Validación De Métodos Analíticos

INFORME DE PRÁCTICA PROFESIONAL

HOMOLOGACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS FISICOQUÍMICO EMPLEADOS EN POSTOBÓN S.A. PARA MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTO TERMINADO, Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE GRADOS BRIX

FRANKY ESTEBAN BEDOYA LORA c.c. 1.017.143.241

ASESORES: AIDA LUZ VILLA JAIME ANDRÉS CASTRO

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA MEDELLÍN AGOSTO 2009

A mi familia

ii

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN

11

2. RESUMEN

13

3. OBJETIVOS

14

3.1.

GENERAL

14

3.2.

ESPECÍFICOS

14

4. MARCO TEÓRICO

15

4.1.

15

VALIDACIÓN

4.1.1. Definición, importancia y necesidad de validación 4.1.1.1.

15

Definición general del proceso de validación y el porqué de su importancia

15

4.1.1.2.

Necesidad de una validación

16

4.1.1.3.

Cuando realizar una validación

17

4.1.2. Clasificación de métodos

18

4.1.2.1.

Según la normalización y estado de desarrollo

18

4.1.2.2.

Según categoría de método

19

4.1.3. Algoritmo de validación (aspectos logísticos)

19

4.1.3.1.

Principales preguntas a realizar

19

4.1.3.2.

Decisión del grado de validación requerido

20

4.1.3.3.

Requerimiento analítico

21

4.1.3.4.

Requerimientos analíticos y características de rendimiento relacionadas

22

4.1.4. Parámetros de rendimiento y de caracterización del método

25

4.1.4.1.

Robustez

25

4.1.4.2.

Confirmación de identidad: selectividad/especifidad

32

4.1.4.3.

Limite de detección (LID y LDM)

34

iii

4.1.4.4.

Límite de cuantificación (LDC) y límite de cuantificación práctico (LCP)

37

4.1.4.5.

Linealidad

38

4.1.4.6.

Rango

46

4.1.4.7.

Sensibilidad

46

4.1.4.8.

Precisión

48

4.1.4.9.

Exactitud

54

4.1.4.10. Incertidumbre

59

4.2.

62

EQUIPOS Y PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

4.2.1. Densímetro: DMA 58 Anton Para

62

4.2.1.1.

Especificaciones y condiciones de operación del equipo

62

4.2.1.2.

Teoría de operación

63

4.2.1.3.

Calibración

65

4.2.1.4.

Conversión a grados Brix

66

4.2.1.5.

Posibles causas de error del instrumento

67

4.2.2. Refractómetro: RFM 340 Bellingham Stanley

67

4.2.2.1.

Especificaciones y condiciones de trabajo del equipo

68

4.2.2.2.

Teoría de operación

68

4.2.2.3.

Calibración

72

4.2.2.4.

Conversión de unidades

72

4.2.2.5.

Posibles causas de error del instrumento

73

4.3.

EL AZÚCAR

73

4.3.1. Definición

73

4.3.2. Propiedades fisicoquímicas y composición

74

4.3.3. Usos comerciales y producción

74

4.4.

76

BRIX

4.4.1. Generalidades

76

4.4.2. Medición de grados Brix

77

4.4.3. Uso de grados Brix en la industria

78

iv

4.5.

INVERSIÓN DEL AZÚCAR

78

4.5.1. Generalidades

78

4.5.2. Química de la inversión del azúcar

80

4.5.3. Cinética de la inversión

81

4.5.4. El por qué de la lectura en Brix invertido

82

5. DESARROLLO DEL PROYECTO

84

5.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

84

5.2.

HOMOLOGACIÓN

84

5.3.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE GRADOS BRIX

86

5.3.1. Equipos y recursos usados en la validación

86

5.3.1.1.

Instrumentos de análisis

86

5.3.1.2.

Equipos para preparación de muestra

87

5.3.1.3.

Reactivos

88

5.3.1.4.

Recursos complementarios

88

5.3.2. Resumen del método para la determinación de grados Brix

89

5.3.3. Clasificación del método

90

5.3.4. Parámetros a validar y criterios de aceptación

90

5.3.5. Muestras, estándares y patrones de referencia

92

5.3.5.1.

Muestras

92

5.3.5.2.

Estándares

93

5.3.5.3.

Patrones de referencia

93

5.3.6. Condiciones ambientales y tiempo de experimentación

94

5.3.7. Metodología

94

5.3.7.1.

Robustez

94

5.3.7.2.

Confirmación de identidad: selectividad/especifidad

97

5.3.7.3.

Linealidad

98

5.3.7.4.

Rango

99

5.3.7.5.

Sensibilidad

99

5.3.7.6.

Precisión

99 v

5.3.7.7.

Exactitud

100

5.3.7.8.

Incertidumbre

102

5.3.8. Resultados y análisis

103

5.3.8.1.

Robustez

103

5.3.8.2.

Especifidad

120

5.3.8.3.

Linealidad

121

5.3.8.4.

Rango

131

5.3.8.5.

Sensibilidad

132

5.3.8.6.

Precisión

134

5.3.8.7.

Exactitud

136

5.3.8.8.

Incertidumbre

137

5.4.

CONCLUSIONES

140

5.5.

RECOMENDACIONES Y TRABAJOS FUTUROS

142

6. BIBLIOGRAFÍA

143

vi

ÍNDICES DE TABLAS Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Tabla 7. Tabla 8. Tabla 9. Tabla 10. Tabla 11. Tabla 12. Tabla 13. Tabla 14. Tabla 15. Tabla 16. Tabla 17. Tabla 18. Tabla 19. Tabla 20. Tabla 21. Tabla 22. Tabla 23. Tabla 24. Tabla 25. Tabla 26. Tabla 27. Tabla 28. Tabla 29. Tabla 30. Tabla 31. Tabla 32. Tabla 33. Tabla 34. Tabla 35. Tabla 36. Tabla 37. Tabla 38. Tabla 39. Tabla 40. Tabla 41. Tabla 42. Tabla 43. Tabla 44. Tabla 45. Tabla 46. Tabla 47.

Parámetros de rendimiento relacionados según el requerimiento analítico Parámetros a evaluar según el nivel de normalización del método Parámetros a evaluar según la categoría del método Procedimiento general para evaluar la robustez Procedimiento general para confirmación de identidad: selectividad/especifidad Procedimiento general para evaluar LID y MDL Procedimiento general para evaluar LDC y LCP Ecuaciones para el análisis de varianza en una regresión lineal Procedimiento general para evaluar la linealidad y el rango de trabajo Procedimiento general para evaluar la sensibilidad Factores que inciden en la precisión Diseño matricial genérico propuesto Procedimiento general para evaluar la precisión Procedimiento general para evaluar la exactitud Resumen de especificaciones del densímetro Condiciones de operación del densímetro Composición del aire seco Resumen de especificaciones del refractómetro Relación entre algunos medios y el índice de refracción Coeficientes para regresión polinómica de grados Brix invertido a partir del índice de refracción Tabla Jackson-Gillis Resumen de especificaciones del ultrasonido Descripción de muestras usadas en el desarrollo del proyecto Condiciones ambientales promedio en el laboratorio central Variables con influencia apreciable sobre el método analítico Niveles de influencia para los distintos factores Niveles de concentración evaluados en la robustez Componentes seleccionados para el análisis de especifidad Diseño de experimentos tipo Plackett-Burman para especifidad Soluciones preparadas según el instrumento Diseño de experimentos para precisión intermedia Descripción del patrón usado en el cálculo de exactitud para el densímetro. Estándares usados en el cálculo de la exactitud para el densímetro. Descripción de estándares usados para la calibración del refractómetro a distintos rangos. Descripción de patrones usados en el cálculo de exactitud para el refractómetro. Resultados prueba de estabilidad para refractómetro Resultados prueba de estabilidad para densímetro Promedios de porcentaje de agua perdida respecto al día de lectura Resultados para el tiempo homogeneización en ultrasonido Resultados para prueba de cantidad de HCl para refractómetro Resultados para prueba de cantidad de HCl para densímetro Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para refractómetro Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para densímetro Resultados del ensayo de tiempo de inversión para refractómetro Resultados del ensayo de tiempo de inversión para densímetro Resultados del ensayo de temperatura de inversión para refractómetro Resultados del ensayo de temperatura de inversión para densímetro

vii

23 24 24 28 34 36 38 44 46 48 49 54 54 58 62 63 66 68 68 73 82 87 92 94 95 96 96 97 98 99 100 101 101 102 102 104 105 106 108 109 109 112 113 113 114 115 115

Tabla 48. Tabla 49. Tabla 50. Tabla 51. Tabla 52. Tabla 53. Tabla 54. Tabla 55. Tabla 56. Tabla 57. Tabla 58. Tabla 59. Tabla 60. Tabla 61. Tabla 62. Tabla 63. Tabla 64. Tabla 65. Tabla 66. Tabla 67. Tabla 68. Tabla 69. Tabla 70. Tabla 71. Tabla 72. Tabla 73. Tabla 74. Tabla 75. Tabla 76. Tabla 77. Tabla 78. Tabla 79. Tabla 80.

Resultados del ensayo de agitación para refractómetro y densímetro Resultados del ensayo de tiempo de retardo en lectura Resultados del ensayo para temperatura de lectura Concentraciones reales de las soluciones placebo preparadas para la especifidad Respuesta en °B para las soluciones placebo en el análisis de especifidad Sensibilidades parciales para los componentes presentes en las soluciones placebo Especifidades calculadas para las soluciones placebo Resultados para linealidad por densimetría en Brix invertido Resultados para linealidad por densimetría en Brix directo Resultados para linealidad por refractometría en Brix invertido Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango bajo Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango alto Parámetro de regresión en el análisis de linealidad Parámetros de regresión polinómica en el análisis de linealidad por refractometría en rango alto. ANOVA y pruebas de verificación de supuestos para linealidad Pruebas de significancia para pendiente e intercepto Recuperación (%) para datos de linealidad Sesgo (°B) para datos de linealidad Recuperación y sesgo (°B) para datos de linealidad por refractometría en rango alto Sensibilidades para respuestas aproximadamente lineales Sensibilidades a varias concentraciones para rango alto en refractometría Repetitividades para densimetría y refractometría Intervalos de confianza para densimetría y refractometría en el análisis de repetibilidad Verificación de varianzas similares entre analistas para precisión intermedia Resultados del análisis de precisión intermedia Intervalos de confianza para la precisión intermedia Resultados de exactitud para calibración con agua destilada en densimetría Resultados de exactitud para calibración con patrón de referencia en densimetría Resultados de exactitud para refractómetro en un rango de calibración alto y bajo Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando densímetro Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando refractómetro en un rango de calibración bajo Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando refractómetro en un rango de calibración alto Reporte de validación para método de determinación de grados Brix por densimetría y refractometría

viii

116 117 119 120 120 121 121 122 122 123 123 124 124 125 129 130 131 131 132 132 133 134 135 135 135 136 136 137 137 138 138 139 141

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. Figura 26. Figura 27. Figura 28. Figura 29. Figura 30. Figura 31. Figura 32. Figura 33. Figura 34. Figura 35. Figura 36. Figura 37.

Ciclo de validación Diagrama de desarrollo, validación y ajuste de un método analítico Algoritmo para la evaluación de robustez en un método analítico Distribución normal y no normal Jerarquía de los niveles de precisión Diferencia entre exactitud y precisión Procesos para cálculo de exactitud Componentes del sesgo en una medida Esquema del sistema para medir densidad Esquema del proceso de medición en un densímetro tipo tubo en U Esquema del lector para el refractómetro Geometría de la refracción Esquema de refracción a distintos ángulos Esquema de medición en un refractómetro con autobarrido Efecto de la concentración de azúcar en el índice de refracción Estructura química de la sacarosa Representación esquemática de la reacción de inversión Diagrama King-Jison Condiciones ambientales en el Laboratorio Central a través del tiempo Grados Brix respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en densimetría Promedio de todos los ensayos de estabilidad en porcentaje de agua perdida respecto al tiempo Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra para el refractómetro Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra para el densímetro Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura en jarabe Regresión lineal para densidad respecto a °B invertido Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada para Brix invertido Regresión lineal para densidad respecto a Brix directo Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada para Brix directo Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix invertido Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix invertido Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango bajo Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix directo en rango bajo Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango alto Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix directo en rango alto

ix

16 22 26 43 48 49 55 56 63 64 67 69 70 71 71 74 79 82 94 105 106 106 107 110 111 118 118 125 126 126 126 127 127 127 128 128 128

ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO A. TABLA PARA ESTADÍSTICO DE COCHRAN ANEXO B. CERTIFICADOS Y TABLAS PARA MATERIALES DE REFERENCIA ANEXO C. MATRIZ DE COMPARACIÓN DE MÉTODOS (en formato Microsoft Excel) ANEXO D. CONDICIONES AMBIENTALES DEL LABORATORIO CENTRAL (en formato Microsoft Excel) ANEXO E. RESULTADOS Y CÁLCULOS (en formato Microsoft Excel)

x

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

1. INTRODUCCION La compañía POSTOBÓN S.A. lleva un largo recorrido en el desarrollo, producción y distribución de bebidas no alcohólicas. Sus 105 años en la industria de bebidas y su portafolio que incluye gaseosas, refrescos de fruta, té, jugos, hidratantes, energizantes y aguas de mesa avalan la importancia de esta empresa en el sector de alimentos a nivel nacional. Una de las áreas de Postobón S.A. es la División Nacional de Gestión de Calidad que tiene entre sus funciones el aseguramiento de la calidad en los procesos productivos así como de las materias primas usadas y de los productos terminados. El Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A. es fundamental dentro de todo el proceso de gestión de calidad, este tiene como principal función: el análisis fisicoquímico, microbiológico y sensorial de muestras de producto terminado en todas las categorías, de acuerdo a los lineamientos dados por el Manual del Sistema de Gestión de Calidad. Estos análisis se realizan mensualmente con el objeto de verificar el cumplimiento de las características de calidad establecidas en los 24 centros productores distribuidos a lo largo de la geografía colombiana. Además, el Laboratorio Central debe proporcionar los métodos analíticos fisicoquímicos, microbiológicos y sensoriales desarrollados y homologados, que se usarán para el control de calidad en toda la compañía. Los métodos utilizados además de estar debidamente estandarizados y validados dentro de la compañía, deben ser consecuentes con los lineamientos establecidos en las normas nacionales e internacionales. Este será el principal propósito del trabajo: establecer un proceso de validación y efectuarlo en el método para la determinación de grados Brix, con miras en la acreditación de la compañía según los lineamientos de la NTC-ISO 17025. Inicialmente se realiza una homologación general para los métodos de análisis fisicoquímicos usados en POSTOBÓN S.A. respecto a procedimientos estándar; luego de establecer las diferencias, se proponen las modificaciones pertinentes para asegurar la conformidad con la normativa nacional e internacional. Se establecen entonces los parámetros de rendimiento del método para determinación de grados brix en bebidas gaseosas y jarabes. El cálculo adecuado de estos requiere un diseño de experimentos acorde a las necesidades de la compañía y al alcance de la validación. Se determina, además, un estimado de la 11

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incertidumbre en dos instrumentos, densímetro y refractómetro, que establecerá el grado de confianza en los resultados aportados por dichos equipos. Para una correcta validación se debe tener pleno conocimiento de los fenómenos llevados a cabo por el método en cuestión, por esto se describen los principios de funcionamiento de ambos equipos, refractometría y densimetría, la definición de Brix directo e invertido en el ámbito industrial y las propiedades fisicoquímicas del azúcar.

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2. RESUMEN En el presente trabajo se realiza una homologación de métodos fisicoquímicos en la compañía POSTOBÓN S.A. respecto a normas nacionales e internacionales, con el fin de cerrar brechas y documentar diferencias para posibles modificaciones. Además, se desarrolla todo el proceso de validación del método para determinación de grados Brix en bebidas gaseosas y jarabes, usado en el Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A., que busca evaluar el rendimiento en la ejecución del método y sentar las bases para el protocolo de validación de otros métodos en el futuro. Los parámetros de rendimiento evaluados incluyen: la robustez del método, confirmación de identidad, linealidad, rango, sensibilidad, precisión, exactitud e incertidumbre. ABSTRACT

A homologation of physicochemical methods was carried out respect to national and international standards methods, in order to close gaps and to identify differences that must be considered in future modifications. Furthermore, the whole process of validation was developed for the “Determination of Brix grades in soft drinks and syrups method”, in Postobón S.A. Central Laboratory, where the yield of the method will be evaluated and other methods will be validated. The performance parameters evaluated include: robustness, confirmation of identity, linearity, range, sensitivity, precision, accuracy and uncertainty.

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3. OBJETIVOS 3.1.

GENERAL

Homologar los métodos empleados para los análisis fisicoquímicos en POSTOBÓN S.A. de producto terminado y materias primas tendiendo como referencia normas nacionales e internacionales, y validar el método para la determinación de los grados Brix. 3.2.

ESPECÍFICOS

-

Revisar y homologar los métodos de ensayo fisicoquímico descritos en las normas POSTOBÓN S.A. teniendo como referencia normas internacionales y nacionales, y como principal referente las aportadas por PEPSICO, estableciendo diferencias y realizando los ajustes necesarios para la posterior homologación dentro de la compañía entre los laboratorios de calidad de los distintos centros productores y el laboratorio central.

-

Validar el método para la determinación de grados Brix en bebidas por densimetría y refractometría. Esto incluye el cálculo de la robustez del método, variables de rendimiento como exactitud, precisión, linealidad, sensibilidad entre otras, y cálculo de la incertidumbre.

-

Establecer un protocolo de validación que incluya los aspectos mencionados en el objetivo anterior, para su uso en la posterior validación de los demás métodos.

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4. MARCO TEÓRICO 4.1.

VALIDACIÓN

4.1.1. Definición, importancia y necesidad de validación 4.1.1.1.

Definición general e importancia del proceso de validación

Existen varias formas de llevar a cabo una validación, de acuerdo a sus objetivos y alcances, los cuales dependen del analista, del laboratorio y del uso que se haga del método; además el analista debe conocer los resultados esperados y definir el nivel de confianza. El laboratorio que desarrolla o aplica el método es el responsable del proceso de validación. La validación puede definirse como: i) El establecimiento de una base de datos experimental que certifica el rendimiento de un método analítico teniendo en cuenta su objetivo de diseño [1]. ii) La confirmación por medio de una evaluación, con la cual se suministra la evidencia necesaria para ratificar que los objetivos de diseño del método bajo especificaciones particulares se cumplen en su totalidad [2]. Dos palabras claves en estas dos definiciones reúnen los dos objetivos primordiales de una validación, establecer un método y confirmar su desempeño por medio de tratamientos estadísticos y apreciaciones cualitativas por parte del laboratorio en general. De ahí radica la importancia de una adecuada validación, ya que establece bajo qué circunstancias debe realizarse un análisis asegurando que los datos obtenidos cumplen en la totalidad la calidad deseada, brindando seguridad y respaldo. Además, proporciona criterios para el rechazo o reanálisis de lecturas anómalas. La validación de un método, generalmente, está íntimamente relacionada con el desarrollo del método. En efecto, a menudo es difícil saber de forma exacta cuándo termina el desarrollo del método y cuando comienza la validación. Por otro lado, acompañando el proceso de validación, está la transferencia de métodos. Este proceso se encarga de la introducción de un método validado a otro laboratorio de tal forma que pueda ser usado con la misma capacidad para el cual fue diseñado inicialmente. Generalmente, el proceso de transferencia de métodos está a cargo del laboratorio que usará el método validado. Sin embargo es de vital importancia la participación de ambas partes, tanto el que seleccionó/diseño/validó 15

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el método como los laboratorios que harán un uso rutinario de estos. Una transferencia de métodos depende de una cooperación y comunicación cercana entre éstos laboratorios. En la figura 1 se esquematiza el ciclo de una validación, en teoría éste se repite indefinidamente debido a los continuos avancen instrumentales y/o al desarrollo de nuevas técnicas.

Desarrollo del método

Control de calidad del Laboratorio

Validación Revalidación

Figura 1. Ciclo de validación.

4.1.1.2.

Necesidad de una validación

Eurachem, una asociación europea de laboratorios focalizada en el mejoramiento y estandarización de los métodos de análisis químico, propone los siguientes principios para promover una buena práctica en las mediciones de análisis químico [3]: 1. Las mediciones analíticas deben hacerse para satisfacer un objetivo definido. 2. Las mediciones analíticas deben realizarse usando métodos y equipos evaluados, y así asegurar que estos son adecuados para su propósito. 3. Los analistas encargados de los análisis deben estar calificados y ser competentes con las tareas asignadas, además deben demostrar que ellos pueden realizar el análisis de forma adecuada. 4. Debe de existir un aseguramiento independiente y periódico del desempeño de las técnicas del laboratorio. 5. Las mediciones analíticas realizadas en un lugar en particular deben ser consistentes con aquellas realizadas en cualquier otro laboratorio. 16

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6. Las organizaciones encargadas de realizar estos análisis deben tener bien definido un procedimiento de control y aseguramiento de la calidad. En el segundo principio se pueden encontrar de forma implícita la validación y por tanto hace parte de las buenas prácticas fundamentales para realizar buenas medidas en análisis fisicoquímicos. 4.1.1.3.

Cuándo realizar una validación

La validación se encuentra dentro de un proceso de mejoramiento de la calidad de los laboratorios, y hace parte de un ciclo que es renovado con cada modificación que se realiza a los métodos. El proceso de validación debe realizarse cuando: -

Se desarrolla un nuevo método para un problema en particular (primera validación). Se establece un método usado en otro laboratorio o con diferentes analistas. Cambio o actualización de equipos de análisis. Obsolescencia y correspondiente actualización del método. Se renueva el principio activo o se realizan correcciones al procedimiento debido a condiciones de logística o de diseño. Cuando el control de calidad indica que el método establecido reporta valores que varían con el tiempo. Cuando existen alteraciones de fondo en la matriz de análisis. Se desea demostrar la equivalencia de dos métodos, comparación entre un método alternativo y uno normalizado.

Estos factores no son excluyentes y por lo tanto pueden efectuarse varios a la vez. Se recomienda, entonces, cuando sea necesaria una re-validación, realizar la mayor cantidad de cambios previstos a futuro, y de esta forma no será necesario ejecutar validaciones de manera seguida; es decir, si por algún motivo se realiza una corrección en el procedimiento y es necesaria la validación, se debe realizar una búsqueda bibliográfica de la técnicas actuales para el método en cuestión y evaluar si en ese momento existen mejores técnicas para dicho análisis y si es apropiada su aplicación. El proceso de validación está limitado por el alcance que se requiere, es importante definir bien los objetivos iniciales y el alcance que tendrá para de esta forma optimizar los ensayos. Es de anotar, que en una re-validación no es necesario realizar todo el proceso de validación, en ocasiones solo es necesario realizar el correspondiente análisis de robustez y precisión.

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4.1.2. Clasificación de métodos analíticos 4.1.2.1.

Según la normalización y estado de desarrollo del método

Métodos estándar o normalizados Los métodos estándar son aquellos publicados por organizaciones internacionales, regionales o nacionales; por organizaciones técnicas respetables; referencias legales; métodos publicados por la FDA (Food and Drug Administration), y que se ejecutan tal como se describen en la norma. Estos métodos incluyen aquellos publicados por: -

United States Pharmacopeia (USP) National Formulary (NF) Homeopathic Pharmacopeia of the United States Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (AOAC) American Public Health Association (APHA) Pesticide Analytical Manual (PAM) Food Additives Analytical Manual Food Chemicals Codex FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) FDA Macroanalytical Procedures Manual (MPM) ORA Laboratory Information Bulletins (LIBs)

Se prefiere usar los métodos estándar, sin embargo es necesaria la verificación de la capacidad analítica dentro de los laboratorios en los cuales es usado. Un método estándar puede estar complementado con detalles adicionales sobre como los laboratorios deben proceder para asegurar una aplicación consistente. Aquellos métodos especificados por fabricantes de equipos de análisis también son considerados como métodos estándar, por ejemplo los suministrados por HACH en el Handbook de análisis de agua por métodos espectrofotométricos [4]. Métodos desarrollados por el laboratorio En ocasiones cada laboratorio elabora sus propios métodos, esto puede deberse a que el análisis es muy específico y se evalúa, por ejemplo, cierta matriz especial que solo interesa al laboratorio; o que debido a restricciones de tipo comercial no se puede disponer de métodos análogos usados en otras empresas o compañías. El laboratorio, por consiguiente, debe evaluar la capacidad de los analistas, equipos y otros recursos relacionados con el método en cuestión. Los métodos deben estar debidamente validados, documentados y autorizados para su uso. 18

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Para la evaluación de la capacidad del método se sugiere realizar comparaciones con otros métodos normalizados, preferiblemente que usen otro principio activo. En lo posible se debe usar materiales de referencia, estándares o muestras fortificadas. Métodos no normalizados Los métodos no normalizados son aquellos que no han sido publicados por fuentes autorizadas y/o validadas. Es muy probable que los métodos sin normalización no dispongan de datos de validación o estudios colaborativos fiables o suficientes, por esto se recomienda realizar una validación cuanto sea posible. Si el método sufre cambios se requerirá una re-validación del método. 4.1.2.2.

Según categoría de método [5]

Lo métodos también pueden clasificarse según el ámbito en el cual es usado, estos pueden agruparse en tres categorías generales: -

Categoría I: para la cuantificación de materia prima o principio activo en producto terminado. Categoría II: para determinar impurezas en materia prima o compuestos de degradación en producto terminado; o para análisis de residuos en material biológico o alimentos. Categoría III: para determinar las características de funcionamiento como disolución o liberación de droga en el organismo

4.1.3. Algoritmo de validación (aspectos logísticos) A continuación se ilustran los pasos a seguir y preguntas que se deben autorealizar el laboratorio antes de ejecutar un proceso de validación [6]: 4.1.3.1.

