó una

concentración conocida de 1-hidroxipireno, se les adicionó 10 mL de buffer de ácido acético/acetato de sodio 0.2M a pH 5.0 y 100 μL de enzima βglucoronidasa/Arilsufatasa, luego se llevó a 30 rpm en un baño a 37°C por 17 horas, posteriormente se les realizó una extracción en fase solida (para obtener el 1-OHPyr agregado en la orina) con cartuchos Hypersep Retain PEP marca Thermo Scientific con capacidad de 6 mL y 200 mg de fase estacionaria polimérica. La retención del analito se llevó a cabo de acuerdo a las características de polaridad del mismo y de la fase estacionaria presente en las columnas. Para realizar la extracción de 1-OHPyr de las muestras de orina, primero se activaron las columnas Hypersep Retain PEP con un volumen de 5mL de metanol. Para el acondicionamiento se utilizó 5mL de agua deshionizada, posteriormente se pasó la muestra y para la elución del mensurando se utilizó un volumen de 10 mL de acetonitrilo grado HPLC, una vez realizada la elución se realizó La limpieza de las muestras con alúmina, luego se tomó 1mL del eluato en viales de 1mL y se inyecto en el sistema cromatografico.

EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

Linealidad: en la evaluación de la linealidad se prepararon soluciones estándar de diferentes concentraciones del metabolito que van desde 0.1ug/L hasta 100ug/L , se hizo

el proceso de extracción ya establecido, cada nivel de

concentración se analizó por duplicado

en el cromatógrafo bajo las mismas

condiciones de trabajo previamente establecidas.

Se graficó la relación del área del pico del metabolito vs la concentración del metabolito para evaluar la respuesta lineal del equipo a estas concentraciones. Para la cuantificación se construyó la curva de calibración teniendo en cuenta el comportamiento lineal de la gráfica, esta se determinó por medio de la evaluación del r2 de la regresión lineal generando la ecuación: 𝑦 = 𝑚(±𝑠𝑚 )𝑥 + 𝑏(±𝑠𝑏 )

(Quijano Parra)

Dónde: x: es la concentración. b: es el intercepto. y: es la respuesta del instrumento. m: es el valor de la pendiente. Además se realizó el análisis de incertidumbre en la pendiente e intercepto, expresadas como desviación estándar, este cálculo se realizó a partir de los datos utilizados en la obtención de la curva de calibrado. 𝑑𝑖2 = (𝑦𝑖 − 𝑦)2 = (𝑦𝑖 − 𝑚𝑥𝑖 − 𝑏)2 ∑(𝑑𝑖 )2 𝜎𝑦 ≈ 𝑠𝑦 = √ (𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑)

2 𝑠𝑚 =

𝑠𝑏2

Dónde:

𝑠𝑦2 𝑛 𝑛 ∑(𝑥𝑖2 ) − ∑(𝑥𝑖 )2

𝑠𝑦2 ∑(𝑥𝑖2 ) = 𝑛 ∑(𝑥𝑖2 ) − ∑(𝑥𝑖 )2

(!!! INVALID CITATION !!!)

sm: es una estimación de la desviación estándar de la pendiente. sb: es una estimación de la desviación estándar de la ordenada en el origen. sy: desviación estándar de las desviaciones verticales. di: es la desviación vertical de los puntos (xi , yi), xi , yi son los valores que toma la variable x e y. Para comprobar que la correlación lineal es significativa, se realizó el test estadístico t de Student, calculando tr con la ecuación (3), con n-2 grados de libertad y se comparó con t tabulado para un nivel de confianza establecido (α=0.05) y tr debe ser mayor que el ttabla, para rechazar la hipótesis nula y así la correlación lineal es significativa (Miller J, 2002):

tr 

r (n  2) 1 r2

(3)

