Detección De Batrachochytrium Dendrobatidis En Anfibios Desde El Suelo Del Bosque Hasta El Dosel Superior De Una Selva Tropical De La Amazonía Ecuatoriana.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN-TARAPOTO FACULTAD DE ECOLOGÍA ESCUELA PROFESIONAL DE ING. AMBIENTAL PROGRAMA DE ESTUDIO DE ING. AMBIENTAL FILIAL MOYOBAMBA

TEMA: DETECCIÓN DE BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS EN ANFIBIOS DESDE EL SUELO DEL BOSQUE HASTA EL DOSEL SUPERIOR DE UNA SELVA TROPICAL DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA

CURSO: MICROBIOLOGÍA

DOCENTE: Blg. JHON JAIRO LOPEZ ROJAS

ALUMNO: CARLOS SANDOVAL VILLANUEVA VICTOR STEVEN MEDINA SUAREZ

CICLO ACADÉMICO: V

Moyobamba, 7 de Diciembre de 2018

DETECCIÓN DE BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS EN ANFIBIOS DESDE EL SUELO DEL BOSQUE HASTA EL DOSEL SUPERIOR DE UNA SELVA TROPICAL DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA SHAWN MCCRACKEN JAMES P. GAERTNER MICHAEL R. J. FORSTNER y DITTMAR HAHN * Departamento de Biología, Universidad Estatal de Texas 601 University Drive, San Marcos, Texas 78666, EE.UU.

Durante las últimas dos décadas se registraron importantes descensos y extinciones. de anfibios se han observado en todo el mundo (Blaustein y Wake 1995; Houlahan et al. 2000; Stuart et al. 2004). Los Neotrópicos se encuentran entre las áreas más afectadas, con pérdidas repentinas de especies de anuros observadas durante los años 80 en Costa Rica, Ecuador y Venezuela (Pounds and Crump 1994; Pounds et al. 1997; Young et al. 2001; Ron et al. 2003). Las disminuciones y pérdidas de la población han sido más significativas en elevaciones altas (por encima de 1000 m) en un estudio que muestra todas las especies de Atelopus con datos suficientes (N =28) disminución y desaparición del 75% (La Marca et al. 2005). Un importante factor que contribuye a las disminuciones de anfibios en todo el mundo es el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que estaba presente en los Neotrópicos antes de que se notaran disminuciones en la década de 1980 (Berger et al. 1999; Speare and Berger 2000; Bosch et al. 2001; Bradley et al. 2002; Lips et al. 2005; Ron y Merino 2000). Bd ahora está implicado como una de las causas de la extinción de varias especies de anuros de estas regiones (Ron y otros, 2003; La Marca y otros, 2005; Merino-Viteri y otros, 2005). Si bien se ha detectado Bd en anfibios de muchos sitios de elevación elevada en los Neotrópicos (por ejemplo, Ron y Merino 2000; Young et al. 2001; Lips et al. 2003), Los sitios de baja elevación en el Neotrópico han recibido comparativamente poca atención y, por lo tanto, los informes sobre la detección de Bd en estos sitios son menos comunes (Puschendorf et al. 2006; Oliveira de Queiroz Carnaval et al. 2006).

 El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, examinar la ocurrencia de Bd en especies de anfibios de un bosque lluvioso neotropical de tierras bajas, es decir, en sitios en la Cuenca del Alto Amazonas en el este de Ecuador a baja elevación (aproximadamente 200 m). Este estudio incluyó análisis de anfibios que ocupan nichos ecológicos sobre el suelo del bosque y las capas de arbustos, específicamente el dosel medio a superior, porque los estratos superiores de las selvas tropicales del Amazonas desempeñan un papel integral en la función de los ecosistemas y faltan datos para la interacción de Bd con anfibios en este importante microhábitat.