Principales preguntas a realizar

¿Quién debe llevar a cabo la validación del método? El laboratorio que usa un método es responsable de asegurar que este sea adecuadamente validado, y si es necesario realizar futuros trabajos para suplementar los datos existentes. Por ejemplo, cuando un método ha sido validado por una organización de aprobación de estándares, como la AOAC International, el laboratorio necesitará solo establecer los datos del rendimiento para el propio uso de un método especificado.

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¿Es posible una validación por estudio colaborativo o interlaboratorios? Si un método será desarrollado para tener un gran campo de acción, aunque sea un procedimiento estándar publicado, se recomienda el estudio colaborativo involucrando a otros grupos de laboratorio. Sin embargo, éste no es una opción muy adecuada para laboratorios industriales; en este caso se tiene que, desafortunadamente, los laboratorios posiblemente interesados en el método de análisis pueden pertenecer a la competencia. La validación de un método de forma aislada reduce la cantidad de datos que pueden alcanzarse para un método determinado. Es recomendable realizar interlaboratorios después de la validación y la debida documentación del método para comparar los datos obtenidos. POSTOBÓN S.A. tiene un protocolo de control de calidad por medio de interlaboratorios de calibración realizados cada 4 meses con los laboratorios de las plantas productoras, por lo que sería posible un análisis de comparación después de realizarse la validación del método, en este caso en la determinación de grados Brix. Aunque el uso de los métodos sea privado, estos deben poseer certificación de una autoridad reguladora competente, en el caso de POSTOBÓN S.A. sería ICONTEC, específicamente la Norma Técnica Colombiana 2714 y 17025; con éstas se busca estandarizar los métodos usados para análisis fisicoquímico y microbiológico en la industria de bebidas gaseosas, con su respectiva validación y respaldo metrológico. Es de anotar que The Association of Official Analytical Chemists (AOAC International) ha estado siempre a favor de pruebas interlaboratorio y propone este procedimiento como el mejor método para realizar la validación de métodos, incluso algunos de los métodos citados exponen datos de validación y parámetros estadísticos útiles como la desviación estándar y la exactitud de un método en particular. Estas validaciones son realizadas usando el método de validación por estudio colaboratorivo. En el caso de POSTOBÓN S.A. la validación del método concierne sólo al Laboratorio Central para su posterior uso privado en los laboratorios de las plantas productoras. 4.1.3.2.

Decisión del grado de validación requerido

El laboratorio de por sí debe decidir cuáles de los parámetros para la evaluación del rendimiento de un método se necesitan caracterizar, y así lograr una validación acertada que llene las expectativas requeridas.

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Los factores que definen el alcance de una validación son: -

Frecuencia de uso en el laboratorio: rutina diaria, esporádica, etc. Sector de uso del método (categoría del método) La existencia de validaciones previas realizadas por organizaciones para la estandarización del método, como la AOAC International. Restricciones de tiempo y costo.

Los lineamientos para la validación usados en un método deben ser acordes con el sector sobre el cual actúa, por ejemplo, la validación de un método de análisis en alimentos debe ser consistente con la estrategia de validación usada por la AOAC International. Esto será de gran ayuda ya que así se estarán describiendo los mismos factores bajo la misma terminología relevante al sector, en este caso, de alimentos. Además si se desea proyectar a futuro una validación por estudio colaborativo, resultará más fácil la transferencia del método. 4.1.3.3.

Requerimiento analítico

Se deben tener en cuenta los requerimientos analíticos que debe afrontar el laboratorio para evaluar o medir cierta propiedad en una muestra. Este debe estar de acuerdo tanto con la necesidad del cliente o de la empresa como con los recursos disponibles. Por esto inicialmente, los laboratorios deben realizar una investigación de los métodos normalizados existentes, y, si es necesario, desarrollar un nuevo método. Este procedimiento iterativo debe continuar hasta que el método cumpla con los requerimientos y no sean necesarias futuras modificaciones. El proceso iterativo descrito se puede observar más claramente en el diagrama que se presenta en la figura 2 [3].

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Figura 2. Diagrama de desarrollo, validación y ajuste de un método analítico

4.1.3.4.

Requerimientos relacionadas

analíticos

y

características

de

rendimiento

Como se mencionó en la sección anterior, en la validación de un método no es necesaria la evaluación de todas las características de rendimiento, esto depende de la documentación y bibliografía existente, y de las necesidades como tal del laboratorio. A continuación, tablas 1 - 3, se exponen los criterios a tener en cuenta para elegir que características son necesarias a evaluar, estos criterios se pueden clasificar en tres grupos: requerimiento analítico, nivel de normalización y categoría del método.

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Tabla 1. Parámetros de rendimiento relacionados según el requerimiento analítico Requerimiento analítico ¿Qué clase de respuesta se requiere, cualitativa o cuantitativa?

¿El analito está disperso o localizado? ¿El analito está presente en más de una forma, se está interesado en analito extraíble, libre o total? ¿Cuáles son los analitos de interés y a qué nivel se presentan (%, µg, ng, mg u otros)?

¿Qué tan preciso y reproducible debe ser la respuesta? ¿Qué grado de incertidumbre es permitido y como se expresará?

¿Cuál es la naturaleza química, biológica y física de la matriz? ¿Cuáles son las posibles interferencias? ¿Se requiere un muestreo y sub-muestreo y será este realizado en el laboratorio? ¿La muestra está sujeta a restricciones de tamaño o disponibilidad? ¿Existen restricciones de recursos humanos, tiempo, dinero, equipo, reactivos y/o medios del laboratorio? ¿Los resultados necesitan ser comparados con otros laboratorios?

Característica de rendimiento relacionada Confirmación de identidad Selectividad/especifidad Límite de detección Límite de cuantificación * Confirmación de identidad Recuperación Confirmación de identidad Límite de detección Límite de cuantificación Rangos de trabajo y linealidad Recuperación Exactitud/fidelidad Repetibilidad Reproducibilidad * Selectividad/especifidad * * *

Fortaleza/robustez Reproducibilidad ¿Los resultados necesitan ser comparados con especificaciones Exactitud externas? Reproducibilidad * En estos casos no todos los elementos de un requerimiento analítico están directamente relacionados con un parámetro de validación, algunos de estos determinarán de manera más general si la técnica en particular es práctica o no para su uso.

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Tabla 2. Parámetros a evaluar según el nivel de normalización del método [5] Tipo de método Método normalizado

A comprobar - Exactitud - Repetibilidad - Incertidumbre - Límite de detección (si la norma lo indica)

Modificación de un método normalizado

- Exactitud. - Repetibilidad. - Reproducibilidad

Método desarrollado por el laboratorio o No normalizado

- Exactitud. - Repetibilidad. - Reproducibilidad

Determinar - Rango - Linealidad - Recuperación - Robustez - Selectividad - Estabilidad (resistencia) - Reproducibilidad - Rango - Linealidad - Recuperación - Robustez - Selectividad - Estabilidad(resistencia) - Reproducibilidad - Selectividad/especifidad - Linealidad - Exactitud - Rango - Repetibilidad - Reproducibilidad - Estabilidad(resistencia) - Límite de detección - Límite de cuantificación - Recuperación - Robustez - Sensibilidad - Incertidumbre

Control - Realizar protocolo de control de calidad - Controles intralaboratorio - Participar de interlaboratorios - Realizar protocolo de control de calidad - Controles intralaboratorio - Participar de interlaboratorios - Realizar protocolo de control de calidad - Controles intralaboratorio - Participar de interlaboratorios

Tabla 3. Parámetros a evaluar según la categoría del método [5] Parámetro Categoría I Categoría II Categoría III Fortaleza Si Si * Selectividad Si Si Si Sensibilidad * * * Linealidad Si Si * Rango Si Si * Exactitud Si Si * Recuperación Si Si * Precisión Si Si Si Límite de detección No Si * Límite de cuantificación No Si * Estudio comparativo (interlaboratorio) * * * Robustez Si Si Si Incertidumbre Si Si Si * Se deja a criterio del laboratorio, realizar siempre y cuando sea posible su determinación según las restricciones del método.

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4.1.4. Parámetros de rendimiento y de caracterización del método En esta sección se describirán los parámetros que definen el rendimiento de un método, o en otras palabras, que ayudan a la caracterización de éste. En el presente proyecto se tendrán en cuenta los siguientes: - Robustez - Selectividad/especifidad - Linealidad - Exactitud - Intervalo de trabajo (rango) - Límite de detección - Límite de cuantificación - Estabilidad (resistencia) - Sensibilidad - Incertidumbre - Exactitud (recuperación o sesgo) - Precisión: - Repetibilidad - Reproducibilidad - Precisión intermedia - Incertidumbre 4.1.4.1.

Robustez

Una medida de que tan efectivo es un método analítico es saber la fiabilidad de los resultados obtenidos cuando no es ejecutado de forma ideal. En cualquier método siempre habrá etapas que no son efectuadas de manera cuidadosa, estas variaciones podrían traer efectos negativos en su rendimiento y es posible que el método no cumpla su objetivo. Estas etapas deben ser identificadas, y si es posible, también se debe evaluar la influencia sobre el rendimiento del método valorándose a través de pruebas de robustez, también llamado algunas veces rigidez. Esto conlleva a realizar variaciones de forma deliberada en el método e investigar los efectos subsecuentes en su rendimiento. Con estos resultados es posible identificar que variables afectan de manera significativa y por lo tanto, asegurar que cuando se haga uso de él, estas sean controladas de forma eficiente. La AOAC International define la robustez como la habilidad de un procedimiento analítico para tolerar pequeñas variaciones de las condiciones del procedimiento, especialmente en variables como: volumen, temperatura, concentración, pH, tiempo de extracción y configuración del instrumento analítico [7]. Generalmente la robustez es usada para estudiar el efecto de ciertas variables sobre la precisión y/o exactitud. 25

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Procedimiento para cálculo de robustez [5] -

Identificar los factores de variación Establecer los niveles de influencia Selección del diseño experimental Definición del protocolo de experimentos Ejecución de los experimentos y determinaciones Cálculo de efectos Análisis de varianza o prueba t para cuantificar la significancia del factor sobre la respuesta del método.

En la figura 3 se propone el algoritmo a seguir para evaluar la robustez de un método.

Figura 3. Algoritmo para la evaluación de robustez en un método analítico

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Diseño de experimentos El diseño de experimentos establece la metodología estadística sistemática para investigar la relación entrada-respuesta en alguno de los siguientes objetivos: -

Identificar variables o factores de diseño importantes Optimizar producción o métodos de análisis Realizar prueba de robustez.

El último objetivo es el de mayor importancia para este estudio en específico. En la investigación se tienen gran cantidad de tipos de diseño de experimentos, existen de tipo rudimentario como los análisis factoriales completos o aquellos que hacen uso de recursos computacionales para análisis de gran cantidad de datos. -

Diseño factorial completo: se recomienda este tipo de análisis factoriales para una cantidad baja de factores relevantes, entre 2, 3 ó 4 factores que requieren 4, 8 y 16 ensayos respectivamente. Este tipo de diseño tiene en cuenta las interacciones entre los factores y su cuantificación, pero tiene la gran desventaja que a mayor cantidad de factores el número de ensayos se eleva de manera exponencial.

-

Diseño factorial fraccional: un diseño factorial fraccional es un experimento donde sólo se escoge una fracción adecuada de todo el conjunto de combinaciones requeridas para un diseño factorial completo. Existen otros tipos de diseño que son optimizaciones de los anteriores, los más conocidos y recomendados para validación de métodos analíticos son los propuestos por Plackett-Burman [8] y Youden-Staider [9].

-

Diseño univariable: los análisis univariable, donde cada factor es evaluado individualmente y luego por análisis de varianza u otras pruebas estadísticas se determina su significancia, también son recomendados por la AOAC y IUPAC [10]; además son altamente efectivos cuando las interacciones entre factores son casi nulas. En este caso se realizan n+1 ensayos, donde el experimento adicional es el método efectuado al 100 %.

Ejecución de experimentos Se deben usar alícuotas o estándares de una misma solución y con una concentración conocida. Se recomienda realizar los experimentos de manera aleatoria o por bloques aleatorios, que consiste en analizar porciones del total de muestra periódicamente, con esto además se verifica el efecto del tiempo; sin embargo, cuando son muchas las variables la logística experimental puede resultar imposible, aún más cuando el equipo con el cual se valida tiene un tiempo de uso limitado. El tiempo es un factor determinante cuando ciertos accesorios del 27

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instrumento sufren cambios significativos, por ejemplo las columnas en un cromatógrafo. Cálculos de robustez [11], tabla 4. Tabla 4. Procedimiento general para evaluar la robustez Análisis Repeticiones Calculo Identificar las variables que Mínimo 9 Determinar el efecto pueden afectar medidas por cada (E) sobre la media para significativamente y realizar experimento. Un cada factor. diseño de experimentos. mínimo de tres factores. Realizar Análisis de Usar materiales de referencia o varianza y/o t contra un muestras de composición ensayo realizado al conocida (estándares). 100 % o contra el valor verdadero.

-

Comentarios Se recomienda el uso de diseño univariable.

Respuestas o mediciones corregidas

Cuando los experimentos son llevados a cabo en un periodo de tiempo largo, donde el equipo o las muestras pueden sufrir un cambio apreciable debido a la falta de estabilidad o desgaste de ciertas piezas en el instrumento, se recomienda realizar una corrección a las respuestas o determinaciones. Si las mediciones se ejecutan a tiempo equidistantes, estas pueden ser corregidas según la siguiente ecuación: 𝑦𝑖,𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 = 𝑦𝑖,𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 + 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜 −

𝑝+1−𝑖 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 +𝑖∗𝑦 𝑛𝑜𝑚 ,𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠 𝑝+1

(1)

Donde, 𝑖 = 1,2,3 … 𝑝: es el número del diseño en el tiempo 𝑦𝑖,𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 : respuesta corregida 𝑦𝑖,𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 : respuesta en el experimento 𝑖 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜 : el resultado nominal o medición a condiciones nominales al inicio de los experimentos (dadas por el método). 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 : resultado nominal antes del experimento 𝑖 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠 : resultado nominal después del experimento 𝑖 -

Cálculo de efectos

Los efectos son calculados a partir de las mediciones o respuestas corregidas. Para diseños factoriales se tiene la siguiente ecuación: 𝐸𝑋 =

𝑌(+) 𝑁(+)

−

28

𝑌(−) 𝑁(−)

(2)

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Donde, 𝐸𝑋 : el efecto del factor X (variable modificada) 𝑌(+): respuesta de la medición donde se efectuó el cambio en el factor X 𝑌(−): respuesta de las mediciones en las cuales no se efectuó el cambio en el factor X o el valor de dicho factor es bajo 𝑁(+): es el número de ensayos en los cuales se obtuvo 𝑌(+) 𝑁(+): es el número de ensayos en los cuales se obtuvo 𝑌(−) Los efectos también pueden ser normalizados o relativos a respuestas que corresponden a lecturas obtenidas a condiciones nominales, estas por lo general se promedian para obtener 𝑌. El efecto se expresar en forma relativa según la siguiente ecuación: 𝐸𝑋 % = -

𝐸𝑋 𝑌

∗ 100

(3)

Interpretación estadística

La interpretación estadística se centra en identificar la significancia de los efectos, normalmente se usa el estadístico t. Antes de usar este procedimiento se recomienda verificar la normalidad de los datos. 𝑡=

𝐸𝑋 𝑆𝐸 𝑒

↔ 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜

(4)

El estadístico 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 se calcula con un nivel de significancia 𝛼 = 0.05 y ocasionalmente 0.01 ó 0.1. Los grados de libertad son: 𝑅 =𝑛−2

(5)

Donde 𝑛 es el número total de mediciones en los dos ensayos. Cuando se realiza el mismo número de réplicas por cada experimento 𝑛 = 2𝑁 + = 2𝑁(−). -

Cálculo del error estándar

Se define 𝑆𝐸 𝑒 como el error estándar de un efecto. En experimentos de robustez esta variable puede ser estimada de varias formas: a partir de la precisión intermedia de cada experimento, por errores simulados o interacción de dos efectos, y por distribución de efectos (algoritmo de Dong). La forma más sencilla y práctica es usando la precisión intermedia, para este caso podemos usar la siguiente ecuación: 𝑆𝐸 =

𝑆𝑎2 𝑛𝑎

𝑆2

+ 𝑛𝑏

𝑏

29

(6)

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Donde 𝑆𝑎2 y 𝑆𝑏2 son las varianzas estimadas de los dos conjuntos de experimentos o efectos entre los cuales se está realizando la comparación y son obtenidas a partir de los datos 𝑌(+) y 𝑌(−). 𝑛𝑎 y 𝑛𝑏 son el número de mediciones realizadas, en este caso 𝑁(+) y 𝑁(−). De forma alternativa se puede usar la varianza propia del método que se obtiene en el cálculo de la precisión intermedia. La ecuación se transforma entonces en: 𝑆𝐸 =

2 𝑆(+)

2 𝑆(−)

2 𝑆𝑃𝐼

+ 𝑁(−) = 𝑁(+)

𝑆2

𝑃𝐼 + 𝑁(−) (7) 𝑁(+)

2 Donde 𝑆𝑃𝐼 es la varianza asociada a la precisión intermedia. Existen casos en los cuales la precisión intermedia es mucho menor a la precisión asociada al equipo de medición, en estos casos se recomienda tomar la precisión mayor.

Un efecto es considerado significante si su estadístico t a un nivel de significancia 𝛼 dado es mayor que 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 -

Pruebas de hipótesis usadas en el cálculo de robustez

Prueba F o ANOVA para comparación de varias medias: cuando se tienen varios niveles o concentraciones de factores que inciden en el valor a medir o se desea evaluar en qué rango es aplicable el método, inicialmente resulta más sencillo realizar un análisis de varianza (ANOVA) o prueba F suponiendo varianzas iguales, las hipótesis para esta prueba las podemos definir como: Ho: Todas las medias son iguales, 𝜇1 = 𝜇2 = 𝜇3 … = 𝜇𝑛 Hi: Al menos una media es distinta, 𝜇1 ≠ 𝜇2 ≠ 𝜇3 … ≠ 𝜇𝑛 La hipótesis nula se acepta si 𝐹 < 𝐹∝/2 𝑆𝑝2

𝐹 = 𝑆2 𝑒

𝑆𝑒2 = 𝛾𝑒 =

𝑛𝑖 𝑖=1

(8)

𝑛𝑘 2 𝑘=1 (𝑥 𝑖𝑘 −𝑥 𝑖 ) 𝑛𝑖 (𝑛 ) −𝑛 𝑖 𝑖=1 𝑘 𝑖

𝑛𝑖 𝑖=1(𝑛𝑘 )𝑖

− 𝑛𝑖 (10)

Donde, 𝑛𝑖 : número de conjuntos, número de medias. (𝑛𝑘 )𝑖 : número de medidas en el conjunto 𝑖 30

(9)

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2 𝑆𝑝2 = 𝑛0 𝑆𝑚𝑝 (11)

𝑛0 = 𝑛

1

𝑛𝑖 𝑖=1(𝑛𝑘 )𝑖

𝑖 −1

2 𝑆𝑚𝑝

=

𝑥𝑝 =

−

𝑛𝑖 (𝑛 𝑘 )𝑖 2 𝑖=1 𝑛𝑖 (𝑛 ) 𝑖=1 𝑘 𝑖

𝑛𝑖 (𝑥 −𝑥 𝑝 )2 𝑖=1 𝑖

𝑛 𝑖 −1 𝑛𝑖 (𝑛 ) 𝑥 𝑖=1 𝑘 𝑖 𝑖 𝑛𝑖 (𝑛 ) 𝑖=1 𝑘 𝑖

(12)

(13) (14)

𝛾𝑝 = 𝑛𝑖 − 1 (15) 𝐹∝/2 se lee de la distribución F de Fisher-Snedecor con 𝛾𝑝 y 𝛾𝑒 grados de libertad y a un nivel de significancia generalmente 𝛼 = 0,05. Prueba Chi-cuadrado para comparación de varianzas: cuando la prueba F nos indica que al menos hay una media distinta, se procede a realizar una comparación entre la mayor varianza calculada para una prueba en particular y la varianza teórica, esta última puede ser la reportada para el instrumento o un valor que se considere significativo dentro del laboratorio. Las hipótesis se pueden expresar como: Ho: La varianza de los datos es menor o igual que la reportada por el instrumento, 𝜍 2 ≤ 𝜍0 2 Hi: La varianza de los datos es mayor a la reportada por el instrumento, 𝜍 2 > 𝜍0 2 La hipótesis nula se acepta si

𝜒 2 ≤ 𝜒𝛼2 (16) 𝜒2 =

𝑛−1 𝑠 2 𝜍0 2

(17)

𝛾𝑒 = 𝑛 − 1 (18) 𝜒𝛼2 se lee de la distribución chi-cuadrado con grados de libertad 𝛾𝑒 y un nivel de significacia dado 𝛼 = 0,05. Después de efectuadas estas pruebas se calculan los efectos correspondientes a cada factor en los niveles de concentración dados.

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4.1.4.2.

Confirmación de identidad: selectividad/especifidad

Es necesario establecer que la señal producida u otra propiedad evaluada atribuida al analito, es debida solo a este y no por la presencia de otro compuesto química o físicamente similar. Esto se llama confirmación de identidad. La medida del analito dependerá de la efectividad con que este es aislado y de la selectividad/especifidad de la medida. En ocasiones las interferencias no se pueden separar del analito, por lo tanto cuando se analiza no se tiene conocimiento del aporte de la interferencia en la medida. Para evitar esto, se recomienda realizar un análisis de confirmación de identidad usando distintas técnicas, preferiblemente con principios activos diferentes. Estas interferencias no separables también pueden ser percibidas por una curva de calibración no lineal. Respecto a la diferencia entre selectividad y especifidad, aunque ambas son usadas en varias fuentes como si fueran el mismo parámetro, la especifidad es considerada como un término absoluto, es decir como una selectividad al 100 %, por lo que no se puede cuantificar o graduar. Por otro lado, algunos autores hacen referencia a la selectividad cuando se usa un método para determinación multicomponente, y especifidad para técnicas donde solo se analiza un compuesto pero en el cual existen otros tipos de sustancias o interferencias que también pueden aportar intensidad a la señal o magnitud medida. Para usos prácticos en este trabajo se usará la última diferenciación. En la selectividad/especifidad de un método se investiga la habilidad de medir el analito de interés, en porciones donde se ha añadido deliberadamente compuestos que provocan interferencias. También se puede determinar realizando lecturas en otros métodos y realizando una comparación entre éstos. En general la selectividad/especifidad se da de modo verbal y raramente de forma numérica como en el caso de análisis cromatográfico, donde existe la posibilidad de calcular coeficientes de selectividad. Klaus Danzer [12] propone una novedosa forma cuantitativa de medir la selectividad/especifidad para métodos multicomponentes y monocomponentes, a partir de varios ensayos usando distintas concentraciones del compuesto de interés y de las interferencias. Cálculo de selectividad/especifidad En un método ideal, la respuesta del ensayo debe ser sólo función de la especie a la cual se le está realizando la cuantificación, esto se puede expresar en forma de una función de la siguiente manera: 𝑦𝐴 = 𝑓(𝑥𝐴 ) (19) 32

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Donde 𝑦𝐴 es la señal o respuesta del compuesto A usada para su cuantificación, y 𝑥𝐴 es la concentración o cantidad de analito presente en la muestra. En casos reales esta señal o respuesta se debe en realidad a la influencia de varias señales, pertenecientes a la especia a cuantificar A y otros componentes, B, C,… J,…, N. La función queda definida como: 𝑦𝐴 = 𝑓(𝑥𝐴 , 𝑥𝐵 , … , 𝑥𝑁 ) (20) Asumiendo que las influencias son lineales, resulta la ecuación: 𝑦𝐴 = 𝑦𝑜 + 𝑆𝐴𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐴𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐴𝑁 𝑥𝑁 (21)

Para métodos de determinación multicomponente, puede expresarse de la siguiente manera: 𝑦𝐴 = 𝑦𝐴0 + 𝑆𝐴𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐴𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐴𝑁 𝑥𝑁 𝑦𝐵 = 𝑦𝐵0 + 𝑆𝐵𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐵𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐵𝑁 𝑥𝑁 𝑦𝐼 = 𝑦𝐼0 + 𝑆𝐼𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐼𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐼𝑁 𝑥𝑁 𝑦𝑁 = 𝑦𝑁0 + 𝑆𝑁𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝑁𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝑁𝑁 𝑥𝑁 (22) Los coeficientes 𝑆𝐼𝐽 se definen como la sensibilidad parcial de la respuesta para el componente I respecto al componente J. Debido a que en la mayoría de métodos a desarrollar y validar las determinaciones son monocomponentes, solo se describirá en detalle este modo de cálculo. La especifidad se valora entonces de la siguiente manera: 𝑠𝑝𝑒𝑐(𝐴/𝐵 … 𝑁) = 𝑆𝐴𝐴 𝑥𝐴

𝑁 𝐽 =𝐴

𝑆𝐴𝐽 𝑥𝐽 (23)

En ocasiones las sensibilidades parciales pueden ser negativas, es decir, tienen un efecto negativo en la señal/respuesta, por lo tanto en el cálculo se usan los valores absolutos de éstas sensibilidades parciales, permitiendo que la especifidad quede indicada en un rango {0… +1}. Como se puede observar en la anterior ecuación la especifidad depende de la concentración de las interferencias, en caso que estas no se conozcan o no se tenga un estimado, se usa un valor de 10 % 𝑥𝐴 .

