Monografia Anticuerpos Monoclonales Y Coproantígenos.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MONOGRAFÍA

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y COPROANTÍGENOS

CURSO

:

ESTRUCTURA Y FISIOLOGÍA CELULAR

DOCENTE

:

VÍCTOR MELÉNDEZ GUERRERO

INTEGRANTES

: GONZALES VELÁSQUEZ Grescia GARNIQUE VÁSQUEZ Estefani PUICAN TERÁN Shirley MENDOZA HUAMÁN Fátima

LAMBAYEQUE, ENERO DEL 2015.

Resumen

El presente trabajo de investigación lleva por título temático: “”ANTICUERPOS MONOCLONALES Y COPROANTÍGENOS”, que ha sido desarrollado con mucho esfuerzo y dedicación, siendo nuestro propósito el de conocer acerca del tema en general y de reconocer la importancia de dichos anticuerpos en el campo de la biología. Hemos distribuido nuestro trabajo en tres apartados que nos permitirán dilucidar un mayor y mejor conocimiento del tema, los cuales están referidos en un Primer Capítulo a los Anticuerpos Monoclonales y sus Generalidades; en el Segundo Capítulo nos referimos a los Anticuerpos Monoclonales de Primera y Segunda Generación y sus Aplicaciones Médicas; y, por último en el Tercer Capítulo nos dedicamos a los Coproantígenos. Los anticuerpos monoclonales son una poderosa herramienta para el diagnóstico de laboratorio y un instrumento cada vez más utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades. El descubrimiento y caracterización de los anticuerpos tiene una larga historia, que es la de la propia inmunología. En este trabajo monográ se hace una introducción histórica sobre la inmunidad humoral hasta el hallazgo de los anticuerpos monoclonales y se revisan conceptos relativos a la estructura y funciones de los anticuerpos, así como a la generación de diversidad, activación y maduración de los linfocitos B. Se mencionan las principales técnicas de producción de anticuerpos monoclonales y se enumeran algunas de sus aplicaciones en patología humana Los anticuerpos monoclonales son glucoproteínas especializadas que hacen parte del sistema inmune, producidas por las células B, con la capacidad de reconocer moléculas específicas (antígenos). Los anticuerpos monoclonales son herramientas 2

esenciales en el ámbito clínico y biotecnológico, y han probado ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunológicas y neoplásicas, así como también en el estudio de las interacciones patógeno-hospedero y la marcación, detección y cuantificación de diversas moléculas. Actualmente, la incorporación de las técnicas de biología molecular e ingeniería genética y proteica han permitido ampliar el horizonte de la generación de anticuerpos monoclonales y sus usos, y se han encontrado técnicas como la hibridación, la quimerización, la humanización y la producción de anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Es una de las áreas de mayor crecimiento en la industria biotecnológica y farmacéutica; en el mercado se encuentran cerca de 29 anticuerpos monoclonales aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos para uso en humanos. El reconocimiento de un componente protector (anticuerpos) en el suero de pacientes convalecientes de enfermedades infecciosas, marcó los inicios del desarrollo de la medicina preventiva. El uso de estos anticuerpos protectores como fracciones de inmunoglobulinas crudas que se unen a los antígenos representó el primer tratamiento efectivo de numerosas enfermedades infecciosas. Los anticuerpos, también denominados inmunogloblulinas (Ig), son glucoproteínas especializadas que hacen parte de la inmunidad humoral; son producidas por las células del sistema inmune llamadas células B, que tienen la capacidad de reconocer otras moléculas específicas llamadas antígenos. La respuesta inmunológica específica se desarrolla cuando un organismo ha sido expuesto a uno o varios antígenos, originando una respuesta policlonal, es decir, la producción de anticuerpos contra un rango amplio de estructuras presentes en los antígenos. Por el contrario, la respuesta monoclonal se da por la selección de un solo

clon activado de células B que produce un anticuerpo para un determinante antigénico único. Y es que desde su descubrimiento hacia finales del siglo pasado los anticuerpos han cautivado la atención de médicos, bioquímicos y científicos en el área de las biociencias y la historia recoge testimonios de ello. Por ejemplo, el primer premio Nobel otorgado en el área de Fisiología o Medicina lo recibió Emil von Behring, precisamente gracias al trabajo en el que reportó el descubrimiento de los anticuerpos. Desde entonces y hasta el presente, quince premios Nobel han sido otorgados a individuos que han hecho aportes significativos en el ámbito de la inmunología. Siete de estos fueron entregados a personas cuyo trabajo estuvo directamente relacionado con anticuerpos. Sin duda, este interés surgió de la inmensa potencialidad que, desde un inicio, les fue reconocida a estas moléculas para ser usadas en aplicaciones diagnósticas y terapéutico-profilácticas. Los anticuerpos policlonales o antisueros fueron los protagonistas en la época de la serología y la seroterapia. Los anticuerpos monoclonales de primera generación aparecieron a mediados de los años setenta para convertirse en las herramientas principales de poderosas técnicas analíticas como los radioinmunoensayos, los ensayos inmunoenzimáticos y la citometría de flujo. Más recientemente, avances importantes en el área de la biología molecular y el desarrollo de técnicas de ADN recombinante han hecho posible la creación de anticuerpos recombinantes, también llamados anticuerpos monoclonales de segunda generación. En esta revisión intentaremos resumir los hechos, conceptos y tendencias más importantes en este campo, remarcando los aspectos aplicados de mayor impacto para la biomedicina.

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ÍNDICE Resumen

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Índice

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Presentación

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Capítulo I Anticuerpos Monoclonales. Generalidades.

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Capítulo II Anticuerpos Monoclonales de Primera y Segunda Generación. Aplicaciones Biomédicas.

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Capítulo III Coproantígenos Conclusiones Referencias Bibliográficas.

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PRESENTACIÓN Ya han transcurrido 100 años desde que surgió la idea de utilizar anticuerpos como “balas mágicas” para el tratamiento de enfermedades. La tecnología crucial que hizo posible esta idea fue desarrollada por Köhler y Milstein hace 25 años, quienes describieron una metodología para producir anticuerpos monoclonales. Sin embargo, durante casi 20 años y a pesar de los grandes esfuerzos que se realizaron, sólo se han aprobado algunos productos de uso clínico basados en anticuerpos. El principal obstáculo en el camino para alcanzar esta meta ha sido la reacción inmunitaria de los pacientes contra estas moléculas. Además, se hizo evidente que moléculas tan grandes como las inmunoglobulinas no son idóneas para determinadas aplicaciones clínicas como, por ejemplo, la quimioterapia dirigida de tumores sólidos, debido a su poca capacidad de penetración. El progreso de la biología molecular y la ingeniería de anticuerpos ha hecho posible la humanización de estas moléculas en la actualidad. A mediados de la década de 1980, las primeras moléculas quiméricas —anticuerpos humanos con dominios variables murinos— permitieron reducir notablemente las respuestas humorales de anticuerpos humanos antiratón (respuesta HAMA, del inglés human anti-mouse antibody reaction). Unos años después se logró mejorar estos anticuerpos, los cuales solamente poseían de origen murino las regiones determinantes de la complementaridad (regiones CDR, del inglés complementarity determining region) del anticuerpo con su antígeno. Por consiguiente, desde 1997, se han autorizado varios anticuerpos quiméricos y humanizados como productos terapéuticos. Desde comienzos de la década de 1990, la introducción de la tecnología de presentación de péptidos y proteínas en la superficie de fagos ha tenido un impacto mayor en este campo.

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CAPÍTULO I ANTICUERPOS MONOCLONALES

1.1.