Dónde: r: Coeficiente de correlación. r2: Coeficiente de determinación n: número de puntos en la curva de calibrado. tr: valor de t calculado. (n-2): grados de libertad. Además, para afirmar la validez del modelo lineal se realizó un análisis de residuos, para ello después de realizar la curva de calibrado se prepararon una serie de estándares con los que se obtuvo la curva y se analizaron, con los valores obtenidos se hizo la diferencia (yi – yi), donde los valores de yi, son los puntos

sobre la recta de regresión calculada correspondiente a los valores individuales de x, es decir, los valores de Y (ajustados). Precisión. Se refiere a la dispersión de varias preparaciones de la muestra final homogénea. La evaluación corresponde a todo el procedimiento, desde la preparación de la muestra hasta la medición del mensurando por parte del instrumento. Repetibilidad: esta se evaluó inyectando un mismo patrón del metabolito por triplicado el mismo día, por el mismo analista. Se realizó a tres niveles de concentración diferentes. A todas las concentraciones se les aplico el procedimiento de extracción ya establecido. La precisión se expresa como el coeficiente de variación o %RSD de una serie de medidas y se calcula con la ecuación (Quijano Parra). Para establecer si la concentración no afecta la variabilidad de los resultados se aplicó un test de Cochram (Ec. 4) a cada metabolito: s2

Gcalc = ( ∑MAX ) (4) s2 I

Dónde: S2MAX: varianza mayor en la curva de calibrado. ∑S2I: suma de las varianzas de todos los puntos de la curva de calibrado. Y luego se compara con el G tablas para k= 4; n= 3 y α= 0.05 Donde k es el número de grupos y n el número de determinaciones por grupo (Junes, 2009).

Reproducibilidad: Se realizó aplicando el procedimiento de extracción respectivo en tres muestras por triplicado en 2 días diferentes por distinto analista. Esta se

evaluó a una concentración de 50ug/L para el metabolito inyectándola tres veces el mismo día y se determinó con la ecuación (Quijano Parra): 𝒔

𝑪𝑽(%) = (𝒙) 𝟏𝟎𝟎 (Quijano Parra)

Dónde:

𝑠 = desviación estándar 𝑥 =media aritmética de los resultados

Se compararon las medias de las inyecciones en los días diferentes mediante una prueba t; no debe haber diferencia significativa al nivel de confianza del 95% (α=0,05) (Miller, 2002). |

𝑡𝑐𝑎𝑙 =

1−

2|

1 1 + 𝑛1 𝑛2

(6)

𝑆√

Dónde: 1:

media de medidas día 1

2:

media de medidas día 2

n1: número de medidas día 1 n2: número de medidas día 2 S viene dada por 𝑆2 =

(𝑛1 −1)𝑆12 +(𝑛2 −1)𝑆22 𝑛1 +𝑛2 −2

Límite de cuantificación y detección.

(7)

Después de preparar las curvas de calibrado y de hallar las ecuaciones de la recta de cada metabolito, se tomó el primer punto como el límite de cuantificación. El límite de detección se calculó como 3 veces el valor de la señal/ruido.

Exactitud. La exactitud del método se evaluó determinando el porcentaje de recuperación de 1-hidroxipireno en la muestra dopada a tres niveles de concentración dentro del rango lineal para el metabolito y se determinó el porcentaje de recuperación con la ecuación (8): 𝑋

%𝑅 = (𝑋 𝑜𝑏𝑡 ) 100 (8) 𝑓𝑜𝑟𝑡

Dónde: Xobt es la media de las recuperaciones de las réplicas. Xfort es la concentración a la que se fortifica Para el criterio de aceptación en base al valor obtenido para el porcentaje de recuperación se utilizaron los criterios de AOAC. Al igual se realizó la prueba t student bilateral para un nivel de confianza del 95% con la ecuación (9). Si el tcal≤tcrit no existen diferencias estadísticamente significativas.