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Por propósitos prácticos, se asume que valores de 𝑠𝑝𝑒𝑐 > 0.9 indican especifidad suficiente. De la misma forma valores menores a 0.9 demuestran poca especifidad del método. Las sensibilidades parciales se pueden hallar por regresión lineal múltiple (Gauss Jordan o mínimos cuadrados), analizando la respuesta de varias soluciones con diferentes cantidades del analito e interferencias, el diseño de experimentos para esta prueba se puede realizar bajo los lineamientos de descritos en la sección 4.1.4.1. Tabla 5. Procedimiento general para confirmación de identidad: selectividad/especifidad [3] ¿Qué hacer? Analizar las muestras y materiales de referencia por el método seleccionado y otros métodos independientes. Analizar muestras que contienen el analito y posibles interferencias fortificadas.

4.1.4.3.

Repeticiones 1

1

Cálculo/Determinación %Recuperación Exactitud Usar los resultados para confirmar la habilidad de la técnica en la identificación del analito. Especifidad o selectividad %Recuperación Selectividades parciales Examinar el efecto de las interferencias, que tanto inciden en la intensidad de la respuesta del método.

Criterio de aceptación Suficiente evidencia que soporta la fiabilidad del método

Los componentes no deben interferir en la cuantificación del analito. 𝑠𝑝𝑒𝑐 > 0.9

Limite de detección (LID y LDM)

Antes de describir el procedimiento para el cálculo de los distintos límites de detección es importante definir cuales límites existen y en qué caso aplican. A continuación se definen en orden ascendente según su magnitud [13]: Límite de detección instrumental (LDI): concentración que produce una señal 5 veces mayor a la relación señal/ruido del instrumento. Se puede definir como 1.645 veces la desviación estándar de la concentración que reporta un blanco. También es llamado nivel crítico. Límite inferior de detección (LID): se calcula como 2 ∗ 1.645𝑠, donde “𝑠” es la desviación estándar del blanco de análisis. Este se llama comúnmente “nivel de detección” y fija al 5 % los tipos de error I y II. Límite de detección del método (LDM): es la concentración obtenida de una muestra procesada con el método completo y la cual produce una señal con el 99 % de probabilidad de ser diferente al blanco. Esto se verifica realizando 7 réplicas, 34

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las cuales deben tener una media por arriba de 3.14𝑠, donde “𝑠” es la desviación estándar de las 7 réplicas Límite de cuantificación (LDC): es la concentración que produce una señal lo suficientemente grande que pueda ser detectada arriba del blanco. Típicamente es la concentración que produce una señal 10𝑠 arriba del blanco. Cuando se realizan mediciones en las cuales el analito está en bajas proporciones, por ejemplo, en el análisis de trazas, es importante saber cuál es la mínima cantidad de analito que puede medirse con la suficiente confianza por el método. Por lo anterior, es de anotar, que este parámetro se debe calcular para métodos que cuantifiquen trazas en una matriz dada, cuando el analito se encuentra entre los componentes mayoritarios no es necesaria la cuantificación de este valor. Aunque el término límite de detección no es muy aceptado, se usa en muchos trabajos y bibliografía relevante, sin embargo, la ISO usa generalmente el término "minimum detectable value of the net state variable" que hace referencia al valor mínimo detectable, al igual que la IUPAC. En la práctica los límites de detección más importantes son el LID y el LDM. El LDI generalmente lo reportan los fabricantes de equipos y en ocasiones es tan bajo que no sirve como criterio estadístico para afirmar la validez de una lectura. El límite de cuantificación (LDC) formalmente no es un "límite de detección" por lo tanto se calculará como un parámetro distinto. El cálculo para hallar el LID y LDM es casi idéntico, se diferencia en que para la determinación del LDM la muestra que contienen el componente de interés es procesadas a través de todo el método analítico mientras que para el cálculo del LDI solo se realizan lecturas a un blanco, el cual puede ser un estándar de baja concentración. La determinación del LID y LMD se hace de manera iterativa, y debe repetirse en caso de no cumplir con la condición final. Normalmente el LDM es mayor al LID. Procedimiento para el cálculo de LID y LDM [13] Cálculo del LID: -

Preparar una solución estándar a concentración casi cero pero conocida no superior a 5 veces el estimado para el LID, éste estándar hace las veces de “blanco”. Analizar 7 replicas de esta solución y calcular la desviación estándar “𝑠”. A partir de una tabla normal acumulativa multiplicar “𝑠” según:

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o Reducir probabilidad del error tipo I (detección falsa) al 5 %: 𝐿𝐼𝐷 = 1.645𝑠 (24) o Reducir probabilidad del error tipo II (no detección falsa) al 5 %: 𝐿𝐼𝐷 = 3.290𝑠 (25) -

Si la concentración conocida no está en el rango de uno a cinco veces el LID calculado para error tipo II se procede a realizar nuevamente las determinaciones partiendo de una concentración adecuada.

Cálculo del LDM: -

Preparar una solución o estándar de concentración conocida próxima al LDM estimado. Analizar 7 replicas de esta solución y calcular la desviación estándar “𝑠”. A partir de una tabla de distribución obtener el estadístico t desigual (una cola) para un nivel del 99 % y con 6 grados de libertad para este caso, y calcular: LDM = 3.14s (36)

-

Si la concentración conocida no es próximo al LDM calculado se procede a realizar nuevamente las determinaciones partiendo de una concentración adecuada.

Tabla 6. Procedimiento general para evaluar LID y LDM Análisis LID: análisis directo de un blanco al cual se le añade una cantidad conocida de analito tal que la concentración sea menor a 5 veces el valor estimado del LID. LDM: análisis de un placebo o matriz similar a las muestras usuales con concentración conocida igual a 5 veces el valor estimado del LDM. La muestra debe ser sometida al tratamiento completo especificado por el método.

Repeticiones 7 mediciones

Calculo Calcular la desviación estándar y el LID.

Comentarios

7 mediciones

Calcular la desviación estándar y el LDM.

Se realizar la determinación con mas réplicas, pero con la respectiva modificación del valor t.

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4.1.4.4.

Límite de cuantificación (LDC) y límite de cuantificación práctico (LCP)

El límite de cuantificación es estrictamente la concentración más baja del analito que puede ser determinada con un nivel de repetibilidad, precisión y exactitud aceptable, y produce una señal lo suficientemente grande como para distinguirse de un blanco. Si bien el LDC resulta de utilidad dentro de un laboratorio, es mayor la utilidad del límite de cuantificación práctica (LCP) definido como el nivel inferior registrable en los límites especificados a lo largo de operaciones rutinarias del laboratorio. Cálculo del LDC Existen dos formas básicas para la determinación del LDC [3]: A partir del blanco, solo cuando éste tiene una cantidad apreciable de analito, se procede de la siguiente manera: -

Analizar 10 réplicas del blanco sin adición de analito. Calcular la desviación estándar. Expresar el límite de cuantificación como: 10s

Es de anotar que conseguir un blanco representativo de las muestras usuales es difícil, por lo tanto existe el otro método para cuantificación del LDC. A partir del LDM: -

Fortificar alícuotas del un blanco a varias concentraciones del analito cercanas al LDM, en un mínimo tres concentraciones. Realizar 10 mediciones a cada concentración. Calcular la desviación estándar del analito a cada concentración. Graficar la desviación estándar contra la concentración y asignar un valor de LDM por inspección. Expresar el LDC como la menor cantidad del analito que se puede determinar con un nivel aceptable de incertidumbre, en este caso desviación estándar.

Pese a la rigurosidad del cálculo del LDC éste es un valor indicativo y no debería ser usado para tomar decisiones, por esto se define el límite de cuantificación práctico. Cálculo del límite de cuantificación práctico (LCP): El LCP puede obtenerse por experiencia directa con análisis realizados en el laboratorio, sin embargo se puede calcular un estimado donde el LCP es igual a 37

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cinco veces el LDM, este representa un límite de detección práctico y alcanzable de forma rutinaria con una certeza elevada de que los valores comunicados son fiables. Tabla 7. Procedimiento general para evaluar LDC y LCP Análisis LDC: blancos sin adición de analito

Repeticiones 10 veces

Calculo Desviación estándar y LDC

LDC: blancos con una concentración conocida de analito cercano al LDM

10 veces en mínimo 3 concentraciones.

Desviación estándar Graficar desviación estándar vs concentración LDC por inspección 5 veces el LDM

LPC (A partir de LDM): no necesita ningún análisis.

4.1.4.5.

Linealidad

Para los métodos cuantitativos es necesario determinar el rango de concentración del analito donde el método debe ser aplicado. La linealidad y rango son dos parámetros muy relacionados, sin embargo el rango se distingue de la linealidad en que éste toma en cuenta además la precisión y la exactitud de los valores obtenidos y por lo tanto se trabaja como un parámetro distinto. Sin embargo ambos se obtienen a partir del mismo grupo de ensayos. La evaluación de la linealidad es muy útil para determinar qué tipo de calibración es requerido en el uso rutinario del método, este nos puede definir tanto si la curva de calibración requiere solo un punto o tantos como sean necesarios para obtener una regresión adecuada, se recomienda aproximadamente 6 puntos de calibración [3], aunque esto depende en mayor medida del método y del instrumento a usar. La relación entre la respuesta del método y la concentración no debe ser necesariamente lineal, en caso de ser curva esta debería ser repetible en el transcurso del tiempo. Para análisis de drogas y sustancias en productos que tienen un valor nominal fijo y único, se recomienda la evaluación de linealidad en un rango de ± 20 ó ± 30 % del valor lineal tomando al menos 5 concentraciones [6,5]. Sin embargo para análisis de sustancias que están presentes en concentraciones desconocidas o que sólo están bajo la reglamentación de un máximo o mínimo requerido, por ejemplo en análisis de pureza, se debe determinar la linealidad en un rango determinado. Para este caso el valor más bajo será es el límite de detección o el 50 % del límite de cuantificación práctico [1], y el valor más alto, en cambio, dependerá de varios factores [1,3]:

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-

Máxima cantidad de analito en la muestra que puede llegarse a evaluar. Máxima señal/respuesta que pueden entregar los equipos o instrumentos usados en el método. 150 % del valor nominal en caso que exista.

En este último caso se recomienda evaluar la linealidad al menos en 10 concentraciones distintas. Debido a que en este proceso se desea tener la menor cantidad de factores sistemáticos que puedan influenciar y se debe tener controlado al máximo los errores aleatorios, se recomienda [5]: -

Realizar las mediciones de menor a mayor concentración. Esto elimina posibles efectos de memoria en el equipo. Las muestras deben prepararse a partir de estándares de concentración o pureza conocida. Los datos del estudio de linealidad servirían entonces también en la etapa del cálculo de recuperación y exactitud. La cantidad de repeticiones que se realizarán es función de la precisión del equipo o instrumento usado, y del número de mediciones que se realizarán de forma rutinaria a una misma muestra. En general se recomienda que estas repeticiones no sean menores a tres.

Existen dos formas de realizar un diagnóstico de linealidad, ambas útiles bajo ciertas condiciones: -

-

Los puntos de la curva se realizan a partir de soluciones preparadas con pesadas independientes, sin realizar sucesivas diluciones. Esto porque cuando se realiza una dilución, si el analito alcanza su límite de solubilidad, parte de este no estará disuelto y por lo tanto formará una respuesta no lineal. Sin embargo este procedimiento no es muy recomendable cuando se preparan soluciones de baja concentración ya que el error al pesar será relativamente mayor a bajas concentraciones. Esta metodología debe realizarse cuando las concentraciones son suficientemente altas. La otra forma de realizar la aproximación lineal es preparando soluciones a partir de alícuotas de una solución stock o estándar, así, es posible obtener concentraciones bajas en caso de ser necesarias en el análisis.

Evaluación estadística de la linealidad [14] A parte de la inspección visual preliminar que se debe realizar a la regresión lineal, es importante verificar estadísticamente la linealidad y la aleatoriedad de los valores residuales. Para realizar la evaluación estadística recurrimos a las siguientes fórmulas y criterios:

39

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-

Cálculo de la regresión lineal

Ecuación de la recta: 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 (27) Valor estimado para una concentración 𝑥𝑖 : 𝑦𝑖 = 𝑏𝑥𝑖 + 𝑎 (28) Valor residual: 𝑒𝑖 = 𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 (29) Término independiente: 𝑦 −𝑏

𝑎 = 𝑦 − 𝑏𝑥 = 𝑦=

𝑦 𝑛

,𝑥=

𝑥

𝑛 𝑥

(30)

(31)

𝑛

Pendiente: 𝑥−𝑥 (𝑦−𝑦 )

𝑏=

𝑥 −𝑥 2

(32)

Coeficiente de correlación: 𝑟=

𝑥−𝑥 (𝑦 −𝑦 ) 𝑥−𝑥 2

𝑦 −𝑦 2

(33)

Cálculo de la varianza residual: 2

𝑉𝑅𝐸𝑆 = 𝑆𝑦,𝑥 =

𝑦−𝑦 2 𝑛−2

1 − 𝑟2 =

𝑦2 −𝑎 𝑦−𝑏 𝑦𝑥 𝑛−2

Cálculo de la varianza de la pendiente: 𝑆𝑏2 =

𝑆𝑦2 ,𝑥

( 𝑥 )2 𝑛

𝑥2−

40

(35)

=

(𝑦𝑖 −𝑦𝑖 )2 𝑛−2

=

𝑒𝑖 2 𝑛−2

(34)

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Cálculo de varianza del término independiente: 𝑆𝑎2 = 𝑆𝑏2

𝑥2 𝑛

(36)

Para el análisis de linealidad se define entonces 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎, donde 𝑥 es la concentración teórica, 𝑦 la respuesta del equipo, 𝑏 el valor de la pendiente y 𝑎 la intersección con el eje 𝑦 o término independiente. La pendiente 𝑏, como se verá más adelante, está asociada a la sensibilidad del método, mayor pendiente significa mayor sensibilidad, por otro lado el término independiente 𝑎 está relacionado con el error sistemático del método, su significancia debe ser evaluada para determinar si el error sistemático es representativo. -

Coeficiente de correlación (𝑟) y determinación (𝑟 2 )

El coeficiente de correlación, 𝑟 nos indica el grado de relación entre la concentración y la respuesta, además es un estimado indirecto de la dispersión de los datos con relación a la estimación lineal. Cuando este parámetro se acerca a un valor de 1, indica una alta relación lineal entre ambas variables. Se recomienda un valor del coeficiente de correlación mayor a 0.999, aunque en el caso de impurezas este podría ser mayor a 0.990. El coeficiente de determinación, 𝑟 2 aporta una mayor significancia estadística ya que esta expresa como tal la variación total del modelo lineal. -

Varianza residual y homoscedasticidad

Al evaluar la homoscedasticidad de los valores residuales, se busca determinar si la variación de estos es aleatoria respecto al modelo lineal; este análisis aporta mucha información acercar de la validez del modelo. Para evaluarla se procede a graficar los residuales (eje y) respecto a los valores estimados (eje x). La distribución de los puntos debería ser aleatoria y no reflejar ninguna tendencia. -

Análisis de varianza (ANOVA) para la regresión lineal

Para efectuar la ANOVA se debe cumplir con los siguientes requisitos: o Homogeneidad de las varianzas o Normalidad de los residuales Homogeneidad de las varianzas: después de verificar la homoscedasticidad, es necesario corroborar la homogeneidad de las varianzas aplicando un método estadístico. La prueba más usada es la propuesta por Cochran que indicará si el factor de concentración tiene alguna influencia en la variabilidad de las respuestas. 41

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El valor del estadístico experimental se calcula de la siguiente forma: 𝐶𝐸𝑋𝑃 =

2 𝑠𝑚𝑎𝑥

𝑠𝑖2

(37)

2 Donde 𝐶𝐸𝑋𝑃 es el estadístico de Cochran, 𝑠𝑚𝑎𝑥 la máxima varianza de todos los 2 conjuntos de datos y 𝑠𝑖 las varianzas calculadas para cada conjunto de datos (réplicas de una misma concentración). El valor crítico del estadístico de Cochran 𝐶 lo determinan:

𝐶 = 𝐶(𝑘, 𝑣, 𝛼) (38) Donde 𝑘 es el número de grupos de datos o grupo de réplicas, 𝑣 el grado de libertad definido como 𝑛𝑚𝑎𝑥 − 1, donde 𝑛𝑚𝑎𝑥 es el mayor de los tamaños de muestra, y 𝛼 el nivel de significancia, usualmente 0.05. Con estos parámetros y la tabla de valores del estadístico de Cochran reportadas en el anexo A, se puede leer el valor crítico del estadístico. Si, 𝐶𝐸𝑋𝑃 < 𝐶 𝑘, 𝑣, 𝛼 significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir, que el factor concentración no influye estadísticamente en la variabilidad de los resultados. En caso que este requisito no se cumpla se puede proceder de la siguiente manera: -

Si la mayor variabilidad está ubicada en uno de los extremos, este punto debe excluirse y por lo tango reducir el rango lineal. Puede plantearse el análisis a otro nivel de concentraciones tal que las variaciones no sean significativas.

Test de normalidad: la distribución normal es una de las distribuciones teóricas más estudiadas, su importancia se debe fundamentalmente a que la frecuencia de distintas variables asociadas a fenómenos naturales y cotidianos se ajustan aproximadamente a esta distribución, sin embargo, puede resultar poco frecuente encontrar variables con este tipo de comportamiento. Muchos procedimientos estadísticos usados frecuentemente asumen la normalidad de los datos observados: correlaciones, regresiones, pruebas de hipótesis, análisis de varianza, entre otros. Aunque esta hipótesis puede obviarse cuando se disponen de un número suficiente de datos, se recomienda hacer el test para comprobar la normalidad de los datos. Cuando los datos no son normales se podrían ajustar a una distribución normal usando técnicas como las descritas en [15,16].

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Figura 4. Distribución normal y no normal.

En la figura 4 podemos observar a la izquierda una distribución normal perfecta, en cambio en la derecha una distribución alejada de la normalidad, en la cual las tres variables centrales no coinciden. Además de esta característica la distribución normal posee otras propiedades a tomar en cuenta [17]: -

Tiene una única moda, que coincide con su media y su mediana. La curva normal es asintótica al eje de abscisas. Por ello, cualquier valor entre ∞ y −∞ es teóricamente posible. El área total bajo la curva es, por tanto, igual a 1. Es simétrica con respecto a su media. Según esto, para este tipo de variables existe una probabilidad de un 50 % de observar un dato mayor que la media, y un 50 % de observar un dato menor. La distancia entre la línea trazada en la media (µ) y el punto de inflexión de la curva es igual a una desviación típica (𝜍). Cuanto mayor sea 𝜍, más aplanada será la curva de la densidad. El área bajo la curva comprendida entre los valores situados aproximadamente a dos desviaciones estándar de la media es igual a 0.95. La forma de la campana de Gauss depende de la media y la desviación típica. La media indica la posición de la campana. Por otra parte, la desviación estándar determina el grado de apuntamiento de la curva. Cuanto mayor sea el valor de σ, más se dispersarán los datos en torno a la media y la curva será más plana

La normalidad de los datos, en este caso los residuales, se puede comparar usando la representación gráfica o pruebas estadísticas robustas incluidas en algunos software. Entre los test más extendidos se encuentran el de KolmogorovSmirnov y Shapiro-Wilk. El test de Kolmogorov-Smirnov es el más extendido en la práctica [17], este compara la función de distribución de los datos con la distribución normal, y mide la máxima distancia entre ambas curvas. La prueba de Shapiro-Wilk, fue diseñada inicialmente para tamaños de muestra moderados y puede detectar desviaciones de la normalidad por asimetría o curtosis.

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En el software Origin Pro 8 se puede realizar el test de normalidad con una significancia del 0.05 y de forma rápida y precisa por los métodos KolmogorovSmirnov y Shapiro-Wilk. El procedimiento general para este análisis es: -

Introducir datos Seleccionar columna(s) Statistics/Descriptive Statistics/Normality Test/Open Dialog Seleccionar las pruebas Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov con parámetros estimados.

Habiendo realizado las anteriores pruebas y después de haber fijado la posibilidad o no de realizar un análisis de varianza a los datos de la regresión se procede al cálculo de la ANOVA, en la tabla 8 se sintetizan las ecuaciones usadas en este tratamiento estadístico. Tabla 8. Ecuaciones para el análisis de varianza en una regresión lineal Grados de Suma de cuadrados Varianza libertad Regresión Residual Falta de ajuste Error Experimental Total

𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 = 𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 = 𝑆𝐶𝐹𝐴 = 𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 = 𝑆𝐶𝑇 =

𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦)2

1

(𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2

𝑛−2

𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2

𝑘−2

(𝑦𝑖𝑗 − 𝑦𝑖 )2

𝑛𝑖 − 𝑘

(𝑦𝑖𝑗 − 𝑦 )2

𝑛𝑖 − 1

Estadístico

𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 1 𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 𝑉𝑅𝐸𝑆 = 𝑛−2 𝑆𝐶𝐹𝐴 𝑉𝐹𝐴 = 𝑘−2 𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 𝑉𝐸𝑋𝑃 = 𝑛𝑖 − 𝑘 𝑆𝐶𝑇 𝑉𝑇 = 𝑛𝑖 − 1 𝑉𝑅𝐸𝐺 =

Donde 𝑖: número del grupo 𝑗: número de la serie 𝑦: media de y 𝑥: media de x 𝑛: número total de lecturas 𝑛𝑖 : número de réplicas en un grupo 𝑘: número de grupos o concentraciones Relación entre sumas de cuadrados (𝑦𝑖𝑗 − 𝑦)2 =

(𝑦𝑖𝑗 − 𝑦𝑖 )2 +

𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2 +

𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦)2 (39)

𝑆𝐶𝑇 = 𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 + 𝑆𝐶𝐹𝐴 + 𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 (40) 𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 = 𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 + 𝑆𝐶𝐹𝐴 (41) 44

𝐹1 =

𝑉𝑅𝐸𝐺 𝑉𝑅𝐸𝑆

𝐹2 =

𝑉𝐹𝐴 𝑉𝐸𝑋𝑃

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𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 : suma de cuadrados debido a la regresión 𝑉𝑅𝐸𝐺 : varianza de la regresión 𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 : variación residual debida al error experimental dentro de los grupos más la variación debida a la falta de ajuste. 𝑉𝑅𝐸𝑆 : variación residual 𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 : cálculo del error experimental (suma de cuadrados debido a las réplicas dentro de las mismas series). 𝑉𝐸𝑋𝑃 : varianza del error experimental 𝑆𝐶𝐹𝐴 : cálculo del error de regresión o de falta de ajuste (se debe a la dispersión de resultados entre los valores de la recta de regresión y las medias de cada grupo) 𝑆𝐶𝑇 : suma de los cuadrados total Una vez comprobados los supuestos y calculados los estadísticos 𝐹1 y 𝐹2 se procede a verificar las siguientes hipótesis: 𝐹1,𝑒𝑥𝑝 > 𝐹1,𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 demuestra la existencia de una pendiente distinta a 0. 𝐹2,𝑒𝑥𝑝 < 𝐹2,𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 demuestra la linealidad entre los resultados obtenidos. Los valores F se obtienen de las tablas de Fisher-Snedecor de acuerdo a los grados de libertad correspondientes y a un grado de significancia de 0.05. Test de verificación de la pendiente: con este test se busca corroborar la significancia estadística de la pendiente, esto se logra calculando el intervalo de confianza para la pendiente según la ecuación: 𝑏 ± 𝑡 ∗ 𝑠𝑏 (42) Donde, 𝑡 es el valor de la distribución de student para 𝑛 − 2 grados de libertad y un nivel de significancia de 0.05. Este intervalo no debe de incluir el valor cero para considerar la pendiente significativa. Test de verificación del intercepto: esta prueba es similar a la anterior, pero en este caso tenemos la ecuación: 𝑎 ± 𝑡 ∗ 𝑠𝑎 (43) El estadístico 𝑡 se calcula de igual manera, y se concluye que la ordenada es estadísticamente significativa si el rango incluye el valor cero. En caso de no cumplirse el test sería necesario interpolar el resultado del análisis de cualquier muestra entre al menos dos estándares, uno superior y otro inferior. De esta forma se obvia el sesgo del método.

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Tabla 9. Procedimiento general para evaluar la linealidad y el rango de trabajo Análisis Blanco y materiales de referencia, ó blancos fortificados a varias concentraciones

¿Cuántas veces? 3 cada punto

¿Qué calcular?

Comentarios

Graficar medida de respuesta (y) contra la medida de concentración (x)

De forma ideal en este paso las muestras deberían ser preparadas de forma independiente y no de alícuotas o del mismo patrón, esto dará confirmación visual de si el rango de trabajo es lineal o no.

Examinar visualmente para identificar el rango de trabajo.

Se necesita al menos 6 puntos distintos Materiales de referencia o blancos fortificados al menos en 10 puntos distintos.

3 cada punto

Graficar la medida de respuesta (y) contra la medida de concentración (x). Examinar visualmente puntos atípicos que no deberían estar presentes en la regresión. Calcular coeficiente de regresión apropiado. Calcular y graficar los valores residuales (diferencia entre el valor actual y el valor predicho por la ecuación de la recta para cada valor de x). Distribución aleatoria alrededor de la línea confirma linealidad. Tendencias sistemáticas indica no linealidad.

4.1.4.6.

En este paso es necesario confirmar la linealidad del rango de trabajo tanto visual como estadísticamente. Es poco seguro eliminar datos atípicos sin antes realizar verificaciones en cercanías a dicho punto. En ciertas circunstancias puede ser necesario usar una regresión a una curva no lineal. No se recomienda el uso de polinomios mayores al orden cuadrático.