GENERALIDADES El descubrimiento y caracterización de los anticuerpos tiene una larga historia,

que es la de la propia inmunología, y se remonta a finales del siglo XIX. En esa época, los microbiólogos estudiaban los mecanismos de defensa del organismo contra los agentes microbianos, en particular contra las toxinas bacterianas. Von Behring y Kitasato sentaron en los años noventa del siglo xix las bases de la inmunidad humoral al descubrir que el suero producía sustancias que antagonizaban toxinas como la diftérica o la tetánica. Ehrlich, a finales de siglo, consolidó la idea de que las toxinas generaban antitoxinas séricas que se comportaban según las leyes de la química; las células de la sangre eran capaces de producir unas cadenas laterales que reaccionaban frente a las toxinas de manera específica como una llave con su cerradura. Por las distintas propiedades de reaccionar las antitoxinas se denominaban de varias maneras: aglutininas, opsoninas, etc. En los años treinta del siglo XX Landsteiner, el descubridor del sistema ABO, identifica todas esas funciones y las centra en una sola molécula, los anticuerpos, y al tiempo va sustituyéndose el nombre de toxina por el de antígeno. Años más tarde, este

mismo autor, junto con Pauling, desarrolla la teoría instruccionista de formación de los anticuerpos, según la cual los antígenos determinarían la conformación de los anticuerpos acomodándola a su estructura. A finales de los cuarenta se descubre el origen celular de los anticuerpos en las células B y plasmáticas. Años más tarde se describen las cadenas ligeras y se identifican las inmunoglobulinas A, D y E. Frente a la teoría instruccionista, Jerne propuso en los años cincuenta que los anticuerpos preexistían en el organismo y que la función de los antígenos sería la selección de los más adecuados. Poco después, Burnett y Talmage adelantan la teoría de la selección clonal que completa y expande las ideas de Jerne, y que presupone que cada célula B produce un solo tipo de anticuerpo con una especificidad concreta, el cual se genera por mutaciones somáticas al azar durante el proceso de maduración celular; más adelante, la exposición a los antígenos hace que esas células B proliferen. En los años sesenta se describe el concepto de idiotipo y en los setenta se acuña la teoría de las redes de idiotipos/antiidiotipos, pero la revolución en el mundo de los anticuerpos ocurre en 1975 cuando Milstein y Köhler decubren en Cambridge los anticuerpos monoclonales. En 1976 Tonegawa describe la recombinación somática de los genes de inmunoglobulinas. Desde entonces la investigación completa el conocimiento de la genética molecular de los anticuerpos y los mecanismos de generación de su diversidad.

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Un

anticuerpo

es

una

glicoproteína

perteneciente

al

grupo

de

las

gammaglobulinas, producidas por linfocitos B, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Los anticuerpos poseen cuatro cadenas polipeptídicas, idénticas dos a dos, y con diferente peso molecular(pesadas y ligeras), ensambladas entre sí mediante puentes disulfuro. Cada una de estas cadenas posee regiones con un alto grado de conservación en su secuencia aminoacídica de anticuerpo a anticuerpo (regiones constantes), a las cuales se asocian la mayoría de las funciones efectoras de la molécula, y otras regiones de secuencia menos conservada (regiones variables), por donde se produce la interacción entre el anticuerpo y el antígeno. Las regiones variables de sus cadenas ligeras y pesadas poseen hacia el extremo amino-terminal

tres segmentos hipervariables (regiones determinantes de la complementariedad, CDR) que contienen los residuos que establecen contacto con los determinantes antigénicos. El resto de la región variable se denomina marco (M), con cuatro segmentos (M1, M2, M3, M4), que acotan las tres CDR. La estructura constituida por la proyección

tridimensional de las CDR de ambas cadenas forma el sitio activo que interactúa con el antígeno. La digestión de anticuerpos con determinados enzimas (papaína) produce dos tipos de fragmentos proteicos. Uno de ellos cristaliza de forma espontánea, por lo que recibe el nombre de fragmento cristalizable o Fc, sin apenas capacidad de unión al antígeno. Este fragmento cristalizable se corresponde con la región constante del anticuerpo. El otro fragmento es el de unión al antígeno o Fab (Fragment antigenbinding, en inglés). Existen dos tipos de preparados de anticuerpos:  Policlonales, son mezclas de Ac que son los derivados de la acción de reconocimiento y activación de varios clones de linfocitos B por un antígeno. Con frecuencia se denominan antisueros.  Monoclonales, que son producidos por un único clon específico de linfocitos B, pertenecen a una clase y subclase determinadas y tienen una especificidad única frente a un antígeno determinado.

Los anticuerpos monoclonales están siendo utilizados en innumerables campos de la investigación biomédica. Así, han sido utilizados como biosensores acoplados a transductores electrónicos, tanto para la detección de moléculas orgánicas como inorgánicas (contaminación de metales pesados en alimentos y agua, detección de gases tóxicos, etc.). También se han utilizado como catalizadores de múltiples reacciones. En la clínica, uno de los usos más frecuentes ha sido el del diagnóstico,

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dada su exquisita especificidad y su capacidad prácticamente ilimitada para reconocer cualquier estructura química (por ejemplo, en citometría de flujo para la identificación de poblaciones leucocitarias y leucemias). Puede reseñarse, asimismo, su uso para la detección de trombos. Las aplicaciones terapéuticas constituyen, sin embargo, uno de los campos más interesantes de aplicación de los anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de destruir células, incluidas las tumorales, mediante distintos mecanismos. Por esta razón, son excelentes candidatos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, el cáncer o en trasplantes para evitar el rechazo. Su aplicación en el tratamiento de enfermedades infecciosas está en desarrollo.

Identificación y clonaje de genes Investigación biomédica

Identificación y aislamiento de proteínas Activación de enzimas Arquitectura molecular, morfogénesis Detección y cuantificación de hormonas, vitaminas, citocinas, factores tisulares, etc. Monitorización de drogas Enfermedades infecciosas, microbiología

Diagnóstico

Alergia Hematología Trazadores de tumores e infartos de miocardio Inmunoescintografía (=Inmunogammagrafía) Aplicaciones forenses Técnicas (ELISA, EIA, citometría, inmunohistoquímica, etc.)

Catálisis Biosensores

Enfermedades autoinmunes Terapia

Trasplantes (órganos, médula ósea) Enfermedades infecciosas (virales, bacterianas y parasitarias) Cáncer Degradación del colesterol Modulación de hormonas

Otras: Modulación de receptores Reversión de sobredosis de drogas

Ventajas frente a los antisueros policlonales  Producción ilimitada de anticuerpos muy específicos (cultivos celulares a escala industrial)  Ausencia de requerimientos de antígenos puros para obtener nuevas cantidades de anticuerpos  Facilidad de conservar los clones de hibridomas, mediante nitrógeno líquido u otras técnicas estándar de conservación.  Desventajas frente a los antisueros policlonales:  Se requieren niveles notables de tecnología y de especialización profesional  Los costes son generalmente muy elevados  El tiempo requerido en el proceso de obtención  A veces la elevada especificidad puede ser un problema y no una ventaja, tal como ocurre en determinados usos analíticos.

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Los anticuerpos monoclonales no son útiles frente a Ag polimórficos, es decir, frente a Ag que no tengan un epítopo conservado. Por otra parte, los anticuerpos monoclonales de ratón presentan un problema ya que, pese a ser perfectamente válidos para todos los usos indicados, no son útiles para su empleo en seres humanos, especialmente en terapias que requieran tratamientos prolongados, ya que el sistema inmune los identifica como cuerpos extraños 1 y reacciona para destruirlos, por lo que su eficacia terapéutica se ve claramente disminuida. Esto último es responsable de la mayoría de los efectos secundarios, tales como nefrotoxicidad, reacciones anafilácticas, etc. La alternativa sería, en este sentido, obtener anticuerpos monoclonales humanos, lo que reviste importantes problemas por razones tanto éticas como técnicas.

1.2.

ESTRUCTURA GENERAL DE LOS ANTICUERPOS

Los anticuerpos son proteínas que envuelven una estructura bioquímica compleja demarcada por la unión de cuatro cadenas proteicas: dos pesadas (CH), y dos ligeras (CL), unidas mediante puentes disulfuro (figura 1). Funcionalmente, los anticuerpos se dividen en una fracción que involucra el reconocimiento antigénico, denominada Fab, y una fracción cristalizable (Fc) que media funciones efectoras como la citotoxicidad celular que depende del anticuerpo (antibody dependant cellular cytotoxicity, ADCC) y la Figura 1 Estructura general de los anticuerpos

citotoxicidad que depende del complemento (CD).

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Inmunogenicidad impuesta por las secuencias que se conservan en Ac ratón, y no se dan en Ac de humanos.

VL: fracción variable de la cadena ligera; VH: fracción variable de la cadena pesada; CH1, CH2: dominios de la cadena pesada en los que se concentran las funciones de reconocimiento antigénico; Fab: fracción de unión antigénica; Fc: fracción cristalizable conformada por CH2, CH3 de ambas cadenas pesadas y la bisagra.

Tabla 1

Productos usados en inmunización pasiva

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Las regiones Fab están conformadas por una región variable y otra conservada. La región variable tiene una diversidad casi infinita para el reconocimiento de antígenos, gracias a las regiones determinantes de complementariedad (CDR), o regiones hipervariables; la región conservada ayuda a la estabilización de la reacción entre los segmentos CDR con el antígeno. Los anticuerpos no sólo son componentes fundamentales del sistema inmune sino que, junto con el estudio y el descubrimiento de sus funciones, han servido como herramientas biológicas útiles usadas de rutina en las áreas diagnósticas, terapéuticas y de investigación.

1.3.