𝑡𝑐𝑎𝑙 =

|100 − %𝑅| 𝑆𝑋√𝑛

(9)

Incertidumbre. Se realizaron los cálculos de los componentes de la incertidumbre del método para el análisis de 1-hidroxipireno en orina para estándares a nivel bajo, medio y alto preparados en el laboratorio y para calcular la incertidumbre combinada total, se realizó la suma individual de los componentes (QUAM).

Identificación de las fuentes de incertidumbre En el siguiente diagrama se recopilan las diferentes fuentes de incertidumbre que se tuvieron en cuenta:

ANÁLISIS Y RESULTADOS

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS En la tabla 1 se muestran las condiciones cromatográficas óptimas para el análisis de 1-hidroxipireno y en la figura 1 el tiempo de retención del metabolito utilizando como fase móvil metanol:agua Tabla 1: condiciones cromatográficas óptimas A agua Fase móvil

B metanol Gradiente

Elución

A-B

20-80 %

Excitación 242 nm Longitud de onda

Emisión

Temperatura

30° C

Flujo

1ml/min

Volumen de inyección

10 μL

Tiempo de análisis

10 minutos

388 nm

1-HIDROXIPIRENO

Figura 1: tiempo de retención de 1-hidroxipireno

LINEALIDAD DEL MÉTODO A partir de la solución de trabajo se prepararon 6 soluciones estándares por diluciones sucesivas desde 0,1 hasta 100 ug/L. Tabla 2: Factores de respuesta para los distintos niveles de concentración

Nivel

ug/L

Área1

Área 2

1

0,1

7957,4617

8342,4153

8149,9385

272,203301

3,33994

2

1

57112,0604

56685,6063

56898,8334

301,548586

0,52997

3

10

552606,517

548273,894

550440,205

3063,62647

0,55658

4

25

1433753,86

1406789,08

1420271,47

19066,9801

1,34249

5

50

2762631,2

2754103,46

2758367,33

6030,01804

0,21861

6

100

5586642,56

5578400,71

5582521,63

5827,87248

0,10439

X

S

% CV

6000000 y = 55729x + 925.94 R² = 0.9999

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

20

40

60

80

100

Figura 2: curva de calibrado para 1-hidroxipireno

120

Residuos

50000 0 0 -50000

20

40

60

80

100

120

Variable X

Figura 3: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno Para comprobar que existe una correlación lineal significativa, se realizó el test estadístico t de student bilateral, donde se calculó el tregresión con la ecuación (3) obteniéndose un tregresión: 235.992 con n-2 grados de libertad y se comparó con el tabulado para un nivel de confianza establecido (α= 0.05), obteniéndose un ttabulado : 2.776, ya que tregresión> ttabulado existe una relación estadísticamente significativa entre la variable área y concentración, el estadístico R2 indica que el modelo ajustado explica el 99.99% de la variabilidad en área. El coeficiente de correlación es igual 0.999964, indicando una relación relativamente fuerte entre las variables.

Precisión a condiciones de repetibilidad Se analizaron el mismo día muestras de orina fortificadas a 3 niveles de concentración por triplicado (1ug/L; 50ug/L; 100ug/L). A todas las concentraciones se les aplico el procedimiento de extracción ya establecido. Se calculó la precisión como el coeficiente de variación. Los criterios de aceptación en cada nivel de concentración y como promedio de los 3 puntos en la gráfica, fueron CV ≤ 15%, para establecer si la concentración no afecta la variabilidad de los resultados se aplicó un test de cochram.