Rango

Proceder de igual forma que en el análisis de linealidad, a diferencia de este, calcular además la precisión y la recuperación en cada nivel de concentración. Para el cálculo de rango de trabajo se recomienda usar el definido por el mínimo valor y el máximo valor aportados por los análisis usuales que se realicen dentro del laboratorio. Restringir entonces el rango donde los valores de precisión y exactitud están dentro de lo especificado en los criterios de aceptación [3]. 4.1.4.7.

Sensibilidad

La sensibilidad es el gradiente de la curva de respuesta (respuesta vs concentración), es decir, el cambio en la respuesta de un instrumento que corresponde a un cambio en la concentración del analito, en otras palabras, es la 46

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pendiente de la curva de calibración. Cuando un método tenga una pendiente más alta que otro, se dice que el primero es más sensible. La IUPAC define la sensibilidad de forma más técnica como "El cambio en la respuesta de un instrumento dividido por el correspondiente cambio del estímulo (señal de entrada)." Cuando se ha establecido linealidad en la curva de respuesta este parámetro es constante, sin embargo en métodos no lineales existen valores para distintos rangos de concentración. La sensibilidad en ocasiones es referida al límite de detección pero esto en general no es aceptado [3]. Cálculo de la sensibilidad La sensibilidad es, entonces, la pendiente de la curva de calibración respuesta vs concentración 𝑑𝐺

𝑆 = 𝑑𝐶 (44) Donde G es la señal de respuesta y C la concentración, para curvas de calibración altamente lineales el valor de sensibilidad es único en el rango especificado. Para rangos más amplios se tiene en ocasiones que la respuesta es no lineal y, por lo tanto, se hace necesario el cálculo de la sensibilidad a una concentración específica usando la derivada de una ecuación polinómica. En estos casos la sensibilidad depende de la concentración y se debe especificar este parámetro en cada nivel evaluado en la regresión. Pasos para cálculo de sensibilidad: -

Preparar estándares a diferentes concentraciones, mínimo 3 puntos para respuestas lineales y mínimo 5 para polinómicas, preferiblemente usando alícuotas de una misma solución. Analizar las muestras y graficar la curva de calibración. Realizar una regresión lineal o polinómica según el caso. Registrar la pendiente para una regresión lineal, o las derivadas evaluadas para cada punto de la calibración.

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Tabla 10. Procedimiento general para evaluar la sensibilidad [3] Análisis Analizar estándares a diferentes concentraciones (mínimo 3 para respuestas lineales, mínimo 5 para respuestas polinómicas)

4.1.4.8.

Repeticiones Tres mediciones por estándar

Calculo Promedio de cada respuesta Gráfica Respuesta vs concentración Regresión lineal o polinómica Pendiente (lineal) o derivada evaluada en cada concentración (polinómica)

Comentarios No es recomendable realizar aproximaciones polinómicas mayores a grado 2.

Precisión

La precisión de un procedimiento analítico expresa el nivel de concordancia o grado de dispersión entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestras homogéneas bajo condiciones prescritas [1]. Se evalúa mediante análisis de réplicas, análisis repetidos de un estándar estable o análisis de adiciones conocidas sobre las muestras. La precisión indica la variabilidad de un método de ensayo y expresa en que rango es aceptable la variación de una misma muestra a condiciones reales, dato que posteriormente es usado como condición de criterio para la aceptación o rechazo de análisis. En la precisión pueden considerarse tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad [5]. En la figura 5 podemos observar de manera más clara la organización jerárquica de estos niveles. Precisión

Intra

Repetibilidad

Inter

Precisión intermedia

Reproducibilidad

Instrumental

Método

Figura 5. Jerarquía de los niveles de precisión.

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La precisión de un método analítico por lo general se expresa como la varianza, desviación estándar o coeficiente de variación de una serie de mediciones. Repetibilidad: expresa el nivel de concordancia de los datos bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo. La repetibilidad también se conoce como precisión intra-ensayo. Precisión intermedia: expresa la variación dentro de un mismo laboratorio: a diferentes días de análisis, distintos analistas, distintos equipos, etc. Reproducibilidad: indica la precisión entre laboratorios, usualmente se lleva a cabo con ayuda de estudios colaborativos o interlaboratorios. La precisión y exactitud a menudo son conceptos que pueden confundirse, para una mejor apreciación de lo que significa cada una podemos analizar la figura 6:

Figura 6. Diferencia entre exactitud y precisión

En la tabla 11 se exponen los factores que inciden en el estudio de repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad [5]: Tabla 11. Factores que inciden en la precisión Factor Instrumento Tiempo entre análisis Analista Laboratorio Otros factores (reactivos, condiciones ambientales, etc.)

Repetibilidad Igual Igual Igual Igual

Precisión intermedia Diferente Diferente Diferente Diferente

Reproducibilidad Diferente Diferente Diferente Diferente

Igual

Igual

Diferente

49

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Otros factores que influyen son los siguientes: -

Humedad y temperatura ambiental Instrumentos de características diferentes o diferentes tecnologías Variación de detalles experimentales no especificados en el método Equipos de diferente antigüedad Electrodos o columnas de cromatografía de diferentes lotes y/o proveedores Disolventes y reactivos de diferente calidad

Procedimiento para el cálculo de repetibilidad y reproducibilidad por análisis "r y R" a partir de un interlaboratorio Para el cálculo de la repetibilidad y reproducibilidad se recurre a la Norma Técnica Colombiana 3529 [18], la cual describe los procesos y cálculos para la determinación de la precisión de métodos de ensayo. La reproducibilidad como tal estima la variabilidad de los resultados inter-laboratorios. El objetivo principal es verificar que distintos laboratorios proporcionan los mismos resultados. El factor "r" calculado a partir de la desviación estándar a condiciones de repetibilidad, es un criterio de aceptación que permite al analista decidir si la diferencia entre análisis duplicados de una misma muestra, determinada bajo condiciones de repetibilidad, es significativa [3]. El factor "R" al igual que su homólogo "r", permita al analista saber si la diferencia entre análisis duplicados es significante bajo condiciones de reproducibilidad [3]. Modelo estadístico: en la estimación de la precisión de un método de ensayo, es útil asumir que cada resultado de un ensayo es la suma de tres componentes: 𝑦 =𝑚+𝐵+𝑒 En donde, 𝑚: promedio general 𝐵: variación entre laboratorios 𝑒: error aleatorio presente en cada ensayo o intra-laboratorio En este caso el valor 𝑚 no es necesariamente igual al valor real y en caso que sea distinto se denomina su diferencia como el sesgo del método de ensayo y no aporta significancia en el estudio de precisión. El término 𝐵 se puede considerar como la suma de los componentes sistemáticos y de los componentes aleatorios, el término 𝑒 representa el error aleatorio 50

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presente en todo resultado de un ensayo, sin embargo asumiendo que las distribuciones del error son normales, se puede esperar que la variación generada por este error tenga valores diferentes en los distintos laboratorios, sin embargo, se asume que tales diferencias deben ser pequeñas y se establece un valor común para la varianza intra-laboratorio. Cálculo 𝑝: número de laboratorios 𝑛𝑖 : número de replicas para el laboratorio 𝑖 𝑦𝑖 : promedio de la medición para el laboratorio 𝑖 𝑠𝑖 : desviación estándar para el laboratorio 𝑖 𝑠𝑟 : desviación estándar de repetibilidad 𝑠𝐿 : desviación estándar que incluye variabilidades entre-operarios y entre-equipos 𝑠𝑅 : desviación estándar de reproducibilidad 𝑇1 =

𝑛𝑖 𝑦𝑖 (45)

𝑇2 =

𝑛𝑖 𝑦𝑖 2 (46)

𝑇3 =

𝑛𝑖 (47)

𝑇4 =

𝑛𝑖 2 (48)

𝑇5 = (𝑛𝑖 − 1)𝑠𝑖2 (49) 𝑇

5 𝑠𝑟2 = 𝑇 −𝑝 (50) 3

𝑠𝐿2 =

𝑇2 𝑇3 −𝑇1 2 𝑇3 (𝑝−1)

− 𝑠𝑟2

𝑇3 (𝑝−1) 𝑇3 2 −𝑇4

𝑠𝑅2 = 𝑠𝑟2 − 𝑠𝐿2 (52) 𝑇

𝑚 = 𝑇1 (53) 3

𝑟 = 2 2 𝑠𝑟2 (54) 𝑅 = 2 2 𝑠𝑅2 (55)

51

(51)

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Procedimiento para cálculo de repetibilidad y precisión intermedia usando el coeficiente de variación -

Repetibilidad

La determinación de la repetibilidad se basa en una serie de replicas realizadas bajo las mismas condiciones y en un intervalo de tiempo corto, se recomiendan un mínimo de 9 mediciones en total y un mínimo de 3 niveles de ensayo, ó 6 determinaciones a una concentración nominal [19]. El estudio de repetibilidad en el rango de trabajo es importante ya que generalmente la desviación estándar relativa o coeficiente de variación aumenta al disminuir la concentración del analito, aunque la desviación estándar como tal puede ser directamente proporcional a la concentración. La ICH (International Conference on Harmonization) recomienda reportar tanto los coeficientes de variación como los intervalos de confianza para nivel de concentración analizado. Cálculo de coeficiente de variación 𝑆

𝐶𝑉(%) = 𝜇 ∗ 100 (56) Donde, 𝑆: es la desviación estándar 𝜇: media aritmética de los resultados Cálculo de Intervalo de confianza El intervalo de confianza para el promedio se calcula con el estadístico t de student: 𝑥±𝑡∗

𝑠 𝑛

(57)

Donde, 𝑥: promedio se la serie de resultados 𝑠: desviación estándar 𝑛: número de mediciones 𝑡: estadístico t de Student con 𝑛 − 1 grados de libertad y 𝛼 = 0.05 A cada uno de los tipos de repetibilidad, instrumento y método, se les realiza el mismo tratamiento matemático para obtener el CV y el intervalo de confianza: Repetibilidad del instrumento: se calcula a partir de mediciones repetidas realizadas a una muestra homogénea que ha pasado por todo el proceso del 52

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método, es decir, realizar mediciones a la misma muestra como tal y no réplicas de ella. El número mediciones en este ensayo está condicionado por la cantidad de muestra que destruye el equipo en su determinación. Se recomienda de 6 a 10 veces. Repetibilidad del método: a diferencia del ensayo anterior, en este caso se parte de alícuotas de una misma muestra homogénea y se les realiza todo el procedimiento indicado de forma individual, se analizan de forma independiente como si fueran réplicas de una misma muestra y con un mismo analista. Tal como lo propone la ICH se recomiendan mínimo 9 mediciones para un total 3 niveles de concentración (3 mediciones por nivel). La repetibilidad del método debe ser mayor a la repetibilidad del instrumento, su relación teórica está dada por la ecuación propuesta por Carporal-Gautier [5]: 𝐶𝑉𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜 = 2𝐶𝑉𝑖𝑛𝑠𝑡𝑟𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 -

(58)

Precisión intermedia

Con la precisión intermedia se busca evaluar la variabilidad del método usado en un mismo laboratorio pero a condiciones operativas distintas, los factores a modificar incluyen el día de análisis, analista, instrumento, entre otros. Se recomienda un diseño matricial y aleatorio, para muestras preparadas de forma independiente, mínimo por triplicado para cada factor y un mínimo de 9 determinaciones en total, la precisión intermedia se calcula entonces como el coeficiente de variación global de todas las respuestas obtenidas o la respectiva desviación estándar. El criterio de aceptación de la precisión intermedia está dado por: 𝐶𝑉𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖𝑜𝑛

𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎

< 2 ∗ 𝐶𝑉𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑

𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜

(59)

Si este no se cumple se debe estudiar qué factor generó la variabilidad en el estudio de precisión intermedia, esto se hace calculando el CV para cada grupo de análisis, por ejemplo en un equipo especificado o para un analista en particular. En la tabla 12 se puede apreciar el modelo propuesto para el análisis de la precisión intermedia en un laboratorio con dos analistas y dos instrumentos, en un rango de tres días, se recomienda que los estándares o patrones se lean mínimo por triplicado. Prueba F para comparación de varianzas: antes de realizar cualquier análisis con los datos suministrados para el cálculo de la precisión intermedia, se debe verificar que los analistas tienen varianzas similares, esto se logra con la prueba F 53

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o ANOVA descrita en los cálculos de robustez, si son sólo dos analistas se verifica con una forma especial de la prueba F: Las hipótesis a comprobar son: Ho: Las varianzas son iguales, 𝜍1 = 𝜍2 Hi: las varianzas son distintas, 𝜍1 ≠ 𝜍2 Teniendo las varianzas de dos conjuntos de datos se calcula: 𝑆2

𝐹 = 𝑆12 (60) 2

La hipótesis nula se acepta si 𝐹1−∝/2 ≤ 𝐹 ≤ 𝐹∝/2 (61) 𝐹∝/2 y 𝐹1−∝/2 se leen de la distribución F de Fisher-Snedecor con 𝛾1 y 𝛾2 grados de libertad y un nivel de significancia generalmente 𝛼 = 0,05. Tabla 12. Diseño matricial genérico propuesto [5] Instrumento A Instrumento B

Analista X Analista Y Analista X Analista Y

Día 1 Día 1 Día 1 Día 1

Día 2 Día 2 Día 2 Día 2

Día 3 Día 3 Día 3 Día 3

Tabla 13. Procedimiento general para evaluar la precisión Análisis "r y R" usando una muestra preparada, estándar o muestra típica de análisis.

Repeticiones 9 repeticiones como mínimo en un mínimo de 3 laboratorios

Calculo R, r y m

Repetibilidad (método e instrumento) usar estándares o muestras preparadas con concentración conocida. Precisión intermedia

9 repeticiones en 3 niveles de concentración

CV e intervalo de confianza

3 por analista por día y por cada instrumento. Un total mínimo de 9 determinaciones.

CV de instrumento, y analista.

4.1.4.9.

Comentarios Se recomienda realizarlo en mínimo 2 niveles de concentración.

Se recomienda realizarlo en mínimo 2 niveles de concentración.

Exactitud

Según la ICH la exactitud de un procedimiento analítico expresa el acercamiento entre el valor admitido como valor verdadero o como una referencia aceptada y el valor encontrado [19]. También es llamada en algunos casos fidelidad. En el 54

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método de validación se busca con el cálculo de la exactitud valorar conjuntamente los efectos sistemáticos y aleatorios, y está muy ligado con la precisión, incluso algunos autores [3] dividen la exactitud en dos componentes: fidelidad y precisión. Para no crear confusiones, en este estudio se tomará la exactitud como fidelidad o trueness y la precisión será un factor independiente, aunque no aislado. Se recomienda que la exactitud se calcule después de que la precisión, linealidad y especifidad hayan sido establecidas. Existen dos procedimientos en general para determinar la exactitud de un método. El primero y más común es realizar la comparación contra un material de referencia, que puede ser un estándar trazable, un placebo o una muestra con una cantidad de analito conocida. El segundo método es comparar los resultados con otra técnica aún más exacta o que por consenso común es referencia, este caso se usa cuando no existen materiales de referencia certificados o trazables. En la figura 7 se puede observar la anterior clasificación en forma de diagrama. Material de referencia o analito puro Valor de Referencia

Placebo + analito

Exactitud Método Validado o de referencia

Muestra + analito

Figura 7. Procesos para cálculo de exactitud.

El uso de materiales de referencia o estándares está dado según los siguientes criterios: -

Material de referencia o patrones certificados: se usan para validación de métodos a largo plazo. Su uso no es extensivo. Estándares: utilizados en los cálculos de exactitud a corto plazo, verificaciones y estudios no críticos.

Interpretación de la parcialidad o sesgo La figura 8 muestra los dos componentes principales de la parcialidad en la medición de una muestra, referida al laboratorio y al método como tal. La parcialidad del método reside en el error sistemático inherente al mismo 55

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independiente del laboratorio que lo use. La parcialidad del laboratorio proviene de los errores sistemáticos peculiares del laboratorio y la interpretación del método.

Figura 8. Componentes del sesgo en una medida

En la figura 8 la parcialidad de laboratorio y parcialidad del método se muestran como si actuaran en la misma dirección, aunque se puede tener el caso contrario. Cálculo de la exactitud -

Comparación con un valor de referencia

La exactitud normalmente es dada en términos de porcentaje de recuperación, calculada como la razón entre el resultado y la cantidad conocida de analito adicionada a la muestra o valor del patrón, aunque también puede expresarse solo como la diferencia entre ambos valores. La ICH recomienda usar más de 9 mediciones en un mínimo de 3 niveles de concentración dentro del rango específico, es decir, un mínimo de 3 determinaciones por cada nivel [19]. Se debe calcular entonces el promedio de las mediciones de una misma concentración y su respectiva desviación estándar, y usar este promedio en el cálculo de la recuperación. Es de anotar que en ocasiones es difícil adquirir materiales o soluciones de referencia a distintos niveles de concentración, cuando esto suceda se deben realizar los análisis en la mayor cantidad de concentraciones posibles. En el análisis de exactitud respecto a un valor referencia se pueden usar tres tipos de muestra: o Método aplicado a un material de referencia o analito puro: se realizan sucesivas mediciones y se realizan los cálculos de % de recuperación con 56

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la media. Si hay suficientes datos realizar una prueba de hipótesis para comparación de media y un valor real. o Método aplicado a un placebo: se prepara un placebo que contiene todos los ingredientes menos el analito, es decir, que sea la misma matriz. A este se agregan cantidades conocidas de analito, mínimo tres niveles y tres repeticiones a cada uno. Se calcula la recuperación. Este método puede presentar cierto grado de incertidumbre y constituye solo una aproximación a la muestra en casos reales. o Método de adición de patrón: este método se usa cuando no es posible fabricar un placebo que no contenga el analito. En este caso una cantidad conocida de este es adicionado a una muestra, se evalúan mínimo tres niveles de concentración dentro del rango de trabajo y un mínimo de tres réplicas. Se determina la concentración del analito inicial en la muestra y la aportada por la cantidad agregada, se calcula la recuperación respecto al valor teórico. -

Comparación con un método validado o de referencia [5]

En esta metodología se comparan los resultados obtenidos con el método analítico que se quiere validar y los logrados con el método de referencia, cuya exactitud esté bien determinada. Ambos métodos deben ser independientes. Se realizan mediciones repetidas, un mínimo de 10 veces en cada nivel de concentración, y al menos en tres concentraciones distintas dentro del rango de trabajo. Calcular la recuperación de cada punto y realizar una prueba de hipótesis para comparación de una media con un valor verdadero. Esto indicará si existen diferencias entre ambos métodos y si la concentración influye en las mediciones. Cuando hay suficientes niveles de concentración evaluados, más de 20, se puede realizar la comparación con un análisis de regresión: en el eje 𝑥 (abscisas) se representan los promedios de cada nivel de concentración hallados con el método de referencia y en la ordenada los promedios encontrados para cada punto del método a evaluar. La línea resultante ideal es una recta de 45°, o en otras palabras una ecuación de recta 𝑦 = 𝑥. La regresión se realiza en los puntos dados y se obtiene una ecuación de la forma 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 A partir de esto pueden evaluarse varios aspectos: -

Si la línea resultante es curva, los métodos conducen a resultados distintos y el grado de diferencia es dependiente de la concentración. Si la pendiente de la línea es b = 1 o cercano a este, teniendo como criterio de aceptación el intervalo de confianza calculado con la desviación estándar de la 57

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-

pendiente y un 𝛼 = 0,05 bilateral, indica que ambos métodos son proporcionales. El intercepto con el eje debe ser a = 0, tener como criterio de aceptación el intervalo de confianza calculado a partir de la desviación estándar del término independiente y un 𝛼 = 0.05 bilateral. Cuando la pendiente y el término independiente están dentro de lo permitido, se dice que los métodos son equivalentes.

Ecuaciones usadas en el cálculo de la exactitud: Porcentaje de recuperación %𝑅 =

𝑥𝑚 𝜇

(62)

Diferencia o sesgo 𝑆𝑒𝑠𝑔𝑜 = 𝑥𝑚 − 𝜇 (63) Donde, 𝑥𝑚 : es el promedio de las mediciones de una determinada concentración 𝜇: valor aceptado como verdadero El cálculo de la regresión lineal se hace de la misma manera que en la sección 4.1.4.5. Tabla 14. Procedimiento general para evaluar la exactitud Análisis Analizar la muestra/referencia por el método a validar

Repeticiones Un mínimo de 3 veces por nivel, y 9 determinaciones en total como mínimo.

Cálculo Promedio y desviación estándar por nivel de concentración. Si hay suficientes datos realizar una prueba de hipótesis para la media. Comparación por recuperación y diferencia.

58

Comentarios El criterio de aceptación depende mucho del tipo de análisis y uso que se le dé, en general se acepta una recuperación de 100 ± 3 % cuando se realizan con materiales de referencia y 100 ± 5 % con estándares.

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Analizar la muestra/referencia por el método a validar y un método independiente preferiblemente validado o primario.

Un mínimo de 10 veces por nivel.

Promedio y desviación estándar por nivel de concentración. Comparación por recuperación y diferencia. Y análisis de regresión si hay suficientes datos

Métodos independientes tienen parcialidades por su propia cuenta por lo tanto esta exactitud es relativa y no absoluta. Métodos primarios idealmente no tienen parcialidad por lo que son mejores para realizar las medidas de exactitud. Se tiene un criterio de aceptación de 100 ± 5 %

Dar una medida relativa de la parcialidad del método.

4.1.4.10. Incertidumbre La incertidumbre se define como un "parámetro asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que pueden ser atribuidos razonablemente a lo que se mide" [20] La incertidumbre de una medición puede estar asociada a muchas fuentes, entre las principales se encuentran: el instrumento de medida, el objeto de medida o mesurando, condiciones ambientales (humedad relativa, presión y temperatura) y el analista. Estas incertidumbres se calculan realizando un análisis estadístico de un conjunto de mediciones a condiciones controladas y/o a partir de otras fuentes fiables como certificados y fenomenología del proceso de medición. La incertidumbre es un parámetro asociado generalmente con la calidad de la medición, y hace referencia a la duda que existe respecto al resultado de la medición, pero no respecto a la validez del proceso de medida. Al contrario, el conocimiento de la incertidumbre aumenta el nivel de confianza de la validez del método. Es de vital importancia no confundir el error o exactitud del método con su incertidumbre, el error expresa la diferencia entre el valor medido y el valor convencionalmente verdadero que se está midiendo, mientras que la incertidumbre es la duda asociada al resultado. La organización A2LA propone un procedimiento para estimar la incertidumbre en laboratorios con la intención de facilitar la conformidad con la ISO/IEC 17025 [21]. La estimación de la incertidumbre puede realizarse bajo cuatro métodos generales según las políticas de esta norma: 59

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-

Pruebas cualitativas y semicuantitativas basadas en respuestas continuas o cuantitativas. A partir de muestras control del laboratorio Usando datos provenientes de la validación Identificación de todos los componentes de incertidumbre

En el presente proyecto resulta práctico el uso de los análisis de muestras control o datos derivados de la validación: A partir de muestras control del laboratorio (MCL) Existen ciertos requisitos que deben cumplirse para el uso de las muestras control en el cálculo de la incertidumbre: -

-

-

Las MCL deben pasar por todos los pasos del método, entonces el laboratorio puede usar la desviación estándar (𝑆𝐷𝑃 ) como una precisión intermedia en el estimado de la incertidumbre estándar combinada. Cuando las MCL no han sido corridas bajo todos los pasos del método, el laboratorio debe incorporar los componentes adicionales o consideraciones apropiadas en el cálculo de la incertidumbre usando el método de sumas cuadradas y combinándola con el 𝑆𝐷𝑃 . Cuando se conoce que el método tiene un sesgo consistente y que es inherente a este (por ejemplo, bajas recuperaciones en analitos difíciles), el sesgo no debe añadirse a los cálculos de incertidumbre, sin embargo debe quedar claramente establecido y reportado.

Se recomienda usar más de 20 datos individuales de MCL para estimar el 𝑆𝐷𝑃 . El estimado de la incertidumbre combinada se expande usando la fórmula: 𝑈 = 𝑘 ∗ 𝑆𝐷𝑃 (64) Donde 𝑘 (factor de cobertura) es igual a 2 (para 95 % de confianza) asumiendo distribución normal. Si se usan menos de 20 datos, el factor de cobertura estará dado en términos del estadístico 𝑡 para un nivel de significancia del 95 % y a los respectivos grados de libertad. Si las muestras control se encuentran a diferentes concentraciones y agrupadas en conjuntos, el estimado 𝑆𝐷𝑃 se calcula así: 𝑉𝑃 =

𝑆𝐶𝑃 𝑛 𝑖 −𝑘

(𝑥 𝑖𝑗 −𝑥 𝑖 )2

=

𝑛 𝑖 −𝑘

60

(65)

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𝑆𝐷𝑃 =

𝑉𝑃 (66)

Donde, 𝑉𝑃 : varianza de las muestras control 𝑆𝐶𝑃 : suma de cuadrados de cada grupo 𝑥𝑖 : promedio de un grupo de datos pertenecientes a una misma concentración o de un ensayo en específico. 𝑖: número de grupo 𝑗: número de una réplica dentro de un grupo 𝑛𝑖 : número de réplicas en un grupo 𝑘: número de grupos o concentraciones Se recomienda, además, para el uso de éste método de cálculo, demostrar la competencia del laboratorio según las directrices descritas en el próximo apartado, y haciendo en las ecuaciones 𝑆𝐷𝑃 = 𝑆𝐷𝑅 como estimado de la incertidumbre estándar. Aunque no es estrictamente necesario si no hay datos de validación disponibles. Usando los datos provenientes de la validación También es posible usar datos adquiridos en un proceso de validación, pero antes el laboratorio debe demostrar su competencia con el método, tal y como lo determinan los siguientes criterios. El laboratorio debe reportar una desviación estándar para reproducibilidad (interlaboratorios) o precisión intermedia (intralaboratorio), 𝑆𝐷𝑅 , como un estimado de la incertidumbre estándar combinada bajo las siguientes condiciones: -

El estudio de validación debe incluir todas las fuentes de incertidumbre (incluyendo preparación de la muestra y analistas diferentes) El laboratorio debe tener un sesgo aceptable. El laboratorio debe tener una repetibilidad aceptable.