APLICACIONES GENERALES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES La propiedad de los anticuerpos de unirse con alta especificidad y afinidad a una

molécula blanca permite su utilización como herramientas esenciales en investigación biomédica y clínica, las cuales han probado ser invaluables para: 1. detectar y cuantificar niveles de expresión de genes; 2. determinar la localización de la expresión de genes a nivel celular, subcelular y en los tejidos; 3. identificar las interacciones moleculares con los productos de genes, por ejemplo, la inmuno-precipitación;

4. identificación de marcadores fenotípicos únicos de un tipo celular particular; ésta es la base de la moderna clasificación de linfocitos y fagocitos monucleares; 5. inmunodiagnóstico: en el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas y sistémicas al permitir la detección de antígenos y anticuerpos específicos en la circulación o tejidos usando anticuerpos monoclonales en inmunoensayos, y como marcadores específicos para el diagnóstico por imágenes; 6. diagnóstico y tratamiento de tumores específicos: los anticuerpos monoclonales se usan en la detección de tumores mediante técnicas inmunológicas de diagnóstico y para la inmunoterapia de tumores in vivo; 7. análisis funcionales de moléculas de la superficie celular o de proteínas secretorias; 8. en la investigación inmunológica, los anticuerpos monoclonales que se unen a las moléculas de la superficie celular que puedan estimular o inhibir funciones celulares particulares, son una herramienta invaluable para definir la función de moléculas, incluidos los receptores para antígenos; 9. en el estudio de los procesos de interacción hospedero-agente infeccioso, las aplicaciones de los anticuerpos monoclonales son prácticamente ilimitadas no sólo en los estudios funcionales sino, también, en la selección de posibles blancos terapéuticos y de candidatos para vacunas o el desarrollo de anticuerpos antianticuerpos (antiidiotipos) como vacunas.

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1.4.

PRODUCCIÓN Y DESARROLLO DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES La producción de anticuerpos monoclonales se estableció con la tecnología

creada en 1975 por Georges Köhler y César Milstein, que consistía en la generación de una línea celular estable, secretora de un isotipo determinado de inmunoglobulina contra un antígeno específico, fruto de la fusión de dos células diferentes por medios físicos y químicos (polietilenglicol-centrifugación) (figura 2).

Figura 2

Producción de anticuerpos monoclonales por medio de la técnica de hibridación. La primera célula involucrada es un linfocito B de un animal previamente inmunizado con el antígeno de interés, que aporta la memoria inmune y la capacidad de producir anticuerpos contra el antígeno específico. La segunda es una célula tumoral de mieloma no secretora de anticuerpos, deficiente en la enzima hipoxantina-guaninafosforribosil transferasa (HGPRT), útil en el proceso de selección posterior de los hibridomas, que aporta su capacidad de división ilimitada (inmortalidad). De esta unión surge un tipo de célula inmortal con la capacidad virtualmente ilimitada de producción de anticuerpos monoclonales, llamada hibridoma. Dos características de la hibridación de estas células somáticas son de extremo valor: 1) es uno de los métodos básicos de producción de anticuerpos monoclonales contra un determinante antigénico conocido, y 2) se puede utilizar para identificar antígenos desconocidos presentes en una mezcla, puesto que cada hibridoma es específico para un solo determinante antigénico. En la actualidad se han incorporado técnicas de biología molecular e ingeniería genética que han ampliado el horizonte de la generación de los anticuerpos monoclonales y sus usos. Desde que se introdujo el primer anticuerpo monoclonal producido por la tecnología del hibridoma para uso clínico, en pacientes con rechazo primario de trasplantes, se observó que estos anticuerpos monoclonales, por ser de origen de ratón, generaban intensas respuestas de hiperreactividad en los pacientes. Consecuente con ello, se han desarrollado diferentes técnicas para minimizar los componentes generadores de esta respuesta. Igualmente, han permitido el desarrollo 18

de métodos in vitro de generación de anticuerpos monoclonales en bacterias mediante transgénesis con las secuencias de interés. En 1985 se crearon los primeros anticuerpos quiméricos humanos a partir de ratones, con la tecnología del ADN recombinante, en la cual los genes que codifican la región variable de las Ig de ratón se unen con genes que codifican la región constante humana para, luego, ser insertados en células de mieloma, donde producirán nuevas moléculas de anticuerpo que tendrán una parte humana pero que tienen la unión específica del antígeno (Fab) generada en ratones (figura 3). Una de las limitaciones presentadas con la quimerización de anticuerpos monoclonales de ratón es la baja frecuencia de transformantes que produzcan el anticuerpo quimérico.

Figura 3

Anticuerpo quimérico en el que se conserva la región variable de ratón de las cadenas pesadas y ligeras (VH y VL) y se une con una región constante de las cadenas humanas ligeras y pesadas. Anticuerpo humanizado en el que se conservan las regiones hipervariables o CDR (regiones determinantes de complementariedad) de ratón, unidas a una estructura humana. Aunque los anticuerpos monoclonales quiméricos son menos inmunogénicos que los anticuerpos monoclonales de ratón, se han observado respuestas importantes de tipo anticuerpo-antiquiméricos en el 40% de los productos que se han usado en humanos. En 1986 se incorporó la técnica de humanización de anticuerpos con el objetivo de minimizar los componentes del anticuerpo de ratón, generadores de la respuesta inmune. La construcción de anticuerpos monoclonales humanizados se da gracias a la ingeniería de proteínas. En este proceso se transfieren los CDR provenientes de las Ig de ratón a estructuras de las regiones variables de cadenas pesadas o ligeras de una Ig proveniente de una especie diferente, en este caso, la humana. Sin embargo, algunos estudios han reportado que esta transferencia puede generar una afinidad variable hacia el antígeno; estos tipos de anticuerpos los han hecho diferentes grupos de investigación y se han obtenido anticuerpos que mantienen la afinidad antigénica y anticuerpos que la han disminuido. Este proceso debe llevar consigo la conservación de la afinidad nativa para lo cual se ha implementado el modelo

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molecular de las regiones receptoras y donantes. Aunque la humanización de anticuerpos monoclonales ha minimizado la respuesta anti-anticuerpo humanizado, se han reportado respuestas exageradas con el 9% de los productos que se han usado.

1.5.

GENERACIÓN

DE

ANTICUERPOS

MONOCLONALES

TOTALMENTE

HUMANOS Mientras que la producción de anticuerpos monoclonales de ratón se lleva a cabo rutinariamente por la tecnología del hibridoma, la producción de anticuerpos monoclonales humanos por esta tecnología ha sido difícil, debido a que los hibridomas humanos y las líneas celulares derivadas de mieloma múltiple han sido difíciles de desarrollar, y la inmunización in vivo de humanos no es factible para muchos antígenos. Sin embargo, varias técnicas hacen posible la generación de anticuerpos monoclonales humanos como la expresión de fragmentos de Ig como los fracciones variables de cadena única, Fab y ScFv, en bacterias, gracias a las bibliotecas de bacteriófagos que tienen insertado dentro de su ADN tales genes (figura 4). Actualmente, la tecnología del fago es una de las más utilizadas y bien establecidas para el desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales humanos. La construcción de anticuerpos monoclonales recombinantes mediante la tecnología de bibliotecas de fagos con genes que codifican las regiones variables de Ig, ha probado ser útil en la investigación básica y en usos clínicos; es una de las estrategias mejor establecidas y optimizadas.

Las regiones ScFv son las candidatas usadas en esta tecnología, por contener los dominios de unión antigénica de las Ig. Estas construcciones de bibliotecas de genes proveen, entonces, unos repertorios de anticuerpos con alta afinidad para un amplio número de antígenos, lo cual está determinado por el tamaño de la biblioteca y alcanza tamaños de 6,7 x 109, los cuales pueden ser usados en laboratorios de biología molecular.

1.6.

ANTICUERPOS HUMANOS GENERADOS EN RATONES TRANSGÉNICOS

Un enfoque radicalmente diferente para abordar el problema de la humanización de los anticuerpos, es la generación de hibridomas de ratón que produzcan anticuerpos totalmente humanos. Para este propósito, las Ig nativas procedentes de ratones transgénicos, a los cuales se les han reemplazado los genes de las regiones variables por humanas, en las que los ratones llevan a cabo la recombinación de los genes VDJ que son los responsables de la codificación y ensamblaje de las Ig; estos anticuerpos producidos tienen una alta afinidad con secuencias terminales humanas (Figura 4).

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Figura 4

Construcción de una biblioteca de fagos para la generación de anticuerpos monoclonales

A: se generan bibliotecas de los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras a partir de un repertorio de células B que no han sido reclutadas por el sistema inmune por medio de técnicas de biología molecular, como el PRC, utilizando cebadores inespecíficos. B: se cortan estas secuencias por medio de enzimas de restricción y se unen por medio de PRC dando como resultado un repertorio de secuencias de genes que codifican fracciones variables de cadena simple (ScFv). C: estos genes de ScFv se pegan a la secuencia genética de un bacteriófago para ser expresados junto con una proteína de superficie para, luego, hacer la selección de los bacteriófagos que presenten mayor afinidad por el antígeno a estudio y, luego, transfectarlos a bacterias para amplificarlos y producir las ScFv.