Tabla 3: Precisión a condiciones de repetibilidad CONC

ÁREA

X

S

%RSD

56469,6894 1ug/L

61634,0128 56815,1496 4655,75551 8,19456702 52341,7467 3031241,65

50ug/L

2715584,4 2839915,26 168155,212 5,92113484 2772919,74 4251826,49

100ug/L

3875687,99 4082615,66 190884,687 4,67554878 4120332,51

Como podemos ver en la tabla, los coeficientes de variación están dentro del valor límite máximo que se ha establecido (≤15%) (UNAM, 2006), para los niveles de concentración especificados. Se determinó el análisis de homogeneidad de varianza que Gexp (0,082) es menor que Gtabla (0,767), así, las variancias de las concentraciones son homogéneas y

el factor concentración no influye en la

variabilidad de los resultados. Precisión a condiciones de reproducibilidad Se dopó la muestra de orina a un nivel de concentración conocida (50ug/L) por triplicado. Esto se repitió un segundo día. Se calculó la reproducibilidad por el %RSD. Los resultados se muestran en la tabla (4).

Tabla 4: Precisión a condiciones de reproducibilidad Día

Área

X

S

%RSD

3031241,65 1

2715584,4 2839915,26 168155,212 5,92113484 2772919,74 2319212,79

2

2346318,96 2452350,82 207570,144

8,4641293

2691520,71

Como podemos observar en la tabla 4 los coeficientes de variación están dentro del valor límite máximo que se ha establecido (≤15%) (Hernández, 2006). Al comparar las medias de las inyecciones en días diferentes mediante el contraste de significación t de student bilateral, calculado con la ecuación (6) a un nivel de 95% de confianza, se concluyó que dado a que tcal (2,512) se encuentra dentro de los valores críticos de la región (-2,776 < tcal < 2,776) de aceptación de la hipótesis nula, aceptamos la hipótesis nula. Por tanto, ya que la hipótesis nula establecía que la diferencia de medias era igual a cero, podemos concluir que no se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre las dos medias lo que quiere decir que la probabilidad de que haya una gran diferencia debida al azar es menor de 0,05%. Límite de cuantificación (LOQ) y límite de detección (LOD) Se estableció como límite de cuantificación la concentración menor del intervalo de calibración (0,1 ug/L) para el 1-OHPyr que cumplió con el criterio de precisión de CV ≤ 20% y el límite de detección se calculó como 3 veces el valor de la señal/ruido, siendo este de 0,01ug/L.

Exactitud como porcentaje de recuperación (%R). Se fortificaron muestra de orina a 3 niveles de concentración (1ug/L; 50ug/L; 100ug/L) dentro de la curva de calibrado. En la tabla se observan los datos para él %R y fueron calculados a partir de la ecuación (8) y son el promedio de los tres niveles de concentración para el metabolito. Los valores obtenidos arrojan un buen comportamiento del mensurando través del procedimiento desarrollado. Tabla 5: Exactitud como porcentaje de recuperación Niveles

Área

Xobt (μg/L)

metabolito

Xfort

%R

(μg/L) 0,997

61634,0128

1,089

52341,7467

0,923

92,260

3031241,65

48,938

97,877

Nivel

2715584,4

43,841

Medio

2772919,74

44,767

89,533

4251826,49

81,617

81,618

3875687,99

90,387

4120332,51

88,702

Nivel Alto

Valor AOAC

56469,6894 Nivel Bajo

Promedio %R

99,668 1

50

100

108,934

87,681

90,387

100,287

40-120

91,697

60-110

86,902

80-110

88,702

En la tabla 5 podemos observar que las recuperaciones obtenidas para cada una de las concentraciones cumplen con los valores dados por la tabla AOAC para dichas concentraciones por lo cual los valores obtenidos en las experiencias son aceptables. Se realizó una prueba de t student bilateral para determinar si existía diferencia significativa entre el valor de % de recuperación determinado y el 10% de recuperación. Si el tcal ≤ tcrit no existirá diferencia estadísticamente significativa por lo tanto no será necesario ninguna corrección.