Para demostrar la competencia con el método, el laboratorio debe calcular la desviación estándar del laboratorio 𝑆𝐷𝐿 como la diferencia cuadrática entre reproducibilidad y repetibilidad 𝑆𝐷𝑟 , del estudio de validación:

𝑆𝐷𝐿 =

𝑆𝐷𝑅 2 − 𝑆𝐷𝑟 2 (67)

61

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El laboratorio se considera competente si: -

Su sesgo debe es menor a 2 ∗ 𝑆𝐷𝐿 La repetibilidad intra es menor a 𝐹 ∗ 𝑆𝐷𝑟 , donde 𝑆𝐷𝑟 es la repetibilidad dada por un estudio colaborativo en caso de haberse realizado. 𝐹 debe tomarse de una tabla estadística F usando los grados de libertad apropiados y bajo un 95 % de confianza, sin embargo, el laboratorio puede usar un estimado de 1.5.

Si el estudio de validación no incluye todos los pasos del método, entonces las incertidumbres estándares de estos pasos deben añadirse al 𝑆𝐷𝑅 usando el método de sumas cuadradas. El estimado de la incertidumbre combinada (usualmente 𝑆𝐷𝑅 ) es expandido usando la siguiente fórmula: 𝑈 = 𝑘 ∗ 𝑆𝐷𝑅 (68) Donde 𝑘 (factor de cobertura) es igual a 2 (para 95 % de confianza) asumiendo distribución normal.

4.2.

EQUIPOS Y PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

4.2.1. Densímetro: DMA 58 Anton Paar 4.2.1.1.

Especificaciones y condiciones de operación del equipo

Tabla 15. Resumen de especificaciones del densímetro [22] Propiedad Fabricante Modelo Exactitud (Densidad) Exactitud (°B) Rango de exactitud (densidad)

Valor Anton Paar DMA 58 3 ± 0.00001 g/cm 0.01 °B

Rango de exactitud (°B)

0.00 - 0 - 79.3° B

Rango de lectura Precisión Tamaño de muestra Rango de temperatura Precisión sensor de temperatura Rango de presión Dígitos display Automuestreador

0 - 3 g/cm3 ± 0.000005 g/cm3 0.7 cm3 -10 a 70 °C

0.5 - 1.5 g/cm

Comentario

3

Los grados Brix corresponden a una densidad de 0.99829 y 1.40660 g/cm3

± 0.01 °C 0 - 10 bars 7 dígitos 24 viales

SP3 Anton Paar

62

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Tabla 16. Condiciones de operación del densímetro: Temperatura ambiente Humedad relativa

15 a 35 °C 10 a 90 %RH

Figura 9. Esquema del sistema para medir densidad

4.2.1.2.

Teoría de operación [22]

El densímetro DMA 58 determina la densidad (masa dividida por volumen) de líquidos y gases midiendo el período de oscilación electrónica. Para esto, la muestra es introducida en un sistema el cual oscila y cuya frecuencia natural es influenciada por la masa de la muestra. Este sistema está formado por un tubo en U el cual es excitado por vibración oscilatoria por medios electrónicos (ver figura 10). El volumen de oscilación es limitado por los puntos de montaje los cuales están fijos. Manteniendo el volumen constante entonces se asume que la masa de la muestra es proporcional a su densidad. Si el oscilador es llenado mas allá de los puntos de montaje no hay ningún efecto en la medición. 63

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Asumiendo que la temperatura es constante, generalmente 20.00 °C, la densidad puede ser calculada a partir del periodo de oscilación considerando un cuerpo hueco de masa m suspendida de un resorte de constante k. El volumen V del cuerpo hueco se llena con la muestra de densidad ρ. La frecuencia natural del sistema masa-resorte es: 1

𝑓 = 2𝜋

𝑘 𝑚 +𝜌𝑉

(69)

Y el periodo sería 𝑚 +𝜌𝑉

𝑇 = 2𝜋

𝑘

(70)

Despejando obtenemos 𝑘

𝜌 = 𝑇 2 4𝜋 2 𝑉 −

𝑚 𝑉

(71)

Usando la abreviación 𝑘

𝐴 = 4𝜋 2 𝑉 (72) 𝐵=

𝑚 𝑉

(73)

Se llega a 𝜌 = 𝐴𝑇 2 − 𝐵 (74)

Figura 10. Esquema del proceso de medición en un densímetro tipo tubo en U

Las constantes A y B incluyen la constante del resorte, la masa del tubo en U vacío y el volumen de la muestra inyectada en el tubo. A y B son, por lo tanto, 64

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constantes propias del instrumento y dependen de cada oscilador. Estas constantes pueden hallarse de las medidas de dos periodos cuando el oscilador ha sido llenado con sustancias de densidad conocida, normalmente aire y agua. Mientras más densa es la muestra, más amortiguadas son las oscilaciones. La densidad de la muestra es, según la ecuación, inversamente proporcional al cuadrado de la frecuencia de liberación, o en otras palabras proporcional al cuadrado del periodo de oscilación. Para el oscilador presente en el equipo DMA 58 la relación proporcional entre la diferencia de densidad y la diferencia del cuadrado del periodo nos da una exactitud de ±0.00001 g/cm3 para una densidad en el intervalo de 0.5 y 1.5 g/cm3 si las constantes fueron determinadas usando aire y agua. Se asocia un error aleatorio o repetibilidad de ±0.000005 g/cm3. Debido a que este instrumento no diferencia entre los tipos de sólido disueltos se debe asegurar que la matriz no posea otras sustancias en proporciones relevantes que aporten a la densidad de la muestra. Es por esto que en el densímetro sólo se realiza medición a jarabes terminados de baja concentración o producto terminado libre de CO2 y en ausencia de sólidos no disueltos. Otra característica derivada de esta propiedad es que la escala para Brix es única tanto para directo como para invertido. 4.2.1.3.

Calibración

La calibración o determinación de las constantes A y B se efectúa con aire deshumidificada y agua destilada. Se realizan dos verificaciones con estándares a 12.00 °B directo y 12.63 °B invertido. El procedimiento de calibración se realiza según lo descrito en el manual del equipo. La calibración a una temperatura en particular es válida para 100 días. Densidad del aire: La densidad del aire en g/cm3 depende principalmente de la presión en mbar y temperatura en °C. A t °C y p Torr la densidad se calcula usando: 0.0012930

p

ρ = 1+0.00367 t 760 = g/cm3 (75) Este cálculo es válido para un contenido de CO2 en el aire de 0.03 % en volumen.

65

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Tabla 17. Composición del aire seco N2 78.09 75.52

%Volumen %Masa

O2 20.95 23.15

Ar 0.93 1.28

CO2 0.03 0.05

Ne 0.0018 0.0013

He 0.0005 -5 7 x 10

Kr 0.0001 0.0003

X -7 8 x 10 -5 4 x 10

H2 -5 5 x 10 -4 4 x 10

En el laboratorio central, con una presión 680 torr y una temperatura de 20 °C controlada internamente en el equipo se obtiene: 𝜌𝑎𝑖𝑟𝑒 = 0.00101 𝑔/𝑐𝑚3 (76) Densidad del agua: La densidad del agua en kg/m3 depende en mayor medida de la temperatura, el equipo controla la temperatura a 20.00 ± 0.01 °C por lo tanto a estas condiciones se tiene: 𝜌𝑎𝑔𝑢𝑎 = 0.99820 𝑔/𝑐𝑚3 (77) Cálculo de las constantes de calibración: (𝜌 −𝜌 )

𝐴 = (𝑇 12 −𝑇22 ) (78) 1

𝐵=

2

(𝑇2 2 𝜌 1 −𝑇1 2 𝜌 2 ) (𝑇1 2 −𝑇2 2 )

(79)

𝜌: densidad 𝑇: periodo Los índices 1 y 2 indican el periodo o la densidad del primer y segundo estándar respectivamente. 4.2.1.4.

Conversión a grados Brix

Los densímetros dan la respuesta en valores de densidad. Los grados de Brix son entonces derivados de tablas de sacarosa estándar, tales como las reportadas por National Bureau of Standards (NBS) o actualmente National Institute of Standards and Technology (NIST) [23]; y de ecuaciones de conversión desarrolladas a partir de estas tablas, o para nuestro caso las disponibles en la normatividad interna de POSTOBÓN S.A. [24]. El equipo posee un software interno que realiza esta conversión.

66

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4.2.1.5. -

Posibles causas de error del instrumento

Burbujas dentro de la muestra a medir El equipo recibe la luz del sol directa Error de calibración Iluminación de la celda de medida encendida Sedimentos dentro de la celda La muestra no llena los puntos de montaje del tubo U Calibración con sustancias coloidales o muestras coloidales Retener mucho tiempo muestras coloidales dentro del tubo Condensado debido a una alta humedad del aire y baja temperatura de la celda

La medida de la densidad es afectada por la viscosidad de la muestra, sin embargo el equipo DMA 58 tiene compensación por viscosidad, esta opción se mantiene activa para todas las mediciones.

4.2.2. Refractómetro: RFM 340 Bellingham Stanley Éste refractómetro perteneciente a la serie RFM300 es un instrumento autónomo y fácil de usar que puede emplearse en aplicaciones de laboratorio e industriales. Dispone de un prensador abatible que puede colocarse sobre la muestra en el prisma. El objetivo del prensador es forzar el contacto con las muestras, mejorando las condiciones para la medición. Éste modelo está equipado con un controlador de temperatura y una camisa interna de agua (ver figura 11) [25].

Figura 11. Esquema del lector para el refractómetro

67

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4.2.2.1.

Especificaciones y condiciones de trabajo del equipo

Tabla 18. Resumen de especificaciones del refractómetro Propiedad Fabricante Modelo Escala Índice de refracción °B para azúcar Resolución IR Resolución °B Precisión IR Precisión °B Exactitud °B Tipo de prensador Tiempo de lectura Intervalo de temperatura ambiente Precisión sensor de temperatura Estabilidad de temperatura Material Prisma IR Prisma Compensación automática de temperatura Comprobación de estabilidad de temperatura Intervalo de humedad ambiente Sonda de temperatura

4.2.2.2.

Valor Bellingham Stanley RFM 340 1.32 - 1.54 0 - 95 0.00001 0.01 ± 0.00003 ± 0.03 ± 0.03 Poliacetilo Mínimo 4 segundos 0 - 40 °C ± 0.03 °C ± 0.05 °C Zafiro artificial 1.7686

Comentario

5 - 70 °C

Activa

Ninguna Tiempo de retardo Repetibilidad inteligente < 80 %RH Prisma Prensador

Ninguna para análisis en laboratorio central Tiempo de retardo para análisis en línea Se activa la medición de temperatura por el prisma.

Teoría de operación [26, 27]

La luz viaja en el vacío a casi 300 000 km/s, sin embargo, esta baja su velocidad en medios transparentes tales como aire, agua y vidrio. La proporción por la cual disminuye su velocidad se conoce como el índice de refracción del medio, y es siempre mayor que la unidad. El índice de refracción se denota como n. n = (Velocidad de la luz en el vacío) / (Velocidad de la luz en la sustancia) (80) Tabla 19. Relación entre algunos medios y el índice de refracción Medio

Índice de refracción

Vacío Aire Hielo Agua Vidrio

1.0000 1.0003 1.31 1.33 1.50

68

Velocidad de la luz en el medio 299792 km/s 299703 km/s 228849 km/s 225408 km/s 199862 km/s

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Un refractómetro es un aparato de medición diseñado para determinar esta variación en la velocidad de la luz. Para visualizar cómo se mide el índice de refracción podemos considerar lo siguiente: Primero se debe visualizar la luz como rayos. Cuando estos rayos al emerger del agua alcanzan el aire, cambiará su dirección, o en otras palabras son refractados. Los rayos de luz también serán parcialmente reflejados. Este cambio de dirección también puede ser observado de manera inversa cuando la luz ingresa al agua viniendo de aire, en este caso los rayos son refractados desde el "lado del aire". Como se observa en la figura 12, la luz incidente corta este círculo a una distancia b de la luz normal reflejada a una distancia a.

Figura 12. Geometría de la refracción

Si el ángulo bajo el cual la luz alcanza la superficie del agua cambia, b cambiará, así como también a, pero su razón no lo hará: a/b = Constante (81) Para la luz amarilla a 20 °C esta constante es 1.333. De lo indicado arriba se puede ver que b tiene un máximo a un punto específico. Si los rayos de luz que emergen del agua golpean la superficie de frontera en un ángulo aún más bajo, no serán refractados, sino completamente reflejados. 69

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En la figura 13 se pueden ver los efectos de los rayos de luz golpeando la superficie de frontera en ángulos diferentes.

Figura 13. Esquema de refracción a distintos ángulos

En esta figura se pueden ver nueve rayos. Cinco de estos son parcialmente reflejados y parcialmente refractados, los otros son totalmente reflejados. Debido a esto existe una línea de frontera (línea roja) entre lo brillante, área totalmente reflejada, y lo no tan brillante, área parcialmente reflejada. Esta línea de frontera describe un ángulo específico, que se conoce como ángulo crítico de reflexión total. El valor de este ángulo crítico depende de los índices de refracción de los dos materiales. Matemáticamente esta relación es descrita por la ley de Snell que, en vez de las líneas a y b, usa los ángulos 𝛼1 y 𝛼2 con respecto a la normal respectivamente. En ésta ley los índices de refracción en los dos medios 𝑛1 y 𝑛2 son incluidos: 𝑛1 ∗ 𝑠𝑒𝑛 𝛼1 = 𝑛2 ∗ 𝑠𝑒𝑛(𝛼2 ) (82) Lo siguiente aplica al ángulo crítico: 𝛼𝐺 = 𝑠𝑒𝑛−1 (𝑛1 /𝑛2 ) (83) La constante indicada arriba para luz viajando de agua a aire, representa la relación entre los índices de refracción de agua y aire. A partir de la fórmula puede verse que una reflexión total solamente ocurrirá si la luz ingresa a un medio con un 70

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índice de refracción más bajo (el seno inverso no está definido para valores mayores que uno) [27]. La mayoría de los refractómetros se basan en el efecto del ángulo crítico, que define el punto de equilibrio o límite de sombra entre la refracción y el reflejo interno total de la luz en una interfaz prisma/muestra. El índice de refracción deriva de la geometría de la vía óptica y el índice de refracción del material del prisma. Los refractómetros automáticos usan un circuito integrado de luz (una matriz de autobarrido, ver figura 14) para detectar la posición exacta del límite [28].

Figura 14. Esquema de medición en un refractómetro con autobarrido

El índice de refracción aumenta con los sólidos disueltos totales, por lo tanto cualquier sustancia disuelta (azúcar, sal, ácido) contribuirá en el índice de refracción. Los sólidos insolubles, tales como pulpas o polvo de té no contribuirán significativamente al índice de refracción. En la figura 15 se aprecia claramente el fenómeno en un caso muy común.

Figura 15. Efecto de la concentración de azúcar en el índice de refracción

71

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Efecto de la temperatura: para medir Brix, es esencial que la dependencia con la temperatura se tome en consideración. Una solución de 30 g de sacarosa en 100 g de solución tiene la misma concentración en azúcar tanto a 20 °C como a 40 °C. Por esta razón la solución debería dar 30 Brix, independiente de la temperatura. Pero como los índices de refracción cambian con la temperatura, una escala de Brix también debe tomar en cuenta la temperatura para poder calcular el valor correcto. Por obvias razones, establecer un valor de Brix "no corregido por temperatura" no tiene sentido, ya que depende de la temperatura de referencia. Por lo tanto, para mediciones exactas, la corrección por temperatura es muy importante. Existen tablas reportadas por ICUMSA que muestran la corrección que se debe realizar al efectuar la lectura a una temperatura distinta de 20 °C, en un rango de 15 °C a 40 °C [29]. Por extrapolación se pueden obtener una corrección incluso para 10 °C. Los materiales de referencia usualmente vienen con certificados que reportan valores para el índice de refracción y grados Brix a varias temperaturas, como ejemplo se pueden observar las tablas de los patrones usados en este estudio (anexo B) 4.2.2.3.

Calibración

El equipo tiene la opción de realizar calibraciones con uno o dos puntos, normalmente los valores zero y span. El valor zero corresponde al valor de 0 °B en este caso agua destilada que posee un índice de refracción de 1.333. El span por lo general es un valor que cubre el rango de medición en el cual se realizarán las mediciones, generalmente 12 °B directo o 12.63 °B invertido para lectura de gaseosas y producto terminado, y 60 °B en el caso de lectura en jarabes o producto semi-terminado 4.2.2.4.

Conversión de unidades

La respuesta del refractómetro está dada como índice de refracción asociada a una temperatura por compensación. Esta lectura la convierte a grados Brix directo o invertido dependiendo de la escala a la cual se desea imprimir en la pantalla del refractómetro. Esta conversión la realiza usando polinomios de grado 5. 𝑢 = 𝐴 + 𝐵𝑥 + 𝐶𝑥 2 + 𝐷𝑥 3 + 𝐸𝑥 4 + 𝐹𝑥 5 (84) Donde 𝑢: lectura en unidades definidas por el usuario 𝑥: índice de refracción – 1.33 A, B, C, D, E, F: constantes polinómicas

72

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-

Grados Brix directo a partir de un índice de refracción a 20 °C

El instrumento tiene incorporado su propia tabla de conversión y no es posible observar las constantes polinómicas que usa, sin embargo se ha comprobado que la conversión es equivalente a la tabla dada por AOAC 2005 Apéndice C, p 78: concentración de sacarosa acuosa como función del índice de refracción medida a 20 °C [7]. -

Grados Brix Invertido a partir de un índice de refracción a 20 °C

Se han ingresado manualmente los parámetros expuestos en la tabla 20 para dicho polinomio, este arroja resultados equivalentes a los datos reportados por ICUMSA [30]. Tabla 20. Coeficientes para regresión polinómica de grados Brix invertido a partir del índice de refracción Constante A B C D E F

4.2.2.5. -

Valor -2.12283 715.89 -1813.93 5412.71 -12959.5 20235.6

Posibles causas de error del instrumento

Prisma en mal estado: rayado, empañado, roto. Compensación por temperatura desactivado Poco tiempo para estabilizar la temperatura Desecador en mal estado Realizar lecturas con mucho tiempo de retardo, especialmente si tiene sólidos no disueltos. Error de calibración Matriz con alto contenido de sólidos no disueltos o muy heterogénea.

4.3.

EL AZÚCAR

4.3.1. Definición El término azúcar o azúcares en el ámbito industrial y científico se usa para designar los distintos monosacáridos y disacáridos, que generalmente tienen sabor dulce, y en ocasiones designa a cualquier tipo de carbohidrato soluble en 73

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agua. Por convención en el presente estudio se define el azúcar como el disacárido conformado por alfa-glucosa y beta-fructosa unidos por un enlace glicósido, o sacarosa. 4.3.2. Propiedades fisicoquímicas y composición Su nombre químico es β-D-fructofuranosil-(2→1)-α-D-glucopiranósido con fórmula molecular C12H22O11. Es un azúcar no reductor y por lo tanto no reacciona con el reactivo de Fehling o el reactivo de Tollens. La sacarosa se presenta generalmente como un polvo fino, blanco, inodoro y cristalino de un sabor dulce agradable. Se aísla generalmente de fuentes naturales sin embargo su síntesis química fue alcanzada por primera vez en 1953 por Raymond Lemieux [31]. La sacarosa es un producto intermedio principal de la fotosíntesis, en muchas plantas constituye la forma principal de transporte de azúcar desde las hojas a otras partes de la planta. En las semillas germinadas de plantas, las grasas y proteínas almacenadas se convierten en sacarosa para su transporte a partir de la planta en desarrollo. La sacarosa es estable al aire pero en polvo se torna higroscópica, absorbiendo hasta el 1 % de humedad. Es fermentable a concentraciones altas (aprox. 17 % en peso), resiste a la descomposición bacteriana. Funde a 186 °C para formar caramelo y al hacer combustión produce carbón, dióxido de carbono, y agua.

Glucosa

Fructosa

Figura 16. Estructura química de la sacarosa

Peso molecular: 342.296 g/mol Densidad: 1.587 g/cm³, estado sólido Solubilidad en agua: 203.9 g/100 mL (20 °C) 4.3.3. Usos comerciales y producción La sacarosa es el edulcorante más extendido industrialmente, aunque en los últimos años ha sido reemplazado en parte por otros que tienen un mayor poder endulzante y son de bajas calorías. Es usada principalmente en la industria de alimentos debido a su poder endulzante y sus propiedades funcionales; es 74

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importante en la preparación de muchos productos alimenticios, como dulces, bebidas, tortas, entre otros. También ayuda en la preservación de los alimentos. En la nutrición humana, la sacarosa es asimilada fácilmente como macronutriente que proporciona una rápida fuente de energía para el cuerpo, y provoca un rápido incremento en los niveles de glucosa en la sangre con su ingestión. Su consumo excesivo está ligado a algunos efectos adversos, como la caries dental y caída de dientes. La sacarosa es el principal azúcar presente en los vegetales, se extrae generalmente de la caña de azúcar (Saccharum officinarum L) la cual tiene entre 8 y 15 % de sacarosa, o de la remolacha azucarera (Beta vulgaris L). El jugo obtenido de la molienda de la caña se concentra y cristaliza al evaporarse el agua por calentamiento. Los cristales formados son el azúcar crudo o, de ser lavados, el azúcar blanco. En las refinerías el azúcar crudo es disuelto, limpiado y cristalizado de nuevo para producir el azúcar refinado [26]. Tipos de azúcar [24]. El azúcar se clasifica generalmente por su grado de refinamiento el cual, generalmente, se expresa de manera visual debido al color característico que presenta. El color está relacionado indirectamente con el porcentaje de sacarosa que contienen los cristales. -

Azúcar moreno: se obtiene de la caña de azúcar, en su producción no se somete a refinación, solo es cristalizado y centrifugado. Su color se debe a una capa de melaza que cubre los cristales de azúcar. Tiene entre 96 a 98 % de sacarosa.

-

Azúcar rubio: es más claro que el azúcar moreno, y tiene un porcentaje mayor de sacarosa.

-

Azúcar blanco: tiene 99.5 % de sacarosa, también se le denominada azúcar sulfitado.

-

Azúcar refinado o extrablanco: es altamente puro y tiene entre 99.8 a 99.9 % de sacarosa. No es tan integral como el azúcar rubio o blanco, ya que en su proceso de refinamiento se desechan algunos nutrientes complementarios como minerales y vitaminas, que son consideradas impurezas.

-

Azúcar de licor fino: corresponde al obtenido en el primer ciclo en el proceso de producción del azúcar refinado, y no se somete a recirculación a diferencia de éste último. Tiene una mayor pureza ya que presenta menor cantidad de cenizas sulfatadas y tiene mejores propiedades fisicoquímicas. 75

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Usos del azúcar en Postobón S.A. [24]: -

Azúcar blanco: se usa como edulcorante en la preparación de refrescos de fruta. Azúcar refinado: usado como edulcorante en la elaboración de gaseosas Azúcar de licor fino: componente utilizado en hidratantes y té.

4.4.