Por otra parte, también se han construido cromosomas artificiales de levadura (YAC) que albergan fragmentos grandes de los genes de Ig de ambas cadenas pesadas y livianas humanas, los cuales se introducen en una línea germinal de ratones para crear cepas de ratones capaces de producir anticuerpos específicos totalmente humanos, generando ratones con la capacidad de producir anticuerpos similares a los humanos, incluidos los procesos de reorganización genética, ensamblaje y diversidad nucleotídica. El contar con ratones que produzcan anticuerpos totalmente humanos es una herramienta invaluable dentro de la terapéutica y el uso clínico de los anticuerpos monoclonales debido a que la preparación de anticuerpos monoclonales de ratón es un procedimiento que está bien establecido y ampliamente usado.

1.7.

APLICACIONES CLÍNICAS DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

Actualmente, la terapia con anticuerpos monoclonales representa el área de crecimiento más grande de la industria farmacéutica. En 2003 y 2004, este desarrollo alcanzó 48% de incremento. Dentro del uso clínico se han aprobado cerca de 29 anticuerpos monoclonales para uso terapéutico o diagnóstico por la FDA (tabla 2) y cerca de 150 en estudios clínicos. En los últimos años en el mercado de los anticuerpos monoclonales se triplicó su valor de US $10,3 billones a US $30,3 billones.

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Tabla 2

Anticuerpos monoclonales aprobados para uso terapéutico

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Los productos oncológicos seguirán dominando el mercado; sin embargo, se pronostica que los productos aplicados para trastornos inmunológicos, inflamatorios y artritis alcancen un gran porcentaje del mercado de los anticuerpos monoclonales. Cuando un anticuerpo es diseñado como medicamento, todas sus diferentes características, incluidas inmunogenicidad, afinidad, estabilidad, función efectora, vida media, penetración del tejido y distribución, deben ser tomadas en consideración y optimizadas. El primer anticuerpo monoclonal empleado con fines terapéuticos fue autorizado en Estados Unidos en junio de 1986 para la prevención del rechazo en los trasplantes de riñón (Muromonab Orthoclonne OKT3®). Otro anticuerpo monoclonal, el nebacumab (CentoxinÒ), inactiva selectivamente la fracción lipídica de la endotoxina presente en la membrana exterior de las bacterias Gram negativas; fue retirado en 1993 debido a la detección de un exceso de mortalidad en los pacientes tratados. Los anticuerpos antimelanoma (Tecnemab K1®) son fragmentos de anticuerpos antimelanoma 225.28S combinados con tecnecio radiactivo (Tc 99) para formar un radiofármaco de uso en el diagnóstico para la detección de tumores. Concretamente, se usa como coadyuvante junto con otros procedimientos diagnósticos para la visualización mediante inmunogammagrafía y ayuda en el diagnóstico diferencial en caso de sospecha de melanoma ocular; en el 2000 fue retirado del mercado por la Comisión Médica Europea de Procedimientos.

El igovomab (Indimacis 125®) es un fragmento de anticuerpo (Fab) IgG monoclonal de ratón, específico para el antígeno CA-125, presente en algunos cánceres de ovario. Al ser marcado con indio radioactivo (In 111), permite la detección por inmunogammagrafía de recaídas de adenocarcinomas ováricos. En 1999 fue retirado del mercado. El votumonab (Humaspect®) es un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra los antígenos asociados a células tumorales positivas para la citoqueratina del adenocarcinoma humano de colon, agente de diagnóstico por imagen. Nunca fue comercializado.

1.8.

ANTICUERPOS MONOCLONALES EN LISTA DE ESPERA PARA USO CLÍNICO Natalizumab: es un anticuerpo monoclonal recombinante IgG4 dirigido contra la

integrina alfa 4; ha demostrado su eficacia en las recaídas en pacientes con esclerosis múltiple y enfermedad de Crohn. Los datos preliminares muestran beneficios en la colitis ulcerativa. Para determinar su papel en la terapéutica en necesario compararlo con otras modalidades existentes. Nerelimomab: ha demostrado tener algunos beneficios en el tratamiento del choque séptico; sin embargo, los datos clínicos son conflictivos, y dificultan la valoración de su eficacia. También ha sido evaluado en artritis reumatoide, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn.

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Oregovomab: es un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce el antígeno CA125 asociado a tumores de ovario; algunos estudios sugieren que la respuesta inmune inducida por el oregovomab es capaz de incrementar el tiempo de recaída en pacientes con carcinoma avanzado de ovario. Junto con el tenecio 99, en algunos estudios ha sido usado con éxito en radioinmunogammagrafía para el cáncer de ovario. Priliximab: es un anticuerpo monoclonal intravenoso que induce una significante y prolongada supresión de las células CD4 circulantes. Su eficacia se ha observado en la micosis fungoide, así como en la profilaxis del rechazo en el trasplante de corazón (combinada con terapia inmunosupresora). En un estudio controlado, el priliximab fue inefectivo en la esclerosis múltiple. Afelimomab: es un anticuerpo monoclonal que está en investigación para el tratamiento de la sepsis y el choque séptico. Sin embargo, los datos clínicos han sido limitados lo cual imposibilita la valoración de su eficacia. Apolizumab: es un anticuerpo monoclonal (Hu1D10) contra el antígeno leucocitario humano HLADR; está indicado en pacientes con recaídas con linfomas no Hodgkin, especialmente en pacientes con linfoma folicular. Bectumomab: unido al tecnecio 99 (Tc99m LL2 Fab), es un agente usado en imágenes para linfomas no Hodgkin y está indicado como un ayudante para el diagnóstico junto con las técnicas convencionales, en particular, en la estadificación de estos pacientes. Algunos datos limitados sugieren los beneficios del bectumomab marcado con I131 en el tratamiento de linfomas no Hodgkin.

Edrecolomab: es un anticuerpo monoclonal indicado como terapia ayudante en el posoperatorio del carcinoma colorrectal. Enlimomab: es un anticuerpo monoclonal que se une a la ICAM-1 pudiendo inhibir la adhesión de los neutrófilos al endotelio vascular. Algunos datos limitados sugieren mejoría de los pacientes receptores de trasplante renal. Otros potenciales usos incluyen la artritis reumatoide y el trasplante hepático. Felvizumab: es un anticuerpo monoclonal para el tratamiento y la prevención en niños de la infección grave por el virus sincitial respiratorio. Inolimomab: según datos preliminares, ha demostrado ser promisorio en la prevención y el tratamiento del rechazo de trasplantes.

1.9.

PERSPECTIVAS Debido al creciente interés que existe en dilucidar el papel de la variedad de

proteínas existentes en la superficie de muchos parásitos, virus y bacterias, los anticuerpos monoclonales se han utilizado para investigar el papel de la citoxicidad dependiente de anticuerpos para el control de las infecciones por estos agentes y, también, dilucidar la importancia de estas proteínas en la invasión y la proliferación celular. Nos encontramos dentro de una revolución y somos testigos de sus avances con el pasar del tiempo; recientemente, Abraham Karpas, Allan Dremuchervan y Barbara

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Zepulkowski, del Departamento de Hematología de la Universidad de Cambrigde, lograron el establecimiento de una línea celular estable de mieloma humano, lo que ha ampliado mucho más el horizonte terapéutico de los anticuerpos monoclonales al permitir la generación de un sinnúmero de anticuerpos monoclonales humanos, y ya se están dando los primeros pasos en el desarrollo de nanoanticuerpos (la partícula más pequeña de un anticuerpo natural, capaz de reconocer un antígeno) en el campo de la terapéutica contra el cáncer por Virna Cortez-Retamozo y colaboradores en el Instituto Interuniversitario para la Biotecnología en Bélgica. Se espera una oleada de anticuerpos totalmente humanos a partir del 2007. El impacto científico y tecnológico que han tenido los nuevos descubrimientos y su incidencia en el progreso científico o en el desarrollo tecnológico, han servido de base para el mejoramiento de aplicaciones tecnológicas a la solución de problemas sociales. El desarrollo de los anticuerpos monoclonales y la producción de vacunas, entre otros, han dado lugar a un gran número de patentes que, actualmente, están autorizados y comercializados para el beneficio de la sociedad.

CAPÍTULO II ANTICUERPOS MONOCLONALES DE PRIMERA Y SEGUNDA GENERACION. APLICACIONES BIOMEDICAS.