 Métodos: se recolectaron muestras de los sitios que rodean la Estación de Biodiversidad de Ti- putini - Universidad San Francisco de Quito (0.6384694 ° S, -76.1490806 ° W, 217 m elev.), En la frontera del Parque Nacional Yasuní, en las tierras bajas del este del Ecuador ( Fig. 1) durante los meses de mayo a agosto de 2004 y 2006. La vegetación de la región se ha definido como el bosque de tierras bajas siempre verde amazónica, donde la precipitación anual es de 2425–3145 mm, con un promedio de temperatura 25 ° C (el rango es de 15 ° a 38 ° C) y la humedad promedio es del 88% (Balslev et al. 1987; Blandin Landívar 1976; Duellman 1978). Esta área es parte del refugio Napo, un subconjunto del sistema amazónico, y es probable que represente a algunos de los bosques no perturbados más antiguos y la mayor biodiversidad del sistema (Prance, 1982). Los anfibios del suelo del bosque y la capa de arbustos se recolectaron cerca de las orillas del Río Tiputini en elevaciones entre 190 y 250 m durante las encuestas de encuentros visuales. Los anfibios que ocupan estratos más altos se recolectaron durante el muestreo de parches de bromelia siguiendo el procedimiento descrito por McCracken y Forstner (2008).

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Presentación esquemática del sitio de muestreo dentro del Yasuní.

Parque nacional cerca de la Estación de Biodiversidad de Tiputini (TBS) - La Universidad San Francisco de Quito, en la cuenca del Alto Amazonas, en el este de Ecuador, se usó para la recolección de anfibios a fin de analizar la infección por Batracho-chytrium dendrobatidis.

Se utilizaron clips de pie y muestras de piel de muslo del muslo para analizar Por la presencia de Bd (Tabla 1). Las muestras se agruparon en tres categorías (piso de fósforo / bosque, arbusto / sub-dosel y dosel superior) a lo largo del eje vertical en función de los lugares de recolección actuales e históricos para cada especie analizada. Las especies colocadas en la categoría de suelo de fósforo / bosque son aquellas que utilizan hábitats subterráneos como las rebabas Flujos y hoyos o típicamente ocurren entre la hojarasca del suelo del bosque. Se evaluaron treinta y seis individuos de 15 especies en el orden Anura de la categoría de suelo de fósforo / bosque. La segunda categoría contiene especies que ocupan el sotobosque del bosque (arbustos / subcanopy). Mientras que algunos de estos anfibios se pueden encontrar ocasionalmente en el suelo del bosque, se encuentran más comúnmente en la vegetación baja (<2 m); Se han encontrado algunos animales que fueron probados y colocados en esta categoría hasta 4 m. Veintinueve individuos de 12 especies en los órdenes Anura y Caudata fueron evaluados desde la categoría de arbustos / sub-canopy. La categoría final contiene las especies que se encuentran en el hábitat de

las bromelias del tanque que ocupa el dosel superior a más de 4 m (4–38 m). Veintiún individuos de 4 especies en el orden Anura fueron probados desde la capa superior del dosel. La temperatura del agua se recolectó en bromelias de tres tanques de la especie Aechmea zebrina ubicadas en el dosel superior de un árbol emergente, Parkia multijuga, a 32, 34 y 35,5 m de altura vertical y a 2 m de distancia horizontal del tronco del árbol. Se colocó un registrador de temperatura Thermochon iButton (modelo DS1922L) en una bráctea externa de cada bromelia a un mínimo de 8 cm por debajo del nivel del agua. Los registradores de datos se configuraron para recoger la temperatura del agua cada 30 minutos (35,5 m) y cada 60 minutos (32 m, 34 m) a una resolución de 0,5 ° C con una precisión de ± 1 ° C desde -30 ° C a + 70 ° C. La duración de la recolección de datos total varió de 43 a 142 días desde el 31 de marzo de 2008 hasta el 24 de agosto de 2008. Se tomó el pH del agua durante el muestreo de parches de bromelia según McCracken y Forstner (2008) para cinco A. zebrina en cada uno de 18 árboles para un total de 90 bromelias durante las temporadas de campo en 2006 y 2008 Se utilizó un Oakton pHTestr 30 para recoger el pH del agua a una resolución de 0.01 pH con una precisión de ± 0.01 pH; se realizó una calibración de tres puntos antes de cada árbol muestreado.