BRIX

4.4.1. Generalidades Brix es uno de los parámetros más importantes encontrados en la industria de bebidas. De forma estricta el Brix es usado para indicar la cantidad de sólidos disueltos en una solución. En la industria de bebidas, es usado específicamente para cuantificar la cantidad de azúcar en una bebida, jarabe o refresco. La escala de Brix fue establecida en el siglo XIX por el químico alemán A.F.W. Brix. Él encontró que al sumergir un hidrómetro en un jugo de fruta, se podía conocer, a partir de su densidad, el porcentaje de azúcar presente en el jugo. En este estudio se define Brix como el porcentaje peso-peso de azúcar disuelta en una solución acuosa y se expresa como grados Brix (°B). Por ejemplo, una solución de 10 °B implica que una solución de 100 g tiene 10 g de azúcar disuelta. Es de aclarar, que en una bebida gaseosa o refresco, hay, además del azúcar, otros sólidos disueltos. Sin embargo, estos se encuentran en pequeñas cantidades si la comparamos con el contenido de azúcar, aunque contribuyen ligeramente en la medición de grados Brix. Por conveniencia se considera que esta contribución también es debida al azúcar, el error asociado individualmente a los otros componentes disueltos para las distintas formulaciones se acepta sobre una base universal y es ignorado en la mayoría de los casos, además los parámetros definidos para los productos como tal se reportan incluyendo esta desviación causada por otros componentes disueltos. En conclusión, para el análisis como tal de grados Brix, en el ámbito industrial, se asume que la bebida es una solución pura de sacarosa en agua [32]. Las bebidas gaseosas tienen un rango de Brix típico entre 8 y 14 °B, sin embargo para su preparación es necesario el uso de soluciones concentradas denominadas jarabes. En el proceso se hace distinción entre jarabe simple y jarabe terminado. El jarabe simple es aquella solución madre que posee solo azúcar y agua, y tiene aproximadamente 61 °B; esta es usada, por medio de una dilución para obtener el jarabe terminado el cual tiene además de azúcar el resto de componentes propios de un producto, excepto gas carbónico. Este tipo de jarabe, aún concentrado, tiene un Brix que depende de la huella técnica del producto y su rango típico es entre 35 y 60 °B. 76

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4.4.2. Medición de grados Brix Existe gran variedad de formas para medir la cantidad de sacarosa en solución y expresarla en término de unidades grados Brix, entre las técnicas más comunes están la densimetría, en los cual se puede usar tanto un densitómetro, termohidrómetro o picnómetro; la refractometría, polarimetría o titulación inversa con el reactivo de Fehling, entre otras. En Postobón S.A. se encuentra normalizado el método de determinación de grados Brix por densimetría y refractometría [24], debido a su practicidad y gran precisión y exactitud. La medición se describe para tres equipos en específico: densitómetro, refractómetro y termohidrómetro. La medición por termohidrómetro fue la técnica pionera en este tipo de medición, sin embargo, actualmente es considerada obsoleta y no es usada en condiciones normales. Es descrita en la norma como método alternativo y por el bajo costo de los equipos necesarios para su medición. Esta técnica posee ciertas desventajas prácticas como la fragilidad del hidrómetro, el cual está fabricado de vidrio y necesita ser calibrado periódicamente y con mucha exactitud. El procedimiento para leer Brix con este instrumento en ocasiones es difícil y requiere tiempo, y no puede ser automatizado, además la lectura visual tiene asociado un error que depende del operario, en muchas ocasiones tres o más personas no coinciden en la lectura. El hidrómetro no es costoso y puede usarse de forma alternativa cuando no es posible realizar las lecturas con otros equipos. La AOAC International también recomienda el método volumétrico Lane-Eynon [9], en éste se usa la solución de Fehling titulada con una solución de azúcar previamente invertido (muestra), ya que la sacarosa como tal no es un azúcar reductor mientras que los derivados de su inversión si lo son (este concepto se aclarará en la siguiente sección). Esta técnica es usada principalmente para análisis de soluciones con baja concentración de azúcar, alrededor de 9,5 g por litro (aprox. 1 °B). Debido a que es una titulación inversa la calidad de la medición disminuye con el aumento de la concentración de sacarosa invertida presente en la solución, el procedimiento como tal es difícil y los cálculos descritos en la norma AOAC no expresan el resultado en grados Brix. El uso de densímetro y refractómetros y su principio de funcionamiento ya han sido expuestos en la sección 4.2.1. y 4.2.2., respectivamente.

77

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4.4.3. Uso de grados Brix en la industria El azúcar, después del agua, es el componente natural más usado en la fabricación de bebidas azucaradas, puede alcanzar concentraciones de 13 °B en la bebida final, y da su característico sabor dulce. En conjunto con otros ingredientes, la cantidad de azúcar determina el perfil de la bebida y es parte importante en la caracterización por parte del consumidor. Por lo tanto cualquier desviación significativa en el contenido de azúcar podría resultar en un bajo nivel de aceptación por parte del consumidor, la principal pesadilla de cualquier organización en el mercado. Es por esto que los grados Brix deben ser constantemente monitoreados y controlados en la línea de producción, que en ocasiones involucra un gran flujo de solución de sacarosa envasada usando llenadores a alta velocidad en cientos de botellas por minuto. El control de los grados Brix tiene que ser por lo tanto de gran precisión y la desviación de la concentración objetivo debe ser mínima. Tales desviaciones afectan tanto la calidad del producto como el rendimiento en la producción, y ambas, a la vez, afectan negativamente los costos totales. 4.5.

INVERSIÓN DEL AZÚCAR

4.5.1. Generalidades El propósito de la inversión es dividir la molécula de sacarosa (disacárido) para formar una de glucosa y otra de fructosa (monosacáridos). Para romper el enlace que une estas dos moléculas se requiere de una hidrólisis, en este proceso químico una molécula de agua rompe el enlace y se une a las moléculas derivadas. Para una solución de sacarosa la hidrólisis requiere medio ácido y calentamiento, mientras más bajo sea el pH más rápida será la reacción. La reacción que ocurre bajo estas condiciones es la siguiente [32]: 𝐶12 𝐻22 𝑂11 + 𝐻2 𝑂

𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 +∆

𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑔𝑢𝑎 342,3

𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 𝐶6 𝐻12 𝑂6 (85)

𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 +∆

𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎

18,0

180,6

78

180,6

𝑔 𝑚𝑜𝑙

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Figura 17. Representación esquemática de la reacción de inversión

Cuando el agua entra en reacción se divide en dos componentes el hidrógeno (H) y el hidroxilo (OH), estos rompen el enlace del oxígeno que une las dos unidades monosacáridas. El hidrógeno se combina con el oxígeno para formar glucosa en su configuración regular, mientras el radical OH se combina con el átomo de carbono libre. Expresando la reacción en forma de pesos moleculares, tenemos que 342.3 g de sacarosa reaccionan con 18.0 g de agua para formar un total de 180.6 g x 2 = 360.2 g de mezcla glucosa/fructosa. Esto significa que si partimos de una cantidad conocida de 342.3 g de sacarosa en solución acuosa al invertir obtenemos un peso extra de 18 g de azúcar pero ahora en forma de dos monosacáridos: glucosa y fructosa. Si la reacción anterior toma lugar en una cantidad X g de solución total (sacarosa + agua), esto significa que después de la reacción habrán 18 g más de sólidos disueltos en la misma cantidad X g de solución. El incremento de sólidos puede ser expresado como un factor de 360.32 g finales / 342.3 g iniciales = 1.0526, en otras palabras, se puede esperar que el Brix después de la inversión aumente en 5.26 %. 79

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La hidrólisis ácida con calentamiento que causa este aumento en los grados Brix se denomina inversión de azúcar y se expresa como Brix invertido. Cuando el análisis se realiza sin la inversión y usando soluciones de sacarosa recién preparadas y/o almacenadas a condiciones especiales, es decir, refrigeradas y en un medio no ácido, se asume que la sacarosa no ha sufrido la inversión y por lo tanto la medición se expresa como Brix directo. Por lo anterior, el Brix de una solución totalmente invertida es 5.26 % mayor que su lectura como Brix directo. En la industria, se define como Brix fresco el valor de Brix de un producto en el momento de su preparación, debido a que este valor usualmente corresponde al valor teórico calculado del total de sólidos disueltos en el producto. El Brix fresco por tanto implica la no inversión y se registra como Brix directo. El Brix invertido, en cambio, es el valor de un producto en el cual la sacarosa se ha convertido totalmente en glucosa y fructosa, técnicamente se debería llamar Brix invertido total, sin embargo, en el argot industrial se le designa llanamente "Brix invertido". 4.5.2. Química de la inversión del azúcar Las soluciones de azúcar tienen la propiedad de rotar el plano de la luz polarizada en sentido horario (derecha) o anti-horario (izquierda), la glucosa por ejemplo rota la luz en sentido horario y se define como dextrógiro, si el giro es hacia la izquierda, como pasa con la fructosa, se denomina levógira. La reacción de inversión se expone a continuación con los respectivos ángulos de rotación de los azúcares involucrados para aclarar este fenómeno: 𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑔𝑢𝑎 𝛼 = 66.5°

𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 +∆

𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 (86) 𝛼 = 52.7° 𝛼 = −92.4°

El ángulo de rotación (α) o rotación específica es el ángulo formado por el plano de la luz polarizada sobre la horizontal y es característico de cada azúcar, si el ángulo es levógiro se denota por un signo menos (-). La reacción muestra pues que la sacarosa y la glucosa son azúcares dextrógiras, mientras la fructosa es levógira, después de la inversión la glucosa y fructosa quedan en relación 50/50 %, la mezcla entonces tiene un ángulo de rotación que debería ser la suma de los efectos de cada monosacárido. Como la rotación levógira de la fructosa es mayor que la aportada por la glucosa, la solución final tendrá una rotación levógira, en conclusión el término "invertido" se deriva del cambio de la dirección de la rotación de la luz polarizada que ocurre después de invertir el azúcar. Por lo tanto el azúcar invertido no es más que una mezcla glucosa/fructosa producto de la inversión de la sacarosa. 80

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4.5.3. Cinética de la inversión A condiciones normales cuando el agua está en exceso, la reacción entre la sacarosa y el agua puede interpretarse como una reacción unimolecular (pseudounimolecular). Suponiendo esto, la velocidad de inversión es: 𝑑𝐶 𝑑𝑡

= 𝑘𝐶 (87)

Donde 𝐶 es la concentración actual de la sacarosa, 𝑘 la constante de velocidad y 𝑡 el tiempo. La constante de velocidad puede medirse por el cambio en el ángulo de rotación durante el proceso, así: 1

𝑘 = 𝑡 ln

𝑅0 −𝑅∞ 𝑅𝑡 −𝑅∞

(88)

Donde 𝑅0 y 𝑅∞ son, la rotación inicial y final respectivamente, y 𝑅𝑡 es la rotación en el tiempo dado. Algunos experimentos muestran que la constante de velocidad no es independiente de la concentración de sacarosa, ésta incrementa levemente cuando la concentración aumenta. La constante de velocidad depende de la temperatura según la siguiente relación: 𝑑 𝐿𝑜𝑔 (𝐾) 𝑑𝑡

𝑄

= 𝑅𝑇 2 (89)

En donde 𝑄 representa la energía de activación, 𝑅 la constante de gases y 𝑇 la temperatura absoluta. La energía de activación se ha calculado como 25.9 kcal a 20 °C, y disminuye débilmente con el incremento en la temperatura. Además, 𝑘 depende de la concentración de hidrogeniones (H3O+). En pequeñas concentraciones de H3O+ (menor a 0.01 M o pH mayor a 2) 𝑘 es proporcional a la concentración de hidrogeniones. Para concentraciones H3O+ mayores 𝑘 incrementa aún más que de la forma proporcional. No obstante, para el cálculo de la cantidad de sacarosa invertida se puede recurrir a la tabla 21 que contiene datos reportados por Jackson-Gillis y relaciona la temperatura con la constante de velocidad de la reacción y el tiempo aproximado para alcanzar un 99.99 % de inversión, o la figura 18 donde se representa el diagrama de King-Jison, el cual relaciona por medio de varias curvas el pH, la temperatura y el porcentaje en peso-volumen de sacarosa invertida [33].

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Tabla 21. Tabla Jackson-Gillis Temperatura (°C) 20 40 60 80 90

Constante de velocidad 𝒌 a pH=2 0.000 018 99 0.000 318 6 0.003 806 0.033 03 0.089 82

Tiempo para el 99,99 % de inversión (horas) 3511 209 17.5 2.02 0.74

Figura 18. Diagrama King-Jison

4.5.4. El porqué de la lectura en Brix invertido La sacarosa es el edulcorante más extendido en bebidas azucaradas. La mayoría de bebidas producidas en Postobón S.A., con excepción de las bebidas tipo light, usan sacarosa como endulzante y son saborizadas con varios tipos de ácidos (fosfórico, cítrico y málico) en cantidades que dependen de su formulación; por lo tanto son bebidas ácidas con pH generalmente en un rango de 2 a 4. Como tal, tomará lugar cierto grado de inversión de sacarosa en estas bebidas, incrementando la lectura del Brix. El grado de inversión depende de las condiciones ambientales especialmente de la temperatura, el pH de la gaseosa, y en mayor medida del tiempo. El Brix de bebidas preparadas y analizadas en la línea de producción se expresa como Brix directo y está asociado a los parámetros de calidad de producto en forma de Brix directo. Cuando la bebida tiene cierto tiempo en el mercado o en stock, el proceso de inversión se empieza a producir aumentando la medida de Brix en forma proporcional al grado de inversión, con un máximo de 5.26 % respecto al Brix directo. 82

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En el ámbito cotidiano nunca encontraremos soluciones de sacarosa totalmente invertidas, tanto en la fábrica como en el mercado, esto es porque para una inversión completa se requieren altas temperaturas y bajo pH. En el laboratorio se deben garantizar estas condiciones y de esta forma realizar la hidrólisis completa. Esta práctica de invertir totalmente la solución a analizar, se realiza debido al grado de dificultad para determinar el grado de inversión de un producto, que, como se mencionaba anteriormente, depende de varios factores externos difíciles de controlar o determinar. Es por esto que llevando las bebidas a su Brix invertido total se asegura una mejor calidad en el análisis y permite, por tanto, comparar muestras que pueden poseer distintos grados de inversión; además, el Brix fresco, puede determinarse a partir del valor de Brix invertido dividiendo por el factor 1.0526.

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5. DESARROLLO DEL PROYECTO 5.1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Día a día se realizan innumerables determinaciones en laboratorios de todo el mundo, estas mediciones son necesarias en muchos campos de aplicación desde el análisis de agua potable y bebidas en el caso de POSTOBÓN S.A., hasta análisis médicos para diagnóstico de enfermedades. Virtualmente cada aspecto de la sociedad y la vida cotidiana está soportado de alguna manera en mediciones analíticas. Estas mediciones son usadas para tomar decisiones, que pueden tener repercusiones de alto o bajo grado. Se observa claramente la importancia de determinar si los resultados obtenidos son fiables y a la vez establecer hasta qué punto se puede tener confianza de su exactitud. Sin embargo, este nivel de certidumbre no es determinado sólo por la exactitud del método, existen además otros parámetros que ayudan a caracterizar su rendimiento y que aportan información valiosa para su correcta ejecución e interpretación de resultados. El proceso para obtener estos parámetros se denomina validación, que en cortas palabras es el establecimiento de una base de datos experimental que certifica el rendimiento de un método analítico. El Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A. es el encargado de realizar la evaluación mensual de los centros productores por medio de un diagnóstico de su competencia mediante la determinación de cantidad de producto dentro de especificación; por esta razón todas sus mediciones deben estar debidamente certificadas desde el punto de vista analítico, esto se logra con una adecuada validación de los métodos usados. En este trabajo se presenta el proceso de validación del método para la determinación de grados Brix en bebidas y jarabes; dado el su uso extensivo de este método, tanto en los centros productores como dentro del mismo Laboratorio Central, Adicionalmente los grados Brix son una cualidad importante en el perfil de los productos. 5.2.

HOMOLOGACIÓN

El objetivo primordial de esta etapa preliminar es establecer las diferencias existentes entre los métodos aprobados y/o validados aportados por asociaciones, normas estándar o manuales de calidad, y los existentes en la normativa POSTOBÓN S.A.

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Este análisis comparativo se realizó para los métodos analíticos de mayor uso, que se pueden clasificar en cuatro tipos de análisis: -

Fisicoquímico evaluación: son los ensayos realizados a producto terminado procedente de las plantas, a los cuales se les evalúa sus características fisicoquímicas, datos primordiales para establecer el índice de calidad de la planta; actualmente este índice se expresa como porcentaje de unidades dentro de parámetros.

-

Fisicoquímico pureza: son aquellos análisis realizados a materias primas e insumos con el objeto de determinar su pureza. Se usa extensivamente en la recepción de materias primas, ya que de este análisis depende su aceptación o rechazo.

-

Fisicoquímico azúcar: aunque el azúcar es una materia prima, debido a su grado de importancia hubo la necesidad de separarla de otros tipos de análisis. Estos ensayos determinan trazas y la calidad fisicoquímica del azúcar.

-

Fisicoquímico agua: son los ensayos realizados a las aguas procedentes de pozos, agua industrial y aguas para consumo.

Normas usadas en el análisis comparativo de métodos: -

NTC 2740: bebidas no alcohólicas. Bebidas Gaseosas o carbonatadas [34]: los métodos de interés reportados en esta norma citan la AOAC como fuente de métodos, por lo tanto los métodos de AOAC y los aportados por la NTC se consideran como una misma fuente.

-

Official Methods of Analysis of AOAC international, 2006 [7]: usada principalmente en los métodos de evaluación, azúcar y agua.

-

USP 29 - NF 24 2006, Farmacopea de los Estados Unidos de América [35]: usada en los métodos para determinación de pureza en materias primas.

-

Normas PEPSICO 2004 [27]: Manual de calidad Volumen 2 Métodos Analíticos. PEPSICO International: esta norma se usa en especial para los métodos de evaluación, azúcar y agua.

-

Normas Postobón SIAD [24]: Sistema de Administración Documental, son las normas vigentes y las usadas en los centros productores de Postobón en todo el país.

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-

Métodos Laboratorio Central [24]: métodos usados en el Laboratorio Central, solo difieren en algunos casos con la norma Postobón SIAD, incluye aquellos métodos en estudio o con modificaciones.

-

Food Chemicals Codex 5th Edition [36]: métodos usados para el análisis de pureza o trazas en materias primas. Contiene métodos muy similares a los encontrados en la USP.

Aunque el análisis se efectuó de forma extensa, los métodos aportados por PEPSICO son los que tienen mayor peso, y la homologación o disminución de brechas se realiza teniendo en cuenta esta fuente como principal referente, en caso de ser necesario se usan las otras fuentes y se ajusta el método de tal forma que su ejecución cumpla los estándares citados, sea logísticamente viable y, además, acorde a los recursos disponibles en los laboratorios. Es de anotar que estos ajustes o modificaciones se realizan de manera interna y de forma confidencial. Ver anexo C: matriz de comparación de métodos. 5.3.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE GRADOS BRIX

El objetivo de esta validación, como se mencionó anteriormente, es demostrar la aptitud o competencia del Laboratorio Central para la determinación de grados Brix en bebidas y jarabes por el método de refractometría y densimetría, que obedece a los requisitos regulados por la norma NTC-ISO 17025 en el numeral 5.4.5. sobre validación de métodos: „„el laboratorio debe validar los métodos nonormalizados, los métodos diseñados/desarrollados por el laboratorio, los métodos normalizados empleados por fuera del alcance propuesto, ampliaciones y modificaciones de métodos normalizados a fin de confirmar que los métodos sean los apropiados para el uso propuesto. La validación debe ser tan extensiva como sea necesario para cumplir con todas las necesidades de la aplicación o campo de aplicación determinados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento empleado para la validación y un informe en cuanto a la afinidad del método para su uso propuesto‟‟ [37]. El método está descrito detalladamente en la norma BE1-06-3 presente en la documentación privada de POSTOBÓN S.A [24]. 5.3.1. 5.3.1.1.

Equipos y recursos usados en la validación Instrumentos de análisis -

Densímetro: DMA 58 Anton Paar Refractómetro: RFM 340 Bellingham Stanley 86

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5.3.1.2.

Equipos para preparación de muestra

Sonicor Ultrasonido SC-101 Se dispone de un ultrasonido Sonicor referencia SC-101 para realizar la desgasificación y homogenización de las muestras que lo requieran, especialmente mayores a 40 °B. El equipo no dispone de cronómetro ni calentamiento. Tabla 22. Resumen de especificaciones del ultrasonido Propiedad Capacidad Output Dimensión tanque Dimensión equipo

Valor 1 galón 100 watts 9 x 5 x 6 (in) 10.5 x 6 x 11 (in)

Para su uso se llena con 3.2 litro de agua destilada, o lo necesario según lo requerido con un mínimo de 5 cm de nivel de agua. Baño maría Baño de maría Memmert AUM-500PD con control de temperatura en un rango de 25 a 100 °C. Estación de desgasificación Este equipo se usa para la desgasificación previa de bebidas gaseosas, posee 10 puestos de desgasificación por medio de burbujeo con aire y durante un tiempo determinado a flujo y presión constante. El desgasificador está conformado por: -

Filtro de aire en línea Trampa de aceite Trampa de NaOH con fenolftaleína para absorción de CO2 Trampa de humedad Fuente de aire Válvula Manómetro y medidor de flujo Tubo de inserción o difusor

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Condiciones de operación: Todos los puestos de desgasificación deben ser usados. Para desgasificar menos de 10 muestras, completar los puestos con recipientes llenos de agua. Presión: 7.5 psi Flujo de aire: 5.5 LPM O2 Volumen de muestra: 250 mL Balanza analítica Marca: Mettler-Toledo Modelo: AB204 Clase de exactitud: clase 1 Precisión: 0.002 g Rango: 0 – 120 g Balanza Marca: Mettler-Toledo Modelo: PM4800 Clase de exactitud: clase 2 Precisión: 0.2 g Rango: 0 – 4000 g 5.3.1.3.

Reactivos -

5.3.1.4.

Sacarosa grado reactivo HCl 2.5 N Etanol 95 % Aire a presión constante Agua destilada Fenolftaleína NaOH 0.1N

Recursos complementarios -

Tubos de ensayo de 30 ml con tapa rosca Gradillas metálicas para calentamiento Frasco lavador Probeta de 50 ml Viales para automuestreador densímetro de 50 ml Toallas de papel suaves, libres de hilo y pelusas Vasos desechables de 500 ml para desgasificación de bebidas Desecador para filtro de humedad del refractómetro 88

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5.3.2. Resumen del método para determinación de grados Brix -

Preparación de la muestra para Brix directo: se debe garantizar homogeneidad de la muestra, ausencia de burbujas de aire y de CO2.

-

Preparación de la muestra para Brix invertido: -

-

Al igual que la preparación para Brix directo se debe garantizar homogeneidad de la muestra, ausencia de burbujas de aire y de CO2. En un tubo de ensayo depositar aproximadamente 25 ml de muestra, agregar 2 gotas de HCl a 2.5 N. Calentar a 100 ± 2 °C en baño maría durante 40 ± 2 minutos. Si es necesario, corregir el tiempo de inversión por efecto de altitud. Para el Laboratorio Central este tiempo es de 50 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Proceda a leer Brix invertido o directo (según la necesidad) en el equipo disponible. Los jarabes y refrescos se leen exclusivamente en el refractómetro, mientras que las bebidas gaseosas se pueden leer en ambos equipos.

Lectura en refractómetro: -

Realizar verificación de la calibración correspondiente (span y zero), aceptar para una diferencia menor de 0.03 °B. Si no es aceptable, calibrar. Abrir y limpiar el prensador junto con el prisma con papel suave y alcohol. Depositar cantidad suficiente de muestra para tapar completamente el prisma, aproximadamente 1.5 ml. Cerrar el prensador y realizar la lectura. Nota: si es necesario hacer lecturas con tiempo de espera para que la muestra alcance la temperatura del equipo.

Lectura en el densímetro -

Realizar una verificación de la calibración, aceptar para una diferencia 0.00005 g/cm3 respecto al valor teórico y usando agua destilada, si no es aceptable calibrar. Servir la muestra en un vial, previamente purgado con la muestra y proceder a su lectura.

Rangos de trabajo: antes de proceder a cualquier análisis, se debe tener en cuenta que rangos de trabajo estimados aplican:

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Las bebidas gaseosas poseen un Brix directo en un rango de 8 a 14 °B, en el caso de Brix invertido este rango aumenta levemente. Las soluciones con alto contenido de azúcar o jarabes, usadas dentro del proceso de producción, tienen un valor cercano a 60 °B; estas las lecturas para jarabes se realizan únicamente en forma de Brix directo ya que estas soluciones recién preparadas se usan inmediatamente en la fabricación de bebidas. Por recomendación de fabricante, Anton-Paar, no se recomiendan lecturas de muestras con alto contenido de azúcar en el densímetro debido a su alta viscosidad, por esto las lecturas en Brix directo para jarabes se realizan exclusivamente en el refractómetro. Las lecturas en Brix invertido se pueden hacer tanto en el refractómetro como en el densímetro abarcando un rango correspondiente al producto terminado que oscila entre 8 y 14 °B. 5.3.3. Clasificación del método El método para determinación de grados Brix se encuentra estandarizado en la norma PEPSICO TM200.009 (densimetría) y TM200.010 (refractometría), la cual a su vez es similar a la reportada por la AOAC International 932.14. POSTOBÓN S.A. adecuó este método a sus necesidades y lo reguló en la norma BE1-06-3. El método para determinación de grados Brix por lo tanto es del tipo normalizado con modificaciones y entra en la categoría I ya que cuantifica un componente mayoritario: sólidos disueltos (sacarosa). 5.3.4. Parámetros a validar y criterios de aceptación Debido a que el método para análisis de grados Brix se encuentra actualmente normalizado por instituciones de referencia, no es necesario evaluar todos los parámetros, sin embargo, debido a que el presente trabajo será usado para realizar el protocolo de validación de posteriores métodos, se requiere evaluar tantos parámetros como sea posibles, y estos, según los lineamientos de la tabla 3 (parámetros a evaluar según la categoría del método) son: - Robustez - Selectividad/especifidad - Linealidad - Intervalo de trabajo (rango) - Sensibilidad - Precisión: - Repetibilidad - Precisión intermedia - Exactitud - Incertidumbre

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Como se puede observar, los límites de cuantificación y detección no se evalúan, porque el compuesto a medir es el componente mayoritario en las soluciones y por tanto no se espera que esté a bajas concentraciones. El estudio comparativo o interlaboratorio, también necesario para el cálculo de la reproducibilidad, se realizará en posteriores estudios ya que su ejecución excede el alcance del presente proyecto. Criterios de aceptación -

Robustez: se debe determinar el rango de trabajo en los cuales los efectos no sean significativos, juicio obtenido de la prueba t usando una desviación estándar de 0.03 °B como máximo valor de variabilidad significativa.

-

Selectividad/especifidad: se debe obtener para los placebos o muestras preparas una especifidad mayor a 0.90.

-

Linealidad: como primer criterio el coeficiente de correlación mayor a 0.999, además debe superar la prueba de la ANOVA de regresión lineal y la significancia de la pendiente e intercepto.

-

Intervalo de trabajo (Rango): se define el rango de trabajo como aquel donde el sesgo sea menor a 0.03 °B, o la recuperación este entre 105 y 95 %, este último criterio es usado especialmente para métodos de análisis de trazas.

-

Sensibilidad: este parámetro solo es de tipo informativo, sin embargo una sensibilidad alta se traduce en un buen desempeño por parte del método.