2.1. NOCIONES BASICAS En el ámbito de la respuesta inmune específica de los organismos vertebrados, las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos (Ac) juegan un papel central. Estas moléculas tienen la habilidad de reconocer específicamente y mediar la eliminación de sustancias y organismos extraños, tales como toxinas bacterianas y virus. Ello lo logran gracias a que, una vez que ligan el antígeno (Ag), los Ac interactúan con receptores presentes en ciertas poblaciones celulares y con moléculas del sistema de complemento, conduciendo a la activación de mecanismos efectores que finalmente son los responsables de la mencionada eliminación. 1

2.2. CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES Los Ac son glicoproteínas solubles, sintetizadas y secretadas de manera exclusiva por un tipo particular de glóbulo blanco denominado linfocito B. Moléculas de Ac han sido encontradas virtualmente en todos los fluidos y cavidades corporales. En mamíferos se han descrito cinco clases de Ig a saber Ig M, G, A, D y E. Cada una de 1

Montaño, R. (1995). Anticuerpos monoclonales de primera y segunda generación. Aplicaciones biomédicas.

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ellas posee, además de un metabolismo y fisiologías características, rasgos estructurales y funcionales particulares. Sin embargo, todas comparten una estructura básica común que bien puede ser ejemplificada por la molécula IgG. Básicamente, la molécula de Ac consta de dos tipos de cadenas polipeptídicas denominadas cadena liviana/ligera y cadena pesada, con pesos moleculares aparentes de unos 25 y 50 kD, respectivamente. Se han identificado dos tipos de cadena liviana, kappa (κ) y lambda (λ), y cinco clases de cadena pesada, mu (µ), gamma (γ), alfa (α), delta (δ) y epsilon (ε). Cada monómero de Ig, independientemente de la clase, consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas livianas igualmente idénticas. Las cadenas pesadas establecen abundantes interacciones no covalentes y cierto número de enlaces covalentes (del tipo puente disulfuro) entre sí y con las cadenas livianas. La característica bioquímica estructural más resaltante de las cadenas Ig es el “dominio Ig”. Muy resumidamente, un dominio Ig es una secuencia polipeptídica de unos 100-110 aminoácidos que presenta de manera muy conservada dos residuos de cisteína, localizados hacia los extremos opuestos de la secuencia. Estos residuos permiten la formación de un puente disulfuro intracatenario importante para la estabilización de la estructura terciaria del dominio y, consecuentemente, de la molécula. La distribución de aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos en la secuencia primaria del dominio trae como resultado la formación de lo que en bioquímica de proteínas se conoce con el nombre de hojas plegadas tipo β. Estas hojas β se organizan en forma antiparalela, se unen mediante segmentos relativamente cortos de

secuencia llamados asas o “loops” en los que es usual encontrar la conformación tipo hélice α, y se arreglan a nivel tridimensional para formar un par de láminas. Estudios comparativos de la secuencia primaria de aminoácidos en un número importante de moléculas de Ac han permitido la identificación de dos tipos de dominio en las cadenas Ig, el dominio variable (V) y el dominio constante (C). Esta denominación obedece a la variabilidad encontrada en cada posición de la secuencia primaria. Tanto la cadena liviana como la pesada poseen un dominio variable designados VL y VH, respectivamente. La cadena liviana posee un único dominio constante (CL) mientras la cadena pesada posee tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3, CH4), dependiendo de la clase de Ig. El dominio Ig tiene implicaciones importantes para la funcionalidad de la molécula de Ac. Por ejemplo, los dominios V L y VH se conjugan en un módulo funcional denominado Fv, en el cual se encuentra el sitio de reconocimiento del antígeno o paratopo. Mediante la comparación de secuencias de aminoácidos disponibles para numerosos dominios VL y VH ha sido posible identificar tres sitios en cada dominio V, a los que se ha llamado regiones hipervariables, en los que la variabilidad en la secuencia primaria de aminoácidos alcanza un máximo. Estas regiones contienen los residuos principales que conforman el paratopo y por ello también se les conoce con el nombre de regiones determinantes de complementariedad (RDC). Las RDC corresponden a las asas o “loops” de los dominios V y se encuentran flanqueadas por regiones de menor variabilidad designadas marco (M).

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El dominio Ig ha sido explotado más allá del ámbito de los Ac, de manera que hoy se acepta la existencia de una superfamilia de proteínas que contienen en su estructura dominios Ig, Entre estas proteínas se cuentan, además de los Ac, el receptor antigénico de linfocitos T, las moléculas del sistema mayor de histocompatibilidad, receptores para el fragmento Fc de las Ig, moléculas de adhesión intercelular, etc.

2.3. GENÉTICA Y REPERTORIO DE INMUNOGLOBULINAS. Los genes que codifican las Ig están organizados en complejos genéticos. Existe un complejo genético en el que se encuentran los elementos codificantes de todas las cadenas pesadas (complejo H), y dos complejos para las cadenas livianas, uno para la cadena κ (complejo κ) y otro para la cadena λ (complejo λ). El complejo H se encuentra localizado en la región telomérica del cromosoma 14 humano y está formado por un número variable de elementos codificantes denominados V H, DH, JH, hH y CH . En forma similar, los complejos κ y λ contienen elementos VL, JL, y CL, pero no poseen segmentos D ni h, y están ubicados en los cromosomas 2 y 22 humanos, respectivamente. Cada complejo posee un número significativo de elementos V y, en menor cuantía, elementos D (complejo H) y J. Los elementos codificantes h y C constituyen exones completos que contienen la información estructural para la síntesis de la región bisagra (cadena pesada) y de los diferentes dominios constantes, respectivamente.

Por otro lado, los dominios V son producidos a partir de la combinación de los elementos V, D, y J. Durante la ontogenia del linfocito B estos complejos génicos sufren un interesante proceso de reordenamiento o rearreglo cuyos detalles mecanísticos no han sido del todo entendidos. Un sofisticado sistema de recombinación somática actúa sobre los elementos V, D y J, permitiendo en cada linfocito B el rearreglo funcional de un segmento V L con un segmento JL, para así generar un exón VL que codifica el dominio V L de la cadena liviana. Algo similar ocurre con los segmentos VH, DH, y JH del complejo H. Luego de que, en un linfocito B particular, ocurre el rearreglo funcional de estos segmentos y se genera un exón V L y uno VH, el proceso se detiene de manera que cada linfocito B despliega una única especificidad y es capaz de secretar, luego de la estimulación antigénica, únicamente Ac con esa especificidad. En humanos, se ha estimado que el proceso de rearreglo génico de los segmentos V, D, y J, en el cual se ven además involucrados fenómenos de adición de nuevos nucleótidos e inversión y uso simultáneo de varios segmentos D, tiene la potencialidad de generar 10 4 dominios VL y 108 dominios VH diferentes, que pueden combinarse aleatoriamente para generar hasta 1012 moléculas de anticuerpo con especificidades diferentes. Este gigantesco repertorio permite al sistema inmune humoral disponer de la capacidad para reconocer y responder prácticamente ante cualquier reto antigénico.

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2.4. ANTICUERPOS MONOCLONALES DE PRIMERA GENERACION Los anticuerpos policlonales o antisueros son poblaciones complejas de Ac, formadas por distintas clases de Ig en las que está presente una variedad de especificidades. Por el contrario, el término anticuerpo monoclonal (AcMo) se usa para referirse a una población de moléculas de Ac que son todas idénticas y que, consecuentemente, poseen todas la misma especificidad. De lo anterior se desprende que en una prueba analítica el chance de obtener falsos positivos, es decir, “reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho menor cuando se usan reactivos monoclonales. En 1975, en un trabajo que posteriormente les valió el premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein demostraron que es posible producir AcMo mediante la fusión de linfocitos B con células mielomatosas (células tumorales inmortales). Ellos demostraron que los híbridos resultantes de tal fusión heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que además es posible aislar del producto heterogéneo de fusión aquellos híbridos secretores del anticuerpo en el que se está interesado. Así nacieron los AcMo que, posteriormente, han sido denominados de primera generación, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante técnicas de biología molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generación.

La técnica original descrita por Kohler y Milstein permite la obtención de AcMo de ratón. De manera resumida, el proceso se inicia con la inmunización de ratones de laboratorio (cepa Balb/c) con el antígeno para el cual se desea producir los anticuerpos. Una vez que se tiene la certeza del status inmune de estos animales (por lo general esto se establece tomando muestras de sangre y examinando y/o cuantificando la presencia de anticuerpos específicos en el suero inmune), los mismos son sacrificados y se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una población numerosa de linfocitos B. A continuación, los esplenocitos se fusionan con células mielomatosas inmortales que son mantenidas en el laboratorio en la forma de líneas celulares gracias a su capacidad para crecer indefinidamente en cultivo. La fusión, fenómeno poco común en células somáticas, es facilitada mediante la adición de agentes virales (virus Sendai), químicos (polietilenglicol) o físicos (electricidad), de los cuales el más usado es la sustancia química denominada polietilenglicol (PEG). El producto de la fusión entre un esplenocito y una célula mielomatosa es denominado hibridoma. Los hibridomas heredan características fenotípicas de ambas células parentales de manera tal que son capaces de crecer indefinidamente y de producir el anticuerpo codificado en los genes del esplenocito pariente. Obviamente, la población de hibridomas que se obtiene mediante una fusión como la descrita anteriormente es heterogénea en cuanto a los anticuerpos que secreta. Con el objeto de seleccionar los híbridos productores del anticuerpo de interés se realiza clonación celular.