Un enfoque de PCR anidado que ha mostrado una mayor sensibilidad de detección en muestras con números de plantilla bajos y se describe en detalle en Gaertner et al. (en prensa) se utilizó para la detección de Bd. Este enfoque utilizó los cebadores ITS1f (5'CTT GGT CAT TTA GAGC GAA GTA-3 ') y ITS4 (5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') dirigidos a las regiones conservadas del rRNA 28S y 18S para amplificar el rRNA 5.8S gen y el espaciador transcrito interno (ITS) de todos los hongos (White et al. 1990). Los productos de PCR de esta reacción se purificaron y luego se utilizaron como plantilla para la posterior reacción de PCR utilizando el conjunto de cebadores específicos de Bd Bd1a (5'CAG TGT GCC ATA TGT CAC G-3 ') y Bd2a (5'CAT GGT TCA TAT CTG TCC AG-3 '(Annis et al. 2004). El producto de esta reacción se examinó mediante electroforesis en gel (agarosa al 2% en tampón TAE) (Sambrook et al. 1989) en busca de un fragmento de aproximadamente 300 pb (Annis et al. 2004). El ADN de una muestra positiva para Bd de un estudio anterior (Gaertner et al., En prensa) y el agua destilada esterilizada se utilizaron como controles positivo y negativo, respectivamente. Los productos de PCR de muestras que muestran los amplicones de 300 pb se secuenciaron luego utilizando el kit de inicio rápido CEQ 8800 con la adición de un 5% de DMSO a la mezcla de reacción en un secuenciador CEQ 8800 (Beckman Coulter, Fullerton, California). Las secuencias fueron validado contra las bases de datos GenBank / EMBL usando BLASTn (Pearson y Lipman 1988).



Detección de Batrachochytrium dendrobatidis (% ± 95% de con- intervalos de

confianza, calculados en Microsoft Office Excel) en muestras de anfibios recolectados dentro del Parque Nacional Yasuní, Ecuador, en tres grupos de estratos verticales diferentes (fósforo / piso; arbusto / sub-dosel, 0–4 m; y dosel,> 4 m).

RESULTADOS:

se examinaron ochenta y seis anfibios de dos órdenes (Anura N = 84 y

Caudata N = 2) pertenecientes a 7 familias y 31 especies (Tabla 1) utilizando análisis de PCR anidados (Gaertner et al., En prensa). De los evaluados, 17 individuos (20%) que representan ocho especies fueron positivos para Bd. Bd se detectó desde cada uno de los estratos, con el grupo de fósforo / piso que consta de nueve positivos de 36 individuos evaluados (25%), el grupo de arbustos / sub-dosel consistió de un positivo de 29 evaluados (3%), y el grupo del dosel formado por siete positivos de 21 analizados (33%) (Fig. 2). El análisis de secuencia comparativo de los 17 amplicones recuperados de la amplificación por PCR con las secuencias existentes de Bd disponibles en las bases de datos GenBank / EMBL confirmó la detección de Bd. Todas las secuencias mostraron una similitud de más del 99%, siendo todas las secuencias del gen rRNA 5.8S idénticas a la secuencia publicada de Bd (AY997031), y las de siete amplicones mostrando pequeñas diferencias en las regiones ITS (Tabla 2). Las temperaturas del agua registradas dentro de A. zebrina bromeliads en 32 m fueron 20.5–30.5 ° C (23.8 ± 1.9 [X ± SD], N = 1369), a 34 m fueron 20.0–31.0 ° C (24.1 ± 1.9, N = 3422), y en 35.5 m fueron 20.5–32.5 ° C (24.5 ± 2.5, N = 2017). El pH promedio registrado fue de 4.48 ± 0.67 (N = 90).

DISCUSIÓN: Se demostró la presencia de Bd en anfibios de la Cuenca del Alto Amazonas en el este de Ecuador. Bd se ha detectado en varios sitios de gran altitud en los Neotrópicos (Lips et al. 2003; Ron y Merino 2000; Young et al. 2001), sin embargo, las detecciones en sitios de baja

elevación son menos comunes (Oliveira de Queiroz Carnaval et al. 2006 ). Nuestros resultados han demostrado que Bd está presente en las selvas tropicales de las tierras bajas del Amazonas en elevaciones inferiores a 300 m. Este hallazgo es significativo porque a pesar de que las disminuciones de anfibios no son tan frecuentes en las elevaciones bajas (Oliveira de Queiroz Carnaval et al. 2006; Puschendorf et al. 2006), Bd está presente y podría estar contribuyendo a las disminuciones. Los anfibios también pueden servir como un reservorio para Bd que luego podría moverse e infectar a los anfibios en sitios de mayor elevación. Otro hallazgo importante de este estudio es la demostración de signos clínicos de quitridiomicosis y una detección positiva de Especies de anfibios.

Especies de anfibios.