-

Precisión o Repetibilidad: esta debe ser menor a 0.02 °B en todas las concentraciones, este criterio fue estimado a partir de la experiencia en el laboratorio, ya que el fabricante no reporta esta variable en la especificación técnica del equipo. o Precisión intermedia: se establece un máximo de 0.03 °B para la precisión intermedia o reproducibilidad, este criterio se basa en la mayor precisión reportada para los instrumentos. Además se debe verificar que la precisión intermedia es menor a dos veces la repetibilidad de método en términos del coeficiente de variación.

-

Exactitud: en el Laboratorio Central se acepta un sesgo de 0.03 °B o menor.

-

Incertidumbre: debe ser menor a 0.06 °B en su forma expandida para distribución normal y una confidencia de 95 %.

91

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5.3.5. Muestras, estándares y patrones de referencia 5.3.5.1.

Muestras

Como se indicó anteriormente el rango real de trabajo está determinado por las muestras típicas que se analizan de forma rutinaria en los laboratorios, que generalmente son de tipo jarabe, 40 a 60 °B, o producto terminado, 8 a 14 °B. Como los jarabes no poseen ningún otro componente se asumirán como estándares. Las muestras a analizar durante el desarrollo del proyecto fueron tomadas de la planta Postobón Bello según lineamientos dados para el procedimiento de muestreo: -

No tomar muestras al comienzo o terminación de un lote de producción. Se debe esperar un tiempo de al menos 5 minutos en el cual las muestras sean producidas de manera estable sin que sus propiedades cambien abruptamente, especialmente grados Brix y volumen de CO2. Clasificar por altura de llenado y sellado.

Tabla 23. Descripción de muestras usadas en el desarrollo del proyecto Producto

Presentación

Pepsi

500 ml

Colombiana Nacional

500 ml

Manzana Interior

500 ml

Codificación 25JUN09 07:43 LB0001107584 25JUN09 05:07 LB0001107392 25SEP09 00:59 LB0001145113

Fecha de producción 05 FEB 09 05 FEB 09 08 MAY 09

Muestra control Dentro del proceso de validación se hace uso de dos tipos de muestras control: aquellas usadas en todo el proceso de validación o muestra control general y aquellas usadas en el ensayo de robustez o muestra control de robustez, ambas tienen objetivos distintos. -

Muestra control general

Como muestra control general se eligió agua destilada, debido su uso en calibraciones y verificaciones de los equipos, además no se degrada o contamina fácilmente, por lo tanto su análisis nos garantizará la validez de posteriores determinaciones. La muestra control siempre se analiza al principio de cualquier ensayo o grupo de lecturas, sus resultados no se reportarán ya que solo actúa como verificador. 92

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-

Muestra control de robustez

En los ensayos de robustez también se define un ensayo control, el cual corresponde al efectuado sin ninguna modificación deliberada, estas muestras control de robustez se usan como referencia para calcular los efectos y pueden ser estándares de sacarosa o muestras de bebidas gaseosas. 5.3.5.2.

Estándares

En este proyecto se entiende como estándar aquellas soluciones preparadas en el laboratorio usando sacarosa grado reactivo y agua destilada (ver certificados en el anexo B8, B9 y B10), debidamente pesadas, y de concentración (°B) conocida. Es de anotar que para el ensayo de selectividad/especifidad se prepararon placebos (estándares con ingredientes adicionales que buscan simular la matriz de una bebida azucarada) los cuales se consideran estándares al poseer concentración conocida de todos sus componentes. En el transcurso del proyecto se usaron distintos niveles de concentración desde 7 hasta 60 °B, en su preparación se tuvo muy en cuenta la homogeneización de la matriz y su respectiva refrigeración en caso de ser necesario. 5.3.5.3.

Patrones de referencia

Refractómetro: -

AG12.50 𝑛𝐷20 = 1.35186, °𝐵 = 12.5 (ver anexo B1) OIL BSLP23 𝑛𝐷20 = 1.46990 (ver anexo B4) Solución sacarosa 25.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.37233 Solución sacarosa 60.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.44193

Estos patrones pertenecientes a la casa Bellingham-Stanley tienen sus respectivos certificados de trazabilidad y tablas de dependencia con la temperatura; estas tablas sólo aplican para los dos primeros patrones, ya que no son soluciones de sacarosa y su lectura debe realizarse sin compensación de temperatura. Densímetro: -

Agua ultra pura, Serial No. 1022 Certificado 18691 SH Calibration Service GmbH. 0.99820 ± 0.000011 g/cm3 (95 %) a 20 °C (certificado en el anexo B6 y B7)

93

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5.3.6. Condiciones ambientales y tiempo de experimentación El proceso de validación se llevó a cabo desde el 11 de mayo de 2009 hasta el 3 de agosto de 2009. Las condiciones ambientales promedio del laboratorio central en este rango de tiempo fueron (ver anexo D): Tabla 24. Condiciones ambientales promedio en el laboratorio central Parámetro Temperatura (°C) HR (%)

Intervalo (95 % de confianza) 22.41 ± 1.65 56.74 ± 12.49

40

80 70

35

50

30

40 25

HR (%)

Temperatura (°C)

60

30 20

20 Temperatura HR

15

10 0

07/05/09 17/05/09 27/05/09 06/06/09 16/06/09 26/06/09 06/07/09 16/07/09 26/07/09 05/08/09 Tiempo (Fecha)

Figura 19. Condiciones ambientales en el Laboratorio Central a través del tiempo

5.3.7. Metodología Basados en los procedimientos descritos en la sección del marco teórico referente a la validación se desprenden los siguientes grupos de experimentos. 5.3.7.1.

Robustez

Para la evaluación de la robustez se identificaron las variables mostradas en la tabla 25 que tiene una influencia importante en las lecturas.

94

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Tabla 25. Variables con influencia apreciable sobre el método analítico. Equipo Densímetro

Refractómetro

Tipo Bebida

Etapa Inversión

Bebida

Lectura en equipo Inversión

Lectura en equipo

Jarabe

Desgasificación Lectura en equipo

Variable - Cantidad de HCl adicionado - Volumen de muestra - Tiempo de inversión - Temperatura de Inversión - Estabilidad de la muestra - Homogenización previa a la lectura - Cantidad de HCl adicionado - Volumen de muestra - Tiempo de inversión - Temperatura de Inversión - Estabilidad de la muestra - Tiempo de retardo en lectura - Temperatura - Homogeneización previa a la lectura - Tiempo de ultrasonido - Estabilidad de la muestra - Tiempo de retardo en la lectura - Temperatura - Homogeneización previa a la lectura

Resumen de factores -

Estabilidad de la muestra o edad. Tiempo de ultrasonido (sólo jarabe) Cantidad de HCl adicionado, expresado como gotas. Volumen de muestra a invertir Tiempo de inversión Temperatura de inversión Homogeneización previa a la lectura o agitación. Temperatura de lectura Tiempo de retardo en lectura (sólo refractómetro)

Niveles de influencia Los niveles de influencia, ver tabla 26, especifican los valores en los cuales puede variar un factor determinado.

95

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Tabla 26. Niveles de influencia para los distintos factores Factor Estabilidad (días) Tiempo de ultrasonido (min) Cantidad de HCl adicionado (gotas) Volumen de muestra a invertir (ml) Tiempo de inversión (min) Temperatura de inversión (°C) Agitación de la muestra Tiempo de retardo en lectura (s) Temperatura de lectura (°C)

1 0 0 0 20 15 50 Si 0 10

2 1 2 1 25 30 90 No 12 22

Nivel de influencia 3 4 5 3 6 4 8 2 4 8 30 40 50 60 95 100 24 30

36

48

6

Total Niveles 4 4 5 3 6 4 2 7 3

7

70

60

72

Las celdas en gris corresponden a los valores actuales del método en el Laboratorio Central y definen el ensayo control, estos valores pueden diferir con la forma en que el método es llevado a cabo en los laboratorios de las plantas productoras, especialmente en el tiempo de inversión, que depende la altitud, y el tiempo de retardo en la lectura. Niveles de concentración Los factores pueden influir de distinta manera dependiendo de la concentración de azúcar en las soluciones, es necesario realizar cada estudio en un mínimo de dos niveles de concentración por medio de análisis de estándares o muestras de bebidas gaseosas, y en Brix invertido o directo según sea necesario. Tabla 27. Niveles de concentración evaluados en la robustez Factor Estabilidad Tiempo de ultrasonido Cantidad de HCl adicionado Volumen de muestra a invertir Tiempo de inversión Temperatura de inversión Agitación de la muestra Tiempo de retardo en lectura Temperatura de lectura

Pepsi X

Muestra Colombiana X

X

X X X

X X X

Manzana

8 °B

X

X X X X

Estándar 14 °B 40 °B X X X X X X X X

60 °B X X

X X

En la tabla 27 se señalan los valores de concentración y muestras bajo las cuales se analizó la robustez en los distintos factores. Tener en cuenta que los análisis de 40 y 60 °B sólo se realizan en el refractómetro y como Brix directo, el resto de análisis se realizan como Brix invertido, en este caso, los estándares de 8 y 14 °B pasan a un valor teórico de 8.421 y 14.736 °B debido a la inversión. 96

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Diseño de experimentos En éstas pruebas se evaluarán dos o más niveles en cada factor y cada uno a distintas concentraciones, por consiguiente el número de variables asciende a una cantidad considerable; en este caso un diseño factorial resultaría difícil de llevar a cabo, se elige, entonces, un diseño univariable donde cada factor es estudiado por separado asumiendo interacciones nulas entre estos. Se realizarán 10 réplicas por cada ensayo permitiendo el cálculo de un promedio más exacto y con unos grados de libertad mayores. 5.3.7.2.

Confirmación de identidad: selectividad/especifidad

Las bebidas azucaradas, como se ha mencionado anteriormente, tiene además de azúcar y agua, otros componentes en muy pequeña proporción; el azúcar, como tal, aporta más del 95 % de sólidos disueltos en una bebida azucarada, porcentaje que depende de las especificaciones del producto. Aunque en la definición de grados Brix se asume que este tipo de bebidas se puede considerar idealmente como una solución de sacarosa pura en agua, es necesario estudiar el efecto de los demás componentes para corroborar esta conjetura. Basados en la huella técnica de los productos de tipo bebida azucarada en Postobón S.A. se determinaron aquellos componentes que por la cantidad agregada al producto terminado, pudieran afectar significativamente la lectura de grados Brix. En la tabla 28 se encuentran los componentes seleccionados y su rango típico de concentración: Tabla 28. Componentes seleccionados para el análisis de especifidad Componentes

Estado

Variable

Rango (g/ 100 g)

Azúcar

Sólido

𝑥𝐴

8

14

Ácido débil

Sólido

𝑥𝐵

0

0.4

Ácido fuerte (Sol. 85 %)

Líquido

𝑥𝐶

0

0.05

Benzoato de Potasio

Sólido

𝑥𝐷

0

0.043

Emulsión Naranja

Emulsión

𝑥𝐸

0

0.12

Enturbiante

Emulsión

𝑥𝐹

0

0.42

A cada componente se le asigna una variable 𝑥𝑖 que corresponde a la concentración dada en gramos presentes en cada 100 gramos de muestra. Diseño de experimentos Para el cálculo de la especifidad es necesario realizar experimentos repetidos a diferentes concentraciones de analito e interferencias, en este caso se hará uso 97

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del diseño factorial fraccional Plackett-Burman 26 3/16 aleatorizado, proporcionado por el programa estadístico Statgraphics. Se prepararon 12 soluciones de 100 gramos cada una, con la respectiva cantidad de componentes especificada en la tabla 29. El análisis de especifidad se realiza tanto para Brix directo como invertido. Tabla 29. Diseño de experimentos tipo Plackett-Burman para especifidad Solución

𝒙𝑨

𝒙𝑩

𝒙𝑪

𝒙𝑫

𝒙𝑬

𝒙𝑭

g Agua

g totales

1

14.0000

0.0000

0.0500

0.0000

0.0000

0.0000

85.9500

100

2

14.0000

0.4000

0.0500

0.0000

0.1200

0.4200

85.0100

100

3

8.0000

0.0000

0.0000

0.0430

0.1200

0.0000

91.8370

100

4

14.0000

0.0000

0.0500

0.0430

0.0000

0.4200

85.4870

100

5

8.0000

0.0000

0.0500

0.0430

0.1200

0.0000

91.7870

100

6

14.0000

0.4000

0.0000

0.0430

0.0000

0.4200

85.1370

100

7

14.0000

0.4000

0.0000

0.0430

0.1200

0.0000

85.4370

100

8

14.0000

0.0000

0.0000

0.0000

0.1200

0.4200

85.4600

100

9

8.0000

0.0000

0.0000

0.0000

0.0000

0.4200

91.5800

100

10

8.0000

0.4000

0.0500

0.0000

0.1200

0.0000

91.4300

100

11

8.0000

0.4000

0.0000

0.0000

0.0000

0.4200

91.1800

100

12 Total

8.0000 132

0.4000 2.400

0.0500 0.300

0.0430 0.258

0.0000 0.720

0.0000 2.520

91.5070

100

5.3.7.3.

Linealidad

La evaluación de la linealidad se realiza para ambos instrumentos, densímetro y refractómetro, en lecturas invertidas y directas, para 10 concentraciones, en triplicado y evaluando un rango un poco mayor al de trabajo. De los análisis se obtuvo las señales correspondientes expresadas como densidad (mg/cm3) o índice de refracción. Los rangos a evaluar fueron los siguientes: Densímetro: - Rango invertido: 7 - 15 °B (10 concentraciones) - Rango directo: 7 - 15 °B (10 concentraciones) Refractómetro: - Rango invertido: 7 - 15 °B (10 concentraciones) - Rango bajo directo: 7 - 15 °B (10 concentraciones) - Rango alto directo: 7 - 65 °B (18 concentraciones) 98

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Las soluciones preparadas se detallan en la tabla 30. Tabla 30. Soluciones preparadas según el instrumento. Densímetro Invertido Directo 7.37 7.00 8.42 8.00 9.47 9.00 10.53 10.00 11.58 11.00 12.10 11.50 12.63 12.00 13.68 13.00 14.74 14.00 15.79 15.00

5.3.7.4.

Invertido 7.37 8.42 9.47 10.53 11.58 12.10 12.63 13.68 14.74 15.79

Refractómetro Directo Bajo Directo Alto 7.00 7.00 8.00 8.00 9.00 9.00 10.00 10.00 11.00 11.00 11.50 11.50 12.00 12.00 13.00 13.00 14.00 14.00 15.00 15.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00

Rango

El rango propiamente lo dan las especificaciones de los productos, sin embargo se debe emitir un juicio que corrobore la exactitud y/o precisión en la lectura para estos intervalos de concentración, se usan los mismos datos aportados en el análisis de linealidad. 5.3.7.5.

Sensibilidad

La curva respuesta Vs concentración obtenida para el análisis de la sensibilidad se elabora con los datos proporcionados en el análisis de linealidad. 5.3.7.6.

Precisión

Como es sabido la precisión se puede desglosar en varios términos: repetibilidad instrumental, repetibilidad del método, precisión intermedia y reproducibilidad. En este estudio en particular se usa el método para el cálculo de la repetibilidad instrumental/método y la precisión intermedia. La reproducibilidad se puede hallar por medio de un estudio colaborativo, el cual debe involucrar otros laboratorios, con una capacidad de análisis similar o superior al del laboratorio central, este 99

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estudio sobrepasa los límites del presente proyecto y se deja propuesto para estudios futuros en la empresa. Repetibilidad del instrumento En la repetibilidad del instrumento se evaluarán tres estándares invertidos: 8, 11 y 14 °B, y dos estándares con lectura directa: 40 y 60 °B (sólo refractómetro), los datos para estas dos últimas soluciones se tomaron de los análisis para robustez. A cada solución se le realizarán 10 mediciones consecutivas. Sin embargo, como saldrá a la luz en los análisis, el densímetro realiza las lecturas de forma parcialmente destructiva y por lo tanto el estudio para la repetibilidad del instrumento no aplica. Repetibilidad del método Se harán mediciones a 10 alícuotas de una misma solución que han pasado todos los pasos del método por separado y a tres niveles de concentración: 8, 11 y 14 °B. Es de anotar que los datos para 8 y 14 °B se extrajeron de las lecturas para el análisis de robustez, experimentos que se realizaron bajo las mismas condiciones. Precisión intermedia Tal como lo propone la literatura en el cálculo de la precisión intermedia cada analista realiza tres análisis por día en cada instrumento, ver diseño de experimentos en la tabla 31. Estas lecturas se realizaron a dos soluciones debidamente invertidas: 8 y 14 °B Tabla 31. Diseño de experimentos para precisión intermedia

Analista X Analista Y Total por instrumento

5.3.7.7.

Día 1 3 3

Densímetro Día 2 Día 3 3 3 3 3 18

Día 1 3 3

Refractómetro Día 2 Día 3 3 3 3 3

Total analista 18 18

18

Exactitud

Este parámetro se evalúa con respecto a dos valores de referencia: estándares y patrones. Exactitud con estándares El cálculo de exactitud con estándares se realiza a partir de los datos obtenidos en el estudio de linealidad. Usando estos resultados pero no en términos de 100

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respuesta (densidad o índice de refracción) si no con su conversión a grados Brix, se puede determinar la exactitud a lo largo del rango de trabajo y a varias concentraciones, como los análisis se realizaron por triplicado no es posible realizar una prueba de hipótesis concluyente. Los cálculos y resultados obtenidos en este caso son idénticos a los expuestos en el análisis para el rango del método. Exactitud con patrones Las soluciones de referencia son costosas y vienen en pequeños volúmenes, por esto solo se puede realizar una limitada cantidad de lecturas, en general menor a tres mediciones. Debido a la disponibilidad de un solo patrón para el densímetro, se realiza una calibración con este patrón e inmediatamente se leen varios estándares, con estos datos se establece el sesgo y la recuperación. Densímetro La exactitud se evalúa de dos formas y usando el mismo material de referencia (agua ultra pura): -

Calibración con agua destilada

Se calibra de forma rutinaria, usando agua destilada obtenida del mismo laboratorio y aire. Se valora el sesgo en densidad respecto al patrón después de la debida calibración. Tabla 32. Descripción del patrón usado en el cálculo de exactitud para el densímetro.

-

Patrón

T (°C)

Agua pura

20

Densidad teórica 3 (g/cm ) 0.99820 ± 0.000011

Calibración con patrón de referencia

Se calibra bajo la misma metodología, sólo que en lugar de usar el agua destilada se usa el patrón de referencia, y se analizan estándares distintos preparados en el laboratorio según la tabla 33. Este procedimiento nos permite evaluar el sesgo en densidad y grados Brix. Tabla 33. Estándares usados en el cálculo de la exactitud para el densímetro. Estándar Agua destilada 8 °B 11 °B 14 °B

Valor teórico (°B) 0.000 8.000 11.000 14.000

101

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Refractómetro Se evaluó la exactitud en dos niveles de calibración: alto y bajo. Las calibraciones se realizan según la tabla 34 y usando estándares de sacarosa preparados en el laboratorio. Tabla 34. Descripción de estándares usados para la calibración del refractómetro a distintos rangos. Rango Bajo Alto

Zero (Agua destilada) 0.00 °B 0.00 °B

Span 12.00 °B 60.00 °B

Según el rango, alto o bajo, se verifica con los patrones correspondientes la exactitud del método, ver tabla 35. Tabla 35. Descripción de patrones usados en el cálculo de exactitud para el refractómetro. Rango Bajo Alto

Patrones AG12.50 𝑛𝐷20 = 1.35186, °𝐵 = 12,5 Solución sacarosa 25.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.37233 Solución sacarosa 25.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.37233 Solución sacarosa 60.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.44193 OIL BSLP23 𝑛𝐷20 = 1.46990

Valor teórico (20 °C) 12.50 °B 25.00 °B 25.00 °B 60.00 °B 71.81 °B

Es de aclarar que los patrones AG12.50 y OIL BSLP23, no son soluciones de sacarosa si no fluidos de referencia, por lo tanto su Brix teórico no corresponde a los sólidos disueltos y depende altamente de la temperatura; es necesario desactivar la compensación automática del instrumento y leer manualmente el grado Brix a una temperatura determinada reportada en las tablas del certificado metrológico (ver anexo B2, B3 Y B5). 5.3.7.8.

Incertidumbre

La incertidumbre puede calcularse de dos maneras tal como se indica en la sección 4.1.4.10. En el presente estudio esta se estimará usando el peor escenario, es decir, aquel en el cual se encuentre una mayor variabilidad y que involucre la mayor cantidad de fuentes de incertidumbre. Se determina entonces que el peor escenario se presenta al analizar muestras control de robustez, específicamente aquellas de bebida gaseosa (Colombiana, Manzana y Pepsi) y jarabes (60 °B). Estas fueron analizadas con distintas calibraciones, en un rango de tiempo prolongado y preparadas en fechas distintas. 102

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Las muestras de control usadas para el cálculo de la incertidumbre en el densímetro corresponden a los siguientes ensayos en robustez: -

Estabilidad: Pepsi y Colombiana Cantidad de HCl: Pepsi y Manzana Agitación de la muestra: Pepsi y Colombiana

En total son 60 datos, agrupados en 6 grupos de 10 elementos cada uno. En el refractómetro (rango bajo) las muestras control de robustez usadas son las correspondientes a las pruebas de: -

Estabilidad: Pepsi y Colombiana Cantidad de HCl: Pepsi y Manzana Agitación de la muestra: Pepsi y Colombiana Temperatura de lectura: Pepsi

Estos ensayos representan un total de 70 lecturas, agrupados en 7 grupos con 10 datos cada uno. Para evaluar la incertidumbre del refractómetro en un rango alto se procedió de igual forma, pero usando los estándares de 60 °B pertenecientes a los ensayos de control en el análisis de robustez: -

Estabilidad Tiempo ultrasonido Temperatura de lectura

Es de anotar que se emplearon solo las muestras control de 60 °B ya que, como se verá en el análisis de repetibilidad, reportan la mayor desviación, la cual es tres veces mayor que la encontrada para 40 °B. 5.3.8. Resultados y análisis En esta sección se reportan los resultados relevantes del estudio de validación, para obtener más información sobre las memorias de cálculo y resultados parciales ver anexo E. 5.3.8.1.

Robustez

El error estándar para todas las pruebas de hipótesis se calculó a partir de la desviación estándar asociada al método de determinación de grados Brix, que corresponde a 0.03 °B, siempre y cuando esta sea mayor a la desviación estándar

103

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de los ensayos, lo cual se verifica usando una prueba de hipótesis para comparación de varianzas. El estimado de la desviación estándar igual a 0.03 °B es el mismo para ambos equipos y determina el criterio máximo de aceptación significativo usado en las mediciones. Estabilidad de la muestra La estabilidad de la muestra se evaluó a condiciones ambientales controladas, (ver tabla 24 y figura 10) y con el tubo de ensayo destapado, en otras palabras, libre al ambiente, esto con el fin de simular una situación extrema. En este caso la medida referencia es aquella realizada en el día cero. Con este estudio se quiere demostrar si dejar una muestra a condiciones ambientales y de forma “desatendida” incide significativamente en el valor de Brix reportado. Tabla 36. Resultados prueba de estabilidad para refractómetro Estándar Día

40 °B

60 °B

0 40.012

1 40.070

3 40.230

6 40.486

0 59.979

1 60.062

3 60.231

6 60.498

0.008

0.008

0.007

0.008

0.009

0.018

0.009

0.012

39.998

39.998

39.998

39.998

59.999

59.999

59.999

59.999

10

10

10

10

10

10

10

10

Ex

0.0000

0.0580

0.2180

0.4740

0.0000

0.0830

0.2520

0.5190

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

Promedio Desv. estándar Teórico n

t

4.3231 16.2488 35.3299

6.1865 18.7830 38.6840

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009

2.1009

Si

Muestra Día Promedio

2.1009 Si

2.1009 Si

Si

Pepsi 0

1

2.1009 Si

2.1009 Si

Colombiana 3

6

0

1

3

7

11.204

11.236

11.325

11.426

10.518

10.556

10.619

10.725

0.007

0.019

0.011

0.010

0.010

0.007

0.006

0.007

10

10

10

10

10

10

10

10

Ex

0.0000

0.0320

0.1210

0.2220

0.0000

0.0380

0.1010

0.2070

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

t

2.3851

9.0188 16.5469

2.8324

7.5281 15.4289

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

Desv. estándar n

Si

Si

2.1009 Si

104

Si

Si

2.1009 Si

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Tabla 37. Resultados prueba de estabilidad para densímetro Muestra Día Promedio Desv. estándar n

Pepsi 0

1

Colombiana 3

6

0

1

3

7

11.225

11.265

11.336

11.428

10.504

10.549

10.623

10.732

0.010

0.005

0.009

0.010

0.011

0.007

0.004

0.011

10

9

10

10

10

10

10

10

Ex

0.0000

0.0402

0.1108

0.2026

0.0000

0.0444

0.1185

0.2279

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0138

0.0134

t

2.9196

8.2585 15.1009

3.3094

8.8325 16.9867

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1098

2.1009

2.1009

2.1009

Si

Si

2.1009 Si

Si

Si

2.1009 Si

En las figuras 20, 21 y 22 se presentan las medidas de Brix contra el tiempo para ambos equipos:

Figura 20. Grados Brix en jarabes respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría

105

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Figura 21. Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría

Figura 22. Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en densimetría

Como se observa en las tablas 36 y 37, la muestra es poco estable si se deja destapada ya que, incluso a condiciones controladas, el aire se volatiliza lentamente en el transcurso del tiempo, pero lo suficiente como para producir un aumento considerable en los grados Brix. Por esto se recomienda no leer muestras destapadas luego de 24 horas transcurridas a su preparación; esto aplica específicamente para el densímetro, en el cual las muestras servidas carrusel pueden estar sin analizar más de tres horas.