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Esta clonación consiste en sembrar los hibridomas en microcultivos a una densidad celular tan baja que se garantiza que las células integrantes de la población obtenida en cada microcultivo sean todas idénticas, es decir conformen un clon. Los anticuerpos secretados por estas poblaciones clonales de hibridomas son anticuerpos monoclonales. Utilizando un principio similar al antes descrito se han preparado reactivos

monoclonales

provenientes

de

otras

especies,

inclusive

humanos.

Numerosas revisiones han sido publicadas en las que se examina la producción y uso de estos reactivos. Ahora bien, además de su altísima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que han contribuido al éxito de los AcMo como reactivos analíticos. En primer lugar, los AcMo son sustancias químicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle, y ello permite la formulación de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para su conjugación a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioisótopos, oro coloidal, moléculas electrón-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas, y en grandes cantidades. En lo concerniente a aplicaciones biomédicas, los AcMo de primera generación han desplazado de muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de numerosas y nuevas pruebas diagnósticas y son en la actualidad los reactivos de elección para aplicaciones analíticas, tanto en el ámbito de lo médicoclínico como en distintas áreas de la investigación en biociencias. Lo anterior

es cierto para todo aquello que tiene que ver con pruebas de laboratorio “in vitro”, tanto en clínica como en investigación. Por razones de espacio, mencionaremos solo algunos ejemplos de AcMo de primera generación que han encontrado aplicaciones de interés en biomedicina, no sin antes advertir que se trata de una muestra pequeña tomada de un universo mucho más amplio y, por tanto, imposible de cubrir en su totalidad en el presente contexto. Comenzaré por mencionar las numerosas pruebas diagnósticas para fenotipificación de tumores sanguíneos que actualmente hacen uso de AcMo de primera generación. A pesar de que algunas de estas enfermedades pueden diagnosticarse claramente mediante criterios clínicos e histológicos bien establecidos, hay otros casos como las leucemias linfoblásticas agudas y los linfomas del tipo no-Hodgkin en los que es imprescindible la inmunofenotipificación para el establecimiento inequívoco del diagnóstico, la clasificación, la prognosis y el tratamiento. La forma rutinaria que toman estas pruebas de tipificación es la citometría de flujo con paneles de AcMo fluorescentes. Estos Ac fluorescentes reconocen moléculas marcadoras de las poblaciones sanguíneas en estudio y las tiñen permitiendo su identificación diferencial por medios electrónicos. Otro ejemplo ilustrativo lo constituyen los AcMo con especificidad por la molécula CD4, la cual se expresa en la superficie de un subset de linfocitos T humanos. Uno de los mejores indicadores de la progresión de la infección por el virus HIV hacia la aparición del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en los pacientes infectados, es precisamente una caída sustancial en el número de linfocitos

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T circulantes en la sangre que portan este marcador de superficie CD4. La prueba de rutina empleada para la estimación del número de linfocitos T CD4+ utiliza AcMo fluorescentes anti-CD4 humano para teñir y luego examinar por citometría de flujo o en el microscopio de fluorescencia las muestras de sangre de los individuos seropositivos. La tipificación de grupos sanguíneos humanos como el ABO, de crucial importancia en transfusiones y transplantes, se realiza en la actualidad mediante pruebas de aglutinación en las que se utilizan AcMo. Pero los AcMo no han servido únicamente para el estudio de moléculas asociadas a la superficie de células. Existe además un sinnúmero de moléculas solubles cuya detección en fluidos biológicos (sangre, orina, etc.) es de interés médicoclínico. Algunos ejemplos son drogas o metabolitos de drogas como la marihuana, la cocaína, la ciclosporina, hormonas como la hCG (test

de embarazo), proteínas

asociadas a ciertos tipos de cáncer como el PSA (cáncer de prostata) y el CEA (adenocarcinoma de colon), o proteínas indicadoras de infecciones por virus como Hepatitis B y CMV. En la actualidad los tests para la detección y/o cuantificación de estas moléculas utilizan AcMo y en su mayoría toman la forma de inmunoensayos en los que una enzima (ELISA), un radioisótopo (RIA) o un colorante (“dipstick”) sirven como medio de detección. Virtualmente todos los ejemplos de AcMo referidos se han obtenido mediante la generación de hibridomas de origen múrido (ratón o rata). Por desgracia, el uso de este tipo de AcMo con intenciones profilácticas o terapéuticas en humanos ha encontrado obstáculos importantes. El primero de ellos es que se trata de proteínas

extrañas para el ser humano. Consecuentemente, su administración conduce a la aparición de una respuesta inmune humana anti-AcMo, que obstaculiza la eficacia del tratamiento. Además, la mediación de funciones efectoras necesarias o deseables en ciertas situaciones, y el catabolismo de estos anticuerpos de ratón o rata en el cuerpo humano, es diferente al de los correspondientes anticuerpos humanos. Por último, hay moléculas

humanas,

como

los

aloantígenos

del

complejo

principal

de

histocompatibilidad y los antígenos del sistema sanguíneo Rh, que no son distinguidos apropiadamente por el sistema inmune de los roedores y, en consecuencia, no es posible producir AcMo que sean de utilidad práctica con especificidad por estos antígenos. De esta manera, una de las razones más importantes que ha impulsado el desarrollo de los AcMo de segunda generación es precisamente esta imposibilidad de utilizar Ac de roedores en humanos con fines profilácticos o terapéuticos.

2.5. ANTICUERPOS MONOCLONALES DE SEGUNDA GENERACIÓN Como se mencionó, los AcMo de segunda generación o anticuerpos recombinantes (AcR) son moléculas producidas empleando técnicas de biología molecular y ADN recombinante. Dicho de otra manera, los AcR son generados a través de la inmortalización de los genes que codifican a la molécula de Ig, en lugar de inmortalizar la célula productora del Ac como es el caso para los AcMo de primera generación.

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La concepción, el diseño y la ingeniería de moléculas artificiales basadas en Ig se ha facilitado enormemente gracias a dos características de estas proteínas. A nivel genético, los genes estructurales que codifican las Ig se prestan para hacer el trabajo de biología molecular. Estos genes se organizan en la forma de exones discretos, que corresponden a dominios completos en la proteína y que se encuentran separados por regiones intrónicas. Resulta así, por ejemplo, relativamente fácil manipular las secuencias intrónicas para añadir cambios que permitan la introducción en el gen de nuevas secuencias en lugares específicos seleccionados previamente, sin que ello implique riesgo alguno de alterar la secuencia codificadora presente en los exones. De igual manera, a nivel proteico la organización estructural-funcional de las Ig en la forma de estos módulos discretos llamados dominios en los que se encuentra almacenada la información necesaria para realizar una función específica, ha facilitado enormemente el logro de estos objetivos. Sin embargo, un elemento adicional que no se puede dejar de mencionar y que ha tenido un impacto tremendo en el desarrollo de los AcR lo constituyen, sin lugar a dudas, los avances que han ocurrido en el campo de la biología molecular, especialmente en lo relacionado con el desarrollo de métodos para la creación de moléculas de ADN recombinante basados en la reacción en cadena de polimerasa (PCR). De esta forma, es hoy posible clonar una pareja de regiones V H y VL responsables de una especificidad de interés y ensamblarla en la forma de un anticuerpo funcional en el contexto de prácticamente cualquier clase o subclase de Ig humana). Un número considerable de sistemas de expresión están actualmente

disponibles para este fin. Varias líneas celulares eucariotas soportan apropiadamente los procesos asociados a la expresión, síntesis, ensamblaje y modificaciones posttraducción de los AcR. En el ámbito de los organismos procariotas, es digno de mencionar como el conocimiento detallado que poseemos del genoma, arquitectura y ciclo de vida de bacteriófagos filamentosos y del fago lambda ha permitido la expresión eficiente de ADN codificante de Ac en E. coli. Los AcR constituyen entonces un conjunto bastante heterogéneo de proteínas artificiales en el que se pueden distinguir dos grandes grupos. El primero incluye moléculas completas de Ac, similares a las que se consiguen en forma natural, en las que están presentes los dos elementos estructurales que permiten la funcionalidad de la molécula, esto es las porciones Fab y Fc. Los Ac quiméricos y humanizados son ejemplos representativos de este grupo. El otro grupo está formado por un conjunto más heterogéneo de proteínas noveles, basadas en la estructura de las Ig. Estas pueden encontrarse en la forma de entidades recombinantes autónomas (fragmentos tipo Fab, Fv de cadena sencilla -scFv-, “diabodies”, “triabodies”, etc.), o como proteínas de fusión (moléculas en las que se combina la porción Fc o Fab con propiedades nuevas provistas por una toxina, una enzima, un receptor celular, una citoquina, etc.).