Número de muestras

Número de muestras Bd-

analizadas

positivas

Pabellón Hypsiboas boans

1

0

Osteocephalus taurinus

4

0

Pristimantis aureolineatus

7

4

Pristimantis waoranii

9

3

21

7

Dendropsophus parviceps

2

0

Hypsiboas cinerascens

1

0

Hypsiboas geographicus

1

0

Hypsiboas lanciformis

2

0

Osteocephalus planiceps

2

0

Scinax cruentommus

2

0

Scinax ruber

1

0

Pristimantis acuminatus

3

0

Pristimantis altamazonicus

6

0

Pristimantis ockendeni

6

1

Pristimantis peruvianus

1

0

Bolitoglossa equatoriana

2

0

29

1

Rhinella margaritifera

2

0

Rhinella marina

2

0

Engystomops petersi

6

1

Leptodactylus andrea

1

0

Leptodactylus discodactylus

5

2

Leptodactylus hylaedactyla

1

0

Leptodactylus pentadactylus

5

4

Leptodactylus rhodomystax

1

1

Leptodactylus wagneri

1

0

Chiasmocleis bassleri

3

0

Oreobates quixensis

2

0

Pristimantis lanthanites

1

1

Total Arbusto / sub-canopy

Total Fossorial / piso

Pristimantis malkini

2

0

Strabomantis sulcatus

2

0

34

9

Total

Bd por un individuo (Leptodactylus pentadactylus) incluido en el estudio. En experimentos de laboratorio, Bd creció mejor y fue más letal en condiciones frescas (22ºC) y húmedas (Piotrowski et al. 2004; Woodhams et al. 2003), lo que sugiere que las especies de montaña deberían ser los candidatos más probables para la disminución. Este escenario es sin duda respaldado por estudios en el área, donde un estudio no encuentra siquiera una sola población de Atelopus aparentemente sana en elevaciones por encima de 1000 m (La Marca et al. 2005). A pesar de la aparente virulencia de Bd en sitios de alta elevación, hay muy pocos relatos de disminuciones poblacionales causadas por la infección de Bd en elevaciones bajas. El descubrimiento de L. pentadactylus en esta elevación que muestra signos clínicos sugiere que Bd podría desempeñar un papel más importante en la disminución de las tierras bajas de lo que se pensaba anteriormente.

Todos los estudios anteriores sobre Bd han utilizado anfibios capturados en o cerca del nivel del suelo. Esto permite probar solo la porción de anfibios contenida en los estratos inferiores de un sistema estructuralmente complejo. Detectamos Bd en anfibios que habitan en todos los estratos del bosque, lo que demuestra que las búsquedas que no incluyen los estratos verticales pueden carecer de datos importantes sobre el sistema. Además, encontramos evidencia de que la aparición de la infección por Bd en anfibios a lo largo de un eje vertical no es aleatoria en este sistema. Se encontró que la infección por Bd era significativamente mayor en los grupos fosforial / piso y dosel, mostrando un 25% y un 33% de individuos infectados, respectivamente, que en el grupo de arbustos / sub-dosel con solo un individuo (3%) infectado. Cada uno de los estratos de la selva tropical tiene características únicas de microclima que potencialmente podrían afectar las infecciones por Bd. En este caso, la disponibilidad de agua puede jugar un papel en la prevalencia de la infección en cada uno de los grupos. Los anfibios del grupo de piso / fósforo tienen agua disponible en forma de arroyos y charcas de pie, y el grupo del dosel tiene acceso al agua capturada en fitotelmas, principalmente bromelias de tanques. Debido a que Bd se transmite a través de zoosporas acuáticas (Longcore et al. 1999), la ausencia de abundancia de agua estancada disponible para los anfibios del grupo de arbustos / sub-canopy puede estar reduciendo su exposición al hongo. Los estudios anteriores han demostrado que las condiciones ambientales a nivel del paisaje pueden tener fuertes efectos en la dinámica patógeno del huésped (Woodhams et al. 2006), y los estudios futuros deben incluir la investigación de las interacciones de Bd con las condiciones ambientales, incluida la disponibilidad de agua, tanto en Nivel de paisaje y