Tabla 6: Prueba t evaluada en exactitud del método para 1-hidroxipireno tcal

tcrit

Nivel Bajo

0,01983409

4,303

Nivel Medio

0,88261809

4,303

Nivel Alto

1,62498064

4,303

Niveles

Masa

Volumen

Preparación de estandares

Linealidad Masa T

Estándar patrón Estándar curva

MTara Linealidad

Res Volumen R

V

Calibración

MBruta

Calibración Ug/L 1OHPyr C. calibrado P. intermedia

Área P. Repetibilidad

V

Precisión Concentración de la muestra

Recuperación

CONCLUSIONES 

se validó una metodología analítica que cumple con los requisitos de la norma ISO/IEC17025, demostrándose su confiabilidad para realizar estudios de determinación de excreción urinaria de 1-hidroxipireno.



La metodología es apropiada para este análisis, mostrando un porcentaje de recuperación de 86,90-100,287%.



La precisión evaluada como repetibilidad y reproducibilidad es buena, dado que el metabolito presentó coeficientes de variación entre 4,675-8,194 los cuales están dentro del límite permitido de muestras biológicas que es ≤ 15%

BIBLIOGRAFIA

Albers, P. (1995). Handbook of Ecotoxicology: Boca Raton: Lewis Publishers. Díaz-Merchán, C. C., Urrego-Novoa, J. R., Rojas, N. Y., Rodríguez-Pulido, A. I., & Prieto-Suarez, E. (2013). Cuantificación de hidrocarburos policíclicos aromáticos urinarios en policías de tránsito del área metropolitana de Bogotá. Revista de Salud Pública, 15(2), 237-246. González Torres, H. J., Moreno Rossi, A., & Quintana Sosa, M. (2015). Genotoxiceffect of complex hydrocarbon mixtures in workers gasoline service stations. Revista Salud Uninorte, 31(1), 91-100. Mastandrea, C., Chichizola, C., Ludueña, B., Sánchez, H., Álvarez, H., & Gutiérrez, A. (2005). Hidrocarburos aromáticos policíclicos. Riesgos para la salud y marcadores biológicos. Acta bioquímica clínica latinoamericana, 39(1), 27-36. Oliveira, C. R. d. (2010). Determinação de biomarcadores e compostos organoestânicos em amostras de sedimentos superficiais de três regiões portuárias do estado de Santa Catarina, Brasil. Piñero, S., Rivero, E., Ruiz, S. G., Marrero, S., Juárez, G. R., & Arveláez, L. (2013). Niveles urinarios de 1-Hidroxipireno en trabajadores expuestos a Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos en la Industria de la Goma. Salud de los Trabajadores, 21(2), 141-149. Quijano Parra, A., Quijano Vargas, M.J. & Meléndez Gélvez, I. (2015). Cuantificación de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en el material particulado PM2.5 de una zona residencial de Pamplona, Colombia. Revista Luna Azul, 40, 85-101. Recuperado de http://lunazul.ucaldas.edu.co/index.php?option=content&task=view&id=1001.

ANEXOS

ANEXO A. Estudio de la linealidad para 1-hidroxipireno

Tabla A 1: Niveles de concentración usados para la determinación de la linealidad y rango lineal para 1-hidroxipireno Concentración (ug/L) 0,1

1

10

25

50

100

Área 5889,4567 5772,58 53589,4238 54325,0916 526013,535 527410,351 1343801,53 1343442,05 2742719,27 2740348,05 5684277,54 5652093,44

Promedio 5831,01835

53957,2577

526711,943

1343621,79

2741533,66

5668185,49

ANEXO B. Análisis curva de calibrado de 1-hidroxipireno Tabla B 1: Datos curva de calibrado de 1-hidroxipireno día 1 Día 1 Concentración (ug/L) 0,1

1

10

25

50

100

Área 3827,1867 4580,81 49913,7069 49775,9733 535652,645 539964,513 1358486,27 1362802,57 2740652,46 2746646,19 5415701,14 5411021,3

promedio 4203,99835

49844,8401

537808,579

1360644,42

2743649,32

5413361,22

Tabla B 2: Análisis de regresión lineal de 1-hidroxipireno día 1 Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple

0,99982648

Coeficiente de determinación R2

0,99965299

R2 ajustado

0,99956624

Error típico

45545,0231

Observaciones

6

ANÁLISIS DE VARIANZA Grados de

Suma de

Promedio de los

libertad

cuadrados

cuadrados

F

Regresión

1

2,3903E+13

2,3903E+13

Residuos

4

8297396511

2074349128

Total

5

2,3911E+13

Coeficientes

Error típico

Intercepción

-33128,9572

24767,9815 -1,337571946

Variable X 1

56628,7743

527,535653

Valor crítico de

11523,1361

F

4,516E-08

Estadístico t

107,3458714

6000000 y = 56629x - 33129 R² = 0.9997

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

20

40

60

80

100

Figura B 1: Curva de calibrado para 1-hidroxipireno. Día 1.

120

Residuos

50000 0

-50000

0

20

-100000

40

60

80

100

120

Variable X

Figura B 2: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno. Día 2.

Tabla B 3: Datos curva de calibrado de 1-hidroxipireno día 2 Día 2 Concentración (ug/L) 0,1

1

10

25

50

100

Área 5889,4567 5772,58 53589,4238 54325,0916 526013,535 527410,351 1343801,53 1343442,05 2742719,27 2740348,05 5684277,54 5652093,44

promedio 5831,01835

53957,2577

526711,943

1343621,79

2741533,66

5668185,49

Tabla B 4: Análisis de regresión lineal de 1-hidroxipireno día 2 Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple

0,99997409

Coeficiente de determinación R2

0,99994818

R2 ajustado

0,99993522

Error típico

16860,184

Observaciones

6

ANÁLISIS DE VARIANZA Grados de

Suma de

Promedio de

libertad

cuadrados

los cuadrados

Regresión

1

2,194E+13

2,19403E+13

Residuos

4

1137063221

284265805,3

Total

5

2,1941E+13

Coeficientes

Error típico

Valor crítico F 77182,4839

de F 1,0071E-09

Estadístico t

Intercepción

2137,34867

9168,78941

0,233111328

Variable X 1

54254,1015

195,28694

277,8173572

6000000 y = 54254x + 2137.3 R² = 0.9999

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

20

40

60

80

100

Figura B 3: Curva de calibrado para 1-hidroxipireno. Día 2.

120

Residuos

50000 0 0

20

-50000

40

60

80

100

120

Variable X

Figura B 4: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno Tabla B 5: Datos curva de calibrado de 1-hidroxipireno día 3 Día 3 Concentración (ug/L) 0,1

Área 7957,4617 8342,4153 57112,0604

1

56685,6063 552606,517

10

548273,894 1433753,86

25

1406789,08 2762631,2

50

2754103,46

100

5586642,56 5578400,71

promedio 8149,9385

56898,8334

550440,205

1420271,47

2758367,33

5582521,63

Tabla B 6: Análisis de regresión de 1-hidroxipireno día 3 Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple

0,99996409

Coeficiente de determinación R2

0,99992818

R2 ajustado

0,99991023

Error típico

20387,7556

Observaciones

6

ANÁLISIS DE VARIANZA Grados de

Suma de

Promedio de los

libertad

cuadrados

cuadrados

Regresión

1

2,3149E+13

2,31491E+13

Residuos

4

1662642321

415660580,3

Total

5

2,3151E+13

Coeficientes

Error típico

F

55692,3776

Valor crítico de F

1,9342E-09

Estadístico t

Intercepción

925,935467

11087,1292

0,083514447

Variable X 1

55728,6072

236,145845

235,9923254

6000000 y = 55729x + 925.94 R² = 0.9999

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

20

40

60

80

100

Figura B 5: Curva de calibrado de 1-hidrxipireno. Día 3.

120

Residuos

100000 0 0

-100000

20

40

60

80

100

Variable X

Figura B 6: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno. Día 3.

.

120