2.6. ANTICUERPOS QUIMÉRICOS Un anticuerpo quimérico (AcQ) es una molécula artificial en la que las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones

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variables VH y VL son obtenidas de un AcMo múrido. El objetivo que se persigue con la construcción de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratón o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Es conocido que las porciones más inmunogénicas de la molécula de Ig están asociadas a la porción constante de la molécula, en particular a la región Fc. Al reemplazar estas regiones por las equivalentes de origen humano se busca que la molécula resultante sea menos “extraña” para los seres humanos y así facilitar su uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas. Adicionalmente, ya que la fisiología, catabolismo y las funciones efectoras de un Ac están asociadas al fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en forma óptima al ser administrados en humanos. La técnica de “quimerización” fue desarrollada por Morrison y col. y Boulliane a mediados de los años 80. El procedimiento implica la clonación de los genes V H y VL múridos y la inserción de los genes clonados en vectores de expresión eucariota a los que previamente se ha incorporado los genes codificadores de la porción constante de las cadenas pesada y liviana humanas. Estos vectores son finalmente transfectados en forma estable en una línea celular seleccionada. La clonación de los genes V H y VL se realiza mediante RT-PCR utilizando como molde ARN total o ARN mensajero (ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad de interés y oligonucleótidos complementarios a los extremos 3’ y 5’ de cada gen como iniciadores.

En la actualidad se encuentran disponibles familias de oligonucleótidos para la clonación de los genes V H y VL del ratón, del humano y otras especies. Estas familias son capaces de amplificar la mayoría, sino la totalidad, de los genes V funcionales de estas especies y, usualmente, contienen sitios de reconocimiento para enzimas de restricción que facilitan la identificación, manipulación e inserción en los vectores de expresión de los genes V amplificados por PCR (Montaño y Morrison). Una serie de vectores tipo “cassette” están disponibles donde los genes V pueden ser fácilmente clonados en el contexto de cualquier isotipo de cadena liviana y pesada humana. De forma similar, avances en el campo de la tecnología de transferencia de genes también han facilitado y hecho más eficiente el proceso de inserción de ADN foráneo en diferentes líneas celulares eucariotas.

2.7. ANTICUERPOS HUMANIZADOS En los AcQ las regiones V múridas se mantienen inalteradas de forma que la especificidad y la afinidad de la molécula resultante no se afectan. Desgraciadamente, algunas moléculas quiméricas aún son capaces de inducir una respuesta inmune humoral cuando son administradas en humanos. Esta inmunogenicidad “residual” ha sido atribuida a la presencia de epitopos foráneos presentes en las RDC y en las regiones M de los dominios V múridos del AcQ. Un paso adelante en los esfuerzos para reducir la inmunogenicidad de los AcMo múridos lo constituyó la creación de los Ac humanizados (AcH). La tecnología para la

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producción de AcH fue desarrollada en el laboratorio de G. Winter en Inglaterra poco después de la invención de los AcQ y en la actualidad engloba un conjunto de procedimientos tales como “CDR grafting” (transplante de CDR), “Ab reshaping” y “Ab resurfacing/veneering”. El argumento que la soporta se basa en el supuesto de que el sitio de combinación al antígeno, el paratopo, se forma a partir de la combinación espacial de las asas hipervariables que corresponden a las RDC, mientras que las regiones M solo funcionan como un andamio cuya única función es servir de soporte estructural al paratopo. Asumiendo esto como cierto, en la elaboración de un AcH las RDC de un anticuerpo múrido son transplantados en el contexto de regiones M humanas, formándose así una región V híbrida ratón-humano y confiriéndole la especificidad deseada a una molécula que en el resto de su estructura es completamente humana. La ventaja que esto tiene es que los epitopos asociados a las regiones M múridas, los cuales están presentes en los AcQ, no se encuentran en los AcH. Para producir un AcH es necesario conocer la secuencia entera de los dominios V múridos y la localización de las secuencias de ADN que corresponden a las 3 RDC múridas. Esta información se usa para diseñar y crear genes V sintéticos en los que las RDC

múridas

son

combinadas

con

regiones

M

humanas

seleccionadas

cuidadosamente en función de su parecido con las correspondientes regiones M múridas. A continuación los genes V “humanizados” se insertan en vectores de expresión adecuados que contienen el resto de la información estructural necesaria

para la síntesis de una cadena Ig humana liviana o pesada. El resto de la técnica es similar a lo ya descrito para los AcQ.

2.8. CONSIDERACIONES FINALES Los AcMo de primera generación “llegaron para quedarse”. En el ámbito biomédico estos reactivos abarcan la mayoría de las aplicaciones analíticas en las que se desea detectar moléculas ya sea en forma soluble, o asociadas a la superficie celular o en forma intracelular y ello se ha traducido en un mayor y mejor diagnóstico de distintas enfermedades. Toda la tecnología asociada a su producción constituye hoy en día un conjunto de procedimientos estándar, y numerosas compañías en Norteamérica y Europa se dedican casi de manera exclusiva a producir y comercializar AcMo de primera generación. En ellas el desarrollo de nuevos productos es permanente. Por otra parte, las expectativas creadas alrededor de los AcR son considerables. Este es un campo que está en constante progreso e innovación. Se espera que estas moléculas sean capaces de llenar el vacío dejado por los AcMo de primera generación en lo concerniente al desarrollo de herramientas efectivas para el diagnóstico in vivo, profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas. Una muestra de ello es que para el año 1998 más de 30% de las proteínas en proceso de ensayos clínicos fueron AcR. Aunque el uso de moléculas basadas en AcR en el ámbito médico/industrial es aún

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incipiente, numerosas aplicaciones potenciales son evaluadas en la actualidad tanto en centros académicos como en compañías de biotecnología. Viendo un poco más hacia el futuro, nuevas tecnologías asociadas a la generación de Ac se están desarrollando y afinando. Ejemplo de ello son los ratones transgénicos humanizados o “xenomouse”, la producción de Ac con aplicación médica en animales transgénicos como la vaca), el sistema “Trimera”, las técnicas de desplegamiento de Ac en ribosoma “ribosome display” y la así llamada ingeniería de parches “patch engineering”. Es de esta manera muy probable que más pronto que tarde seamos testigos de la aparición en nuestras vidas de un nuevo conjunto de herramientas terapéutico profilácticas con una altísima versatilidad, basadas en moléculas de Ac, que puedan ser utilizadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y otras patologías humanas.

CAPÍTULO III COPROANTÍGENOS

Un antígeno es cualquier sustancia que provoca que el sistema inmunitario produzca anticuerpos contra sí mismo. Un antígeno puede ser una sustancia extraña proveniente del ambiente, como químicos, bacterias, virus o polen. También se puede formar dentro del cuerpo, como con las toxinas bacterianas o las células tisulares. Un antígeno ("anti", del griego αντι- que significa 'opuesto' o 'con propiedades contrarias' y "geno", de la raíz griega γεν, generar, producir; que genera o crea oposición) es una sustancia que desencadena la formación de anticuerpos y puede 51

causar una respuesta inmunitaria. La definición moderna abarca todas las sustancias que pueden ser reconocidas por el sistema inmune adaptativo, bien sean propias o ajenas. Un antígeno suele ser una molécula ajena o tóxica para el organismo (por ejemplo, una proteína derivada de una bacteria) que, una vez dentro del cuerpo, atrae y se une con alta afinidad a un anticuerpo específico. Cada anticuerpo es capaz de lidiar específicamente con un único antígeno gracias a la variabilidad que le otorga la región determinante de complementariedad del anticuerpo dentro de la fracción Fab de los mismos. Para que un antígeno sea reconocido por un anticuerpo, estos interactúan por complementariedad espacial. La zona donde el antígeno se une al anticuerpo recibe el nombre de epítopo o determinante antigénico, mientras que el área correspondiente de la molécula del anticuerpo es el parátopo. (Una analogía habitual para describir estas interacciones es el acoplamiento de una cerradura [epítopo] con su llave [parátopo]). Como se mencionó anteriormente, originalmente se consideraba un antígeno a una molécula que se liga específicamente a un anticuerpo; ahora, un antígeno se define como cualquier molécula o fragmento molecular que puede ser reconocido por una gran variedad de receptores antigénicos (receptores de células T o receptores de células B) del sistema inmune adaptativo. Las células presentan antígenos al sistema inmune mediante a través de moléculas de histocompatibilidad (CMH). Dependiendo del antígeno presentado y del tipo de molécula de histocompatibilidad, se pueden activar diferentes tipos de leucocitos. Por ejemplo, para el reconocimiento por parte de

los receptores de células T (TCR), los antígenos (mayoritariamente proteínas) deben ser procesado a pequeños fragmentos dentro de la célula (péptidos) y presentados al receptor de células T por el complejo mayor de histocompatibilidad. Los antígenos por sí solos no son capaces de provocar una respuesta inmune protectora sin la ayuda de un adyuvante inmunológico. Los componentes adyuvantes de las vacunas juegan un papel esencial para la activación del sistema inmune innato. Un inmunógeno es entonces, en analogía al antígeno, una sustancia (o una combinación de sustancias) capaz de desencadenar una respuesta inmune protectora cuando éste es introducido al organismo. Un inmunógeno debe iniciar una respuesta inmune innata, para más adelante continuar con la activación del sistema inmune adaptativo, mientras que un antígeno es capaz de unirse a los productos immunoreceptores altamente variables (receptores de células T o receptores de células B) una vez que estos han sido producidos. Los conceptos superpuestos de inmunogenicidad y antigenicidad son, por lo tanto, ligeramente diferentes, 

Inmunogenicidad es la habilidad de inducir una respuesta inmune humoral

(producción de anticuerpos) y/o una mediada por células (activación de linfocitos T). 