microhábitat. Se ha encontrado que los parámetros ambientales para Bd tienen una influencia significativa en su patogenicidad (Andre et al. 2008; Piotrowski et al. 2004). Piotrowski et al. (2004) encontraron que los aislamientos de Bd crecían y se reproducían (en cultivo) entre 4–25ºC y pH 4–8. El crecimiento óptimo de zoosporas Bd ocurrió a temperaturas de 17–25ºC y pH 6-7 (Piotrowski et al. 2004). Tasas de mortalidad en estudios de ranas infectadas con Bd expuestas a temperaturas ambiente de 17–25ºC han sido> 50%, aunque varios estudios muestran una mayor supervivencia y menores tasas de infección con temperaturas> 22ºC (Andre et al. 2008; Berger et al. 2004; Carey et al. 2006; Kriger y Hero 2007; Woodhams et al . 2003). Exposición a temperaturas > Se ha demostrado que> 25ºC matan zoosporas Bd y curan ranas infectadas (Berger et al. 2004; Kriger and Hero 2006; Piotrowski et al. 2004; Woodhams et al. 2003). Si bien Bd prefiere un pH casi neutro, se encontraron zoosporas nadadoras en cultivos a pH 4 y a una temperatura de 23ºC durante 14 días (Piotrowski et al. 2004). En nuestro estudio, recogemos los parámetros ambientales básicos del agua. Las bromelias del tanque A. zebrina indican una temperatura óptima. Condiciones para la persistencia de Bd en el dosel. Si bien los niveles de pH fueron más bajos de lo que se informó anteriormente como condiciones óptimas en experimentos de cultivo de hongos, no queda claro qué efecto tiene esto in situ. Pristimantis aureolineatus y P. waoranii son habitantes permanentes conocidos de A. zebrina bromeliads y, con el 44% de los individuos evaluados en este estudio que dieron positivo, parece evidente que la Bd está presente en los fitotelomas del dosel. Sin embargo, la prueba definitiva de este supuesto requiere la detección de Bd directamente en el agua de las bromelias. Muchas otras especies de anuros utilizan el hábitat de las bromelias para los sitios de deposición de huevos y renacuajos y pueden actuar como un reservorio para transferir el patógeno entre los sitios. Varias especies de Dendrobatidae son de particular preocupación ya que transfieren renacuajos de los sitios de deposición terrestre a las bromelias en el dosel para el desarrollo final. Esta amplia travesía de hábitats puede facilitar el movimiento de Bd entre las fuentes de agua terrestres y de dosel, se necesitan estudios adicionales para rastrear el movimiento potencial de Bd a lo largo del eje vertical. Cuatro rasgos ecológicos se asocian comúnmente con poblaciones de anfibios en declive, que incluyen: modo de vida acuático, ocurrencia en altitudes medias a altas, baja fecundidad y distribución endémica (Laurance et al. 1996; Lips 1998; Lips et al. 2003; Williams and Hero 1998 ). La observación de los signos clínicos de la quitridiomiosis en un sitio de baja elevación y las características de los microhábitats utilizados por los habitantes permanentes del anuro del dosel infectados por Bd demuestran que la amenaza de quitridiomicosis todavía puede ser significativa en los sitios, incluso en ausencia de esos rasgos.

AGRADECIMIENTOS. Estamos en deuda con la National Science Foundation (Programa de becas de investigación para graduados (SFM) y la subvención GK-12 No. 0742306) para apoyo financiero. La financiación también fue proporcionada en parte por la Universidad del Estado de Texas, el Departamento de Biología y la Organización TADPOLE. Las muestras se obtuvieron con los números de permiso 006-IC-FA-PNYRSO y 012-IC-FA-PNY-RSO, y se exportaron con los números de permiso 001EXP-IC-FA-RSO-MA y 005-EXP-IC-FA-RSO -MA expedido por el Ministerio del Ambiente, Ecuador. La investigación se llevó a cabo de conformidad con las normas supervisadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Texas (IACUC, permisos 0721-0530-7, 05-05C38ADFDB, y 06- 01C694AF). Agradecemos a todo el personal de la Estación de Biodiversidad de Tiputini. - Universidad San Francisco de Quito, especialmente Jaime Guerra, David Romo, Kelly Swing y Consuelo de Romo para coordinar el apoyo logístico, David Romo, Gonzalo Banderas y Leo Zurita por ayuda para obtener visas y permisos de investigación, recolección y exportación. Bejat McCracken, James Dixon, Josephine Duval, Paul Herbertson, Tana Ryan y Robert Winters para asistencia en el trabajo de campo, y Diana McHenry y Michele Gaston para asistencia de laboratorio y manejo de muestras.

LITERATURA CITADA -

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