Antigenicidad es la habilidad de unirse específicamente con el producto

final de la respuesta inmune (por ejemplo, los anticuerpos ya formados y/o receptores de superficie de células T). Todas las moléculas inmunogénicas son también antigénicas; aún así, no todas las moléculas antigénicas son inmunogénicas.

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Los antígenos son usualmente proteínas o polisacáridos. Esto incluye partes de bacterias (cápsula, pared celular, flagelos, fimbrias, y toxinas), de virus y otros microorganismos. Los lípidos y ácidos nucleicos son antigénicos únicamente cuando se combinan con proteínas y/o polisacáridos. Los antígenos no-microbianos exógenos (ajenos al individuo) pueden incluir polen, clara de huevo, y proteínas de tejidos y órganos trasplantados, o proteínas en la superficie de glóbulos rojos transfundidos. Las vacunas son un ejemplo de antígenos en una forma inmunogénica; estos antígenos son intencionalmente administrados para inducir el fenómeno de memoria del sistema inmune adaptativo hacia los antígenos que invaden al receptor. Los coproantígenos son productos específicos de un parásito que se eliminan en las heces del paciente y que son susceptibles de su detección por técnicas inmunológicas. La inmunodetección de coproantígenos se basa en el empleo de anticuerpos, monoclonales o policlonales, que reconocen específicamente los productos eliminados (secreción, superficie o somáticos) por los parásitos que invaden el intestino y órganos anejos del hombre. La detección de antígenos parasitarios pertenece a un concepto diagnóstico moderno que, a diferencia de la detección de anticuerpos, permite diagnosticar la infección activa (Langley y Hillyer, 1989). El ensayo inmunoenzimático sobre fase sólida (ELISA) en sus dos variantes más conocidas, el DOT-ELISA y el FAST-ELISA ha sido en los últimos 10 años la técnica de mayor uso por su elevada sensibilidad, versatilidad y posibilidad de analizar grandes cantidades de muestras, lo cual facilita la realización de estudios epidemiológicos, así como el diagnóstico de casos individuales de fasciolosis

Se han desarrollado métodos de coproantígenos para el diagnóstico tanto de protozoos como de helmintos, como describiremos a continuación. De manera esquemática, en primer lugar, los anticuerpos preparados contra las moléculas del parásito a diagnosticar se inmovilizan sobre un soporte sólido, con frecuencia placas de ensayo

por

inmunoabsorción

ligado

a

enzimas

(ELISA),

membranas

inmunocromatográficas y otros materiales inertes. Después, los soportes sensibilizados se incuban con muestras diluidas de las heces sospechosas. Por último, los complejos inmunes se detectan con el mismo anticuerpo empleado en un principio o con otro de especificidad semejante, o distinta, al previamente utilizado. La mayoría de los inmunoensayos comercializados utilizan el formato de enzimoinmunoensayo (ELISA-Ag), que presenta una alta sensibilidad y especificidad, pero requiere la adición de múltiples reactivos, numerosos pasos de lavados y tiempos de incubación, por lo que se están desarrollando métodos de inmunodiagnóstico no enzimáticos más rápidos, como las pruebas inmunocromatográficas. Estas pruebas se basan en la utilización de microesferas de materiales como el poliestireno, coloreadas, a las que se conjuga covalentemente un anticuerpo monoclonal anti-antígeno del parásito. El antígeno parasitario presente en la muestra de heces reacciona con las microesferas recubiertas de anticuerpos y forma un complejo (microesfera-Ag) que migra por un proceso cromatográfico por la zona de reacción. En esta zona se encuentra una franja con anticuerpos monoclonales contra el parásito que reaccionan con el complejo microesfera-Ag, lo que origina la formación de una línea de color que indica el resultado positivo.

55

Las pruebas inmunocromatográficas son más rápidas y sencillas, no necesitan equipos de laboratorio especiales y se utilizan de forma individual. Frente a éstas, hay que destacar algunas ventajas del ELISA-Ag, como que permite procesar simultáneamente lotes de muestras y que, en la mayoría de los casos, presenta una sensibilidad y especificidad mayores que las pruebas de IC. La detección de coproantígenos presenta las siguientes ventajas: a)

La mayoría de las pruebas muestran una sensibilidad y especificidad

excelentes; b)

No requiere personal experimentado para su desarrollo;

c)

Es un diagnóstico rápido, de fácil interpretación y que posibilita el cribado

de gran número de muestras, de interés especial en casos de brotes; d)

Habitualmente, su desaparición de las heces se relaciona con la

eliminación del parásito mediante una quimioterapia eficaz; e)

Conduce a la diferenciación entre infecciones pasadas y recientes, y

f)

Permite, en algunos casos, la distinción de especies isomórficas del

mismo género, como Entamoeba histolytica (patógena) de Entamoeba dispar (no patógena). Hay que indicar que el diagnóstico por coproantígenos también presenta aspectos negativos, como el mayor coste de los reactivos, la obligación de emplear heces recientes o congeladas en la mayoría de los ensayos comercializados y, en ocasiones, la necesidad de examinar más de una muestra para conseguir un resultado concluyente. No obstante, aunque estas pruebas son más caras que los métodos

microscópicos tradicionales, los costes de trabajo del personal son menores, sobre todo en las técnicas rápidas, por lo que el análisis de comparación de costes de las pruebas diagnósticas comentadas no es tan desfavorable, ya que en las pruebas microscópicas deben incluirse los reactivos, controles de calidad, tiempo de trabajo y requerimiento de personal cualificado en microscopia con el entrenamiento adecuado.

CONCLUSIONES

Los anticuerpos monoclonales son glucoproteínas especializadas que hacen parte del sistema inmune, producidas por las células B, con la capacidad de reconocer moléculas específicas (antígenos). Los anticuerpos monoclonales son herramientas esenciales en el ámbito clínico y biotecnológico, y han probado ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunológicas y neoplásicas, así como también en el estudio de las interacciones patógeno-hospedero y la marcación, detección y cuantificación de diversas moléculas.

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Actualmente, la incorporación de las técnicas de biología molecular e ingeniería genética y proteica han permitido ampliar el horizonte de la generación de anticuerpos monoclonales y sus usos, y se han encontrado técnicas como la hibridación, la quimerización, la humanización y la producción de anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Es una de las áreas de mayor crecimiento en la industria biotecnológica y farmacéutica; en el mercado se encuentran cerca de 29 anticuerpos monoclonales aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos para uso en humanos

Los anticuerpos monoclonales han producido desde su descubrimiento una revolución de gran calado en el diagnóstico y el tratamiento de numerosas enfermedades. La utilización de anticuerpos monoclonales humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia. La tecnología actual de fabricación de estos anticuerpos permite nuevos diseños que pueden ampliar sus posibles aplicaciones en medicina Más allá del impacto en el diagnóstico de laboratorio, los anticuerpos monoclonales son una herramienta terapéutica poderosísima. Su alta especificidad permite el abordaje de dianas muy precisas que pueden determinar cambios celulares muy variados; además, dependiendo de la región Fc pueden diseñarse para facilitar distintos tipos de respuestas efectoras. El empleo de anticuerpos humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia clínica. La manipulación de los

anticuerpos mediante la unión a otras moléculas o el diseño de nuevas fragmentos de anticuerpos abren un gran abanico de posibles aplicaciones en medicina.

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Información

sobre

anticuerpos

monoclonales,

obtención y usos.  http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/m_especial/recursos.html

Textos

sobre microbiología especial. Incluye buenos textos sobre producción y usos de anticuerpos e inmunosueros.  http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/m_especial/10texto3.htm Información sobre anticuerpos, características y producción (incluye a los humanizados).

 http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan/intro.html

Estructura

y

diseño

de

anticuerpos.

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