106

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

A partir de los grados Brix iniciales y los encontrados después de cierto tiempo es posible calcular un estimado del porcentaje de agua perdida por evaporación (ver tabla 38), calculando un promedio para cada día y graficando los resultados se encontró una relación lineal casi perfecta (figura 23), este análisis es corroborado además por las figuras 20, 21 y 22, donde a distintas concentraciones el comportamiento de los grados Brix con respecto al tiempo es claramente lineal. Tabla 38. Promedios de porcentaje de agua perdida respecto al día de lectura Día 0.00

% Agua perdida 0

1.00

0.3637

3.00

1.0937

6.00

2.1350

Figura 23. Promedio de todos los ensayos de estabilidad en porcentaje de agua perdida respecto al tiempo

Tiempo de ultrasonido Esta prueba sólo realizada en jarabes, surge de la pregunta: ¿es necesaria la agitación de la muestra por medio de ultrasonido antes de su lectura? Después de la preparación de una muestra con alto contenido de Brix, entre 40 y 60 °B, su viscosidad alta permite la dispersión de una cantidad de burbujas minúsculas pero apreciables a la vista, con este estudio se desea encontrar si la presencia de burbujas incide significativamente en el resultado.

107

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Tabla 39. Resultados para el tiempo homogeneización en ultrasonido Estándar Tiempo (min) Promedio

40 °B 0

2

60 °B 4

8

0

2

4

8

40.023

40.020

40.026

40.027

59.998

59.980

59.980

59.973

0.008

0.012

0.010

0.008

0.013

0.015

0.017

0.008

10

10

10

10

10

10

10

10

39.994

39.994

39.994

39.994

59.993

59.993

59.993

59.993

0.000

-0.003

0.003

0.004

0.0000

-0.0180

-0.0180

-0.0250

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

t

0.2236

0.2236

0.2981

1.3416

1.3416

1.8634

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

Desv. estándar n Teórico Ex SE (s=0.03)

No

No

No

No

No

No

Según la prueba t respecto a la muestra a la cual no se le realizó la agitación por ultrasonido, se demuestra que esta homogenización no es necesaria; sin embargo para el estándar de 60 °B se recomienda un breve tiempo de reposo después su preparación, para permitir que las burbujas grandes se disipen. Cantidad de HCl 2,5 N En el laboratorio central las muestras se acidulan para su inversión con 2 gotas de HCl 2.5 N, cantidad suficiente de ácido para generar un pH que permita la inversión. Sin embargo, debido a su función de catalizador, no es necesaria una adición exacta y por lo tanto se usa un gotero en este paso. Se genera entonces la pregunta, ¿hasta qué punto es significativa la cantidad de HCl agregado? Se evaluaron tres matrices específicas: solución de sacarosa pura, Pepsi y Manzana. Esta distinción entre matrices se debe principalmente a la acidez que presentan. Una solución de sacarosa pura se puede considerar de pH neutro, mientras que los productos Pepsi y Manzana al poseer un ácido fuerte y débil respectivamente tornan la solución ácida, es decir, con un bajo pH; parámetro que, como se mencionó anteriormente, desempeña un papel fundamental en el proceso de inversión.

108

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Tabla 40. Resultados para la prueba de cantidad de HCl para refractómetro Estándar Gotas HCl

8 °B 0

1

2

14 °B 4

8

0

1

2

4

8

Promedio (°B)

8.002

8.424

8.434

8.462

8.493 13.974 14.702 14.700 14.696 14.682

Desv. estándar

0.004

0.007

0.005

0.008

0.009

Teórico (inv)

8.421

8.421

8.421

8.421

8.421 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736

6.78

2.36

2.11

1.92

1.59

6.78

2.36

2.11

1.92

1.59

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

-0.726 0.0020 0.0000

-0.004

-0.018

pH n

0.004

0.005

0.008

0.008

Ex

-0.432

SE (s=0.03)

0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134

t

32.199 0.7454

2.0870 4.3976 54.112 0.1491

0.2981 1.3416

t (crítico) ¿Efecto significativo? Muestra

2.1009 2.1009

2.1009 2.1009 2.1009 2.1009

2.1009 2.1009

Gotas HCl Promedio Desv. estándar pH

Si

-0.010 0.0000 0.0280 0.0590

0.012

No

No

Si

Si

No

Pepsi 0

1

2

No

No

4

8

Manzana 4

8

0

1

2

11.228 11.228 11.231 11.234 11.244 10.840 10.907 10.914 10.916 10.929 0.006

0.009

0.010

0.007

0.007

0.009

0.005

0.011

0.005

0.006

2.43

2.08

1.92

1.68

1.38

3.00

2.51

2.21

1.85

1.58

10

10

10

10

10

10

10

10

10

9

-0.003 0.0000 0.0030 0.0130

-0.074

n Ex

-0.003

SE (s=0.03)

0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0138

t

0.2236 0.2236

0.2236 0.9690 5.5156 0.5217

0.1491 1.0802

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009 2.1009

2.1009 2.1009 2.1009 2.1009

2.1009 2.1098

No

No

No

No

Si

-0.007 0.0000 0.0020 0.0149

No

Tabla 41. Resultados prueba de cantidad de HCl para densímetro Estándar 8 °B Gotas HCl

0

1

2

4

8

0

No

No

4

8

14 °B 1

2

Promedio

7.999

8.418

8.424

8.432

8.441 14.010 14.701 14.688 14.674 14.632

Desv. estándar

0.003

0.009

0.004

0.004

0.006

Teórico (inv)

8.421

8.421

8.421

8.421

8.421 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736

6.78

2.36

2.11

1.92

1.59

6.78

2.36

2.11

1.92

1.59

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

-0.678 0.0136 0.0000

-0.013

-0.056

pH n

0.007

0.008

0.005

0.011

Ex

-0.425

SE (s=0.03)

0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134

t

31.655 0.4398

0.5963 1.2597 50.490 1.0137

0.9988 4.1814

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009 2.1009

2.1009 2.1009 2.1009 2.1009

2.1009 2.1009

Si

-0.006 0.0000 0.0080 0.0169

0.012

No

No

No

109

Si

No

No

Si

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Muestra Gotas HCl Promedio Desv. estándar

Pepsi 0

1

2

Manzana 4

8

0

1

2

4

8

11.246 11.240 11.232 11.229 11.218 10.804 10.889 10.894 10.876 10.872 0.007

0.005

0.008

0.009

0.006

0.008

0.006

0.011

0.006

0.005

2.43

2.08

1.92

1.68

1.38

3.00

2.51

2.21

1.85

1.58

10

10

10

10

10

10

10

10

10

9

Ex

0.0135 0.0073 0.0000

-0.003

-0.014

-0.089

-0.005 0.0000

-0.018

-0.022

SE (s=0.03)

0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0138

t

1.0062 0.5441

0.2385 1.0659 6.6784 0.3578

1.3118 1.6065

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009 2.1009

2.1009 2.1009 2.1009 2.1009

2.1009 2.1098

pH n

No

No

No

No

Si

No

No

No

En las siguientes figuras, 24 y 25, se presentan los resultados de forma normalizada, en este caso y para fines de interpretación se calcularon las diferencias con respecto al valor de la muestra analizada con 8 gotas de HCl. La normalización se hizo con el fin de tener todos los puntos bajo una misma escala, permitiendo mejor su interpretación.

Figura 24. Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra para el refractómetro

110

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Figura 25. Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra para el densímetro

Brix aparente según cada instrumento para el HCl 2.5N: -

Refractómetro: 13.42 °B invertido (IR = 1.35296) Densímetro: 10.73 °B (Densidad = 1.0412 g/cm3)

En las tablas 40 y 41 se observa que los estándares de 8 y 14 °B sin adición de ácido, no invirtieron, esto porque su pH era aproximadamente neutro y no favorecía la cinética de inversión, se comprobó además que se requiere al menos una gota de HCl a 2.5 N para bajar lo suficiente el pH y realizar la inversión en menos de una hora con calentamiento. A pesar de esto, se manifiesta que agregando 8 gotas a los estándares, los valores de Brix difieren significativamente, ya que con esta cantidad de HCl se empieza a modificar la matriz y actúa como diluyente o concentrador. El HCl tiene un Brix aparente dependiendo del instrumento, para el refractómetro es de 13.42 °B y para el densímetro 10.73 °B; por esto, cuando se adicionan altas cantidades del ácido a una muestra puede concentrarla o diluirla en términos de Brix y afectar los resultados significativamente. Este efecto lo vemos más claramente en las figuras 24 y 25, para la solución de 8 °B al añadir más HCl la diferencia respecto al valor dado por la solución con 8 gotas es positiva y disminuye proporcionalmente a la cantidad de ácido agregado, esto significa que al añadir más HCl los grados Brix aumentan; en el caso de 14 °B sucede lo contrario, el ácido actúa como diluyente y los grados Brix disminuyen proporcionalmente a la cantidad agregada. Para el caso de bebidas (Pepsi y Manzana) se sabe que Pepsi tiene entre sus componentes un ácido fuerte que disminuye lo suficiente el pH como para no necesitar adición de ácido, teoría que se confirma en los dos instrumentos. En la 111

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

producción de Manzana se usa un ácido débil, este baja el pH significativamente pero no lo suficiente como para invertir la muestra totalmente en 50 minutos de calentamiento, se comprobó entonces que se requiere al menos una gota de ácido para este propósito. En general se establece que para todas las muestras se requiere adicionar al menos una gota de ácido clorhídrico en una concentración de 2.5 N, y que, especialmente para los estándares, adicionar más de 4 gotas afecta los resultados negativamente. Volumen de muestra a invertir En estos ensayos se busca determinar si el volumen a invertir es significativo en el análisis de Brix. El calentamiento se realiza en tubos de ensayo con tapa rosca, cerrados herméticamente para evitar evaporación de la muestra. Dichos tubos tienen una capacidad límite de 30 ml. En los ensayos rutinarios estos se llenan con aproximadamente 25 ml de muestra, pero es posible agregar tan sólo 20 ml si la muestra es pequeña. Tabla 42. Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para refractómetro Concentración Volumen (ml)

8 °B 20

14 °B

25

30

20

25

30

Promedio

8.448

8.448

8.440

14.70

14.71

14.70

Desv. estándar

0.006

0.008

0.007

0.012

0.008

0.011

Teórico

8.421

8.421

8.421

14.736

14.736

14.736

10

10

10

9

10

10

Ex

0.0000

0.0000

-0.0080

-0.0016

0.0000

-0.0040

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0138

0.0134

0.0134

t

0.0000

0.5963

0.1129

0.2981

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009

2.1009

2.1199

2.1098

No

No

No

No

n

112

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Tabla 43. Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para densímetro Concentración 8 °B 14 °B Volumen (ml)

20

25

30

20

25

30

Promedio

8.414

8.421

8.413

14.681

14.679

14.697

Desv. estándar

0.009

0.007

0.005

0.009

0.013

0.004

Teórico

8.421

8.421

8.421

14.736

14.736

14.736

10

10

10

9

10

10

-0.0067

0.0000

-0.0076

0.0015

0.0000

0.0173

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0138

0.0134

0.0134

t

0.4994

0.5665

0.1072

1.2895

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009

2.1009

2.1199

2.1098

No

No

No

No

n Ex

Se comprueba que el volumen de muestra a invertir no es muy relevante cuando varia en un rango de 20 a 30 ml, aunque este rango puede ser extrapolable a valores más pequeños o grandes con un grado aceptable de confianza. Tiempo de inversión Una de las variables de cuidado en el proceso de inversión es el tiempo requerido para asegurar una inversión completa. Debido a que la presión atmosférica varía dependiendo de la región geográfica, la temperatura de ebullición del agua alcanzada por el baño maría puede cambiar levemente. Cada laboratorio está en la obligación de realizar un estudio del tiempo de requerido para una inversión completa. En la norma para determinación de grados Brix de Postobón S.A. se recomienda un tiempo de 40 minutos, sin embargo, en el caso del laboratorio central se determinó un tiempo de 50 minutos para las condiciones específicas de Medellín. Con este ensayo se busca determinar un rango de tiempo en el cual se asegura una inversión completa. Tabla 44. Resultados del ensayo de tiempo de inversión para refractómetro Concentración 8 °B Tiempo (min)

15

30

40

50

60

70

Promedio

8.419

8.441

8.446

8.453

8.448

8.444

Desv. estándar

0.007

0.010

0.007

0.005

0.004

0.007

Teórico (inv)

8.421

8.421

8.421

8.421

8.421

8.421

10

10

10

10

10

10

Ex

-0.034

-0.012

-0.007 0.0000

-0.005

-0.009

SE (s=0.03)

0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134

t

2.5342 0.8944 0.5217

0.3727 0.6708

t (crítico)

2.1009 2.1009 2.1009

2.1009 2.1009

n

¿Efecto significativo?

Si

No

113

No

No

No

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Concentración

14 °B

Tiempo (min)

15

Promedio

30

40

50

60

70

14.670 14.694 14.696 14.695 14.692 14.696

Desv. estándar

0.011

Teórico (inv)

0.005

0.007

0.010

0.004

0.013

14.736 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736

n

10

10

10

10

10

Ex

-0.025

SE (s=0.03)

0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134

t

1.8634 0.0745 0.0745

0.2236 0.0745

t (crítico)

2.1009 2.1009 2.1009

2.1009 2.1009

¿Efecto significativo?

-0.001 0.0010 0.0000

10

No

No

-0.003 0.0010

No

No

No

Tabla 45. Resultados del ensayo de tiempo de inversión para densímetro Concentración

8 °B

Tiempo (min)

15

30

40

50

60

70

Promedio

8.400

8.410

8.412

8.413

8.412

8.403

Desv. estándar

0.009

0.008

0.006

0.007

0.004

0.008

Teórico (inv)

8.421

8.421

8.421

8.421

8.421

8.421

n

10

10

10

10

10

10

-0.0130

-0.0030

-0.0010

0.0000

-0.0003

-0.0101

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

t

0.9690

0.2236

0.0745

0.0224

0.7528

t (crítico)

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

¿Efecto significativo?

No

No

No

No

No

Ex

Concentración Tiempo (min) Promedio Desv. estándar Teórico (inv)

14 °B 15

40

50

70

14.655

14.687

14.683

14.681

14.684

0.011

0.005

0.008

0.011

0.014

14.736

14.736

14.736

14.736

14.736

10

10

10

10

10

n Ex

30

-0.0260

0.0057

0.0019

0.0000

0.0025

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

t

1.9379

0.4249

0.1416

0.1863

t (crítico)

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

¿Efecto significativo?

No

No

No

No

En este estudio se evaluó un rango de tiempo relativamente extenso, desde los 15 minutos hasta 70 minutos. Se encontró que sólo en el ensayo a de 8 °B y con lectura en el refractómetro, el valor encontrado para un tiempo de 15 minutos de 114

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calentamiento fue significativamente distinto. Por esto se recomienda realizar un calentamiento en un mínimo de 30 minutos, siendo 40 el tiempo aceptable. Para tiempos mayores no se encontraron diferencias apreciables, pese a esto se define un tiempo máximo de 70 minutos y así evitar efectos perjudiciales si se ejecuta el método fuera de este rango. Temperatura de inversión Normalmente los baños maría tienen un sensor de temperatura que puede no tener buena exactitud, estudiar el efecto de la temperatura sobre las muestras es necesario para reconocer qué importancia tiene esta en el proceso de inversión, y asegurar un rango de temperatura en el cual las mediciones sean confiables. Tabla 46. Resultados del ensayo de temperatura de inversión para refractómetro Concentración

8 °B

14 °B

Temperatura (°C)

50

90

95

100

Promedio

8.136

8.422

8.433

8.444

14.204

14.691

14.695

14.703

Desv. estándar

0.005

0.006

0.005

0.005

0.018

0.003

0.005

0.0067

Teórico (inv)

8.421

8.421

8.421

8.421

14.736

14.736

14.736

14.736

10

10

10

10

10

10

10

10

-0.3080

-0.0220

-0.0110

0.0000

-0.4990

-0.0120

-0.0080

0.0000

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

22.9570

1.6398

0.8199

37.1933

0.8944

0.5963

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

n Ex SE (s=0.03) t t (crítico) ¿Efecto significativo?

Si

No

No

50

90

Si

95

No

100

No

Tabla 47. Resultados del ensayo de temperatura de inversión para densímetro Concentración

8 °B

14 °B

Temperatura (°C)

50

90

95

100

Promedio

8.068

8.413

8.407

8.409

14.100

14.682

14.680

14.678

Desv. estándar

0.005

0.005

0.003

0.006

0.011

0.009

0.006

0.011

Teórico (inv)

8.421

8.421

8.421

8.421

14.736

14.736

14.736

14.736

10

10

10

10

10

10

10

10

-0.3412

0.0041

-0.0018

0.0000

-0.5780

0.0032

0.0015

0.0000

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

25.4315

0.3056

0.1342

43.0816

0.2385

0.1118

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

n Ex SE (s=0.03) t t (crítico) ¿Efecto significativo?

Si

No

No

50

Si

115

90

No

95

No

100

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Como se esperaba, solo el nivel más bajo de temperatura (50 °C) fue insuficiente para lograr una inversión completa en 50 minutos. Una temperatura de 90 °C resulta ser apta para tener una desviación no significativa respecto a los ensayos realizados a 100 °C. Agitación antes de la lectura Con esta prueba se quiere determinar la importancia y el efecto de la agitación en la lectura de las muestras. La agitación suministrada a la muestra se realiza de forma manual inmediatamente antes de la lectura y de forma suave para no crear burbujas que puedan afectar los análisis. Tabla 48. Resultados del ensayo de agitación para refractómetro y densímetro Instrumento

Refractómetro

Muestra ¿Agitación? Promedio Desv. estándar n Ex

Pepsi Si

Densímetro

Colombiana No

Si

Pepsi

No

Si

Colombiana No

Si

No

11.204

11.159

10.518

10.488

11.225

11.229

10.504

10.511

0.007

0.011

0.010

0.024

0.010

0.011

0.011

0.009

10

10

10

10

10

10

10

10

-0.0450

-0.0300

0.0037

0.0064

SE (s=0.03)

0.0134

0.0134

0.0134

0.0134

t

3.3541

2.2361

0.2758

0.4770

t (crítico) ¿Efecto significativo?

2.1009

2.1009

2.1009

2.1009

Si

Si

No

No

Estadísticamente se comprueba que la agitación para medición en el refractómetro es necesaria; cuando no se agita es probable que la sacarosa se haya estratificado en el tubo de ensayo, lo cual afectaría la medición si ésta no se homogeniza antes de servir unas cuantas gotas en el prisma. En el densímetro, a diferencia del refractómetro, la muestra es trasvasada totalmente al vial de lectura, proceso en el cual se garantiza una homogenización de la muestra sin necesidad de agitarla, efecto corroborado en las pruebas t de la tabla 48. Retardo de lectura (refractómetro) El tiempo de retardo, que en este caso solo aplica al refractómetro, es un parámetro de configuración del instrumento que permite hacer la medición cierto tiempo después de colocar la muestra sobre el prisma. Se usa principalmente cuando la muestra no está a la temperatura ambiente y por lo tanto se debe dejar un tiempo de reposo en el instrumento hasta alcanzar un equilibrio térmico. En el laboratorio central se usa un tiempo de 3 segundos, ya que a condiciones normales la muestra siempre es leída a temperatura ambiente, incluso es posible 116

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realizar la medición sin ningún tiempo de espera; en cambio, en los laboratorios de planta la muestra generalmente se encuentra fría (aprox. 10 °C) en el caso de bebidas gaseosas, por esta razón y otros factores, como la temperatura ambiente, que varían considerablemente, el tiempo de retardo puede estar entre 30 a 60 segundos, dependiendo de las condiciones puntuales en cada laboratorio de planta. En el presente estudio las muestras se someten a una lectura continua, es decir, una vez colocadas en el prisma se procede a realizar lecturas repetidas cada 12 segundos hasta un tiempo de 72 s. Este proceso se realiza por triplicado en las muestras: Colombiana y Pepsi; y a tres temperaturas: 10 ± 1 °C, ambiente (21 – 24 °C), y 30 ± 1 °C. Este ensayo no busca evaluar la robustez del método como tal, si no establecer el tiempo óptimo de retardo cuando se tiene muestras a temperatura ambiente, 10 °C, 30 °C. El densímetro posee un sistema que le permite llevar las muestras a una temperatura de 20.00 ± 0,01 °C, por esto la temperatura inicial no tiene ningún efecto relevante en la medición, pero puede influir en el tiempo que tarda el equipo en llevarla a 20.00 °C, sin embargo esto último no tiene importancia práctica y no se será valorado. Tabla 49. Resultados del ensayo de tiempo de retardo en lectura Muestra Tiempo (s) 0 12 24 36 48 60 72 Estándar Tiempo (s) 0 12 24 36 48 60 72

10 °C 10.57 10.54 10.52 10.52 10.51 10.51 10.50

Colombiana 22.5 °C 10.51 10.51 10.51 10.51 10.51 10.51 10.51

10 °C 40.05 40.03 40.02 40.01 40.00 40.00 40.00

40 °B 24 °C 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00

30 °C 10.47 10.48 10.49 10.49 10.49 10.49 10.50

30 °C 39.99 40.00 40.00 40.01 40.01 40.01 40.01

117

10 °C 11.30 11.27 11.24 11.23 11.22 11.22 11.22

Pepsi 22.5 °C 11.22 11.23 11.23 11.22 11.22 11.22 11.22

30 °C 11.17 11.18 11.19 11.19 11.19 11.20 11.20

10 °C 60.02 59.99 59.98 59.97 59.96 59.96 59.96

60 °B 24 °C 59.96 59.96 59.96 59.96 59.96 59.96 59.96

30 °C 59.92 59.93 59.94 59.95 59.95 59.95 59.95

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Figura 26. Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura en bebida gaseosa.

Figura 27. Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura en jarabe

De las gráficas 26 y 27 se puede inferir que las muestras cuando se encuentran a temperatura ambiente no necesitan ningún tiempo de retardo, ya que la lectura de grados Brix no varía en el tiempo. Por otro lado, las muestras que están a temperaturas de 10 y 30 °C necesitan un tiempo mínimo de 50 segundos para obtener estabilidad térmica y reportar una lectura en Brix constante. 118

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Adicionalmente, se observa que la medida en grados Brix es inversamente proporcional a la temperatura, tal como lo demuestra la teoría. Se define entonces que para muestras, bebidas gaseosas o jarabes, a temperatura ambiente no es necesaria una lectura con tiempo de retardo. Sin embargo, en el Laboratorio Central por experiencia, se acostumbra dejar la muestra 3 segundos en el prisma y así asegurar aún más la calidad de los resultados. Las muestras que se encentren a temperaturas distintas necesitan al menos 50 segundos de espera. Temperatura de lectura (refractómetro) Después de determinar el tiempo óptimo de lectura para muestras que no están a temperatura ambiente, se procede a evaluar el efecto de éste factor en las mediciones. De igual forma que el ensayo anterior, éste solo aplica para el refractómetro. Tabla 50. Resultados del ensayo para temperatura de lectura Muestra Temperatura (°C) Temp. Promedio Muestra (°C) Temp. Promedio Equipo (°C) Tiempo de retardo (s) Promedio Lectura (°B) Desv. estándar (°B) n Ex SE (s=0.03) t t (crítico) ¿Efecto significativo?

10 ± 1 10.7 23.8 50 10.523 0.005 9 0.007 0.014 0.471 2.120 No

Muestra Temperatura (°C) Temp. Promedio Muestra (°C) Temp. Promedio Equipo (°C) Tiempo de retardo (s) Promedio Lectura (°B) Desv. estándar (°B) Teórico (°B) n Ex SE (s=0.03) t t (crítico) ¿Efecto significativo?

10 ± 1 10.0 24.71 50 40.019 0.009 40.00 10 0.011 0.013 0.820 2.101 No

Colombiana 23 ± 2 30 ± 1 22.5 29.8 23.9 24.0 3 50 10.517 10.499 0.007 0.008 9 9 -0.018 0.014 1.257 2.120 No 40 °B 23 ± 2 24.5 24.68 3 40.008 0.004 40.00 10

119

30 ± 1 30.0 25.08 50 40.040 0.016 40.00 4 0.032 0.018 1.803 2.179 No

10 ± 1 10.3 23.9 50 11.224 0.014 10 0.007 0.013 0.522 2.101 No

10 ± 1 9.8 24.79 50 59.978 0.015 60.00 10 -0.007 0.013 0.522 2.101 No

Pepsi 23 ± 1 22.5 23.8 3 11.217 0.012 10

60 °B 23 ± 1 24.5 24.79 3 59.985 0.014 60.00 10

30 ± 1 30.0 24.1 50 11.204 0.008 10 -0.013 0.013 0.969 2.101 No

30 ± 1 30.2 24.89 50 59.992 0.029 60.00 10 0.007 0.013 0.522 2.101 No

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Bajo las condiciones dadas se establece que la temperatura inicial de la muestra no afecta significativamente los resultados. 5.3.8.2.

Especifidad

Las concentraciones reales (g / 100 g solución) de las soluciones preparadas bajo los lineamientos del diseño de experimento para esta prueba se muestran en la tabla 51. Tabla 51. Concentraciones reales de las soluciones placebo preparadas para la especifidad Solución g agua g totales 𝒙𝑨 𝒙𝑩 𝒙𝑪 𝒙𝑫 𝒙𝑬 𝒙𝑭 1

13.9972

0.0000

0.0520

0.0000

0.0000

0.0000

85.9508

100.0000

2

13.9971

0.4006

0.0677

0.0000

0.1228

0.4254

84.9865

100.0000

3

8.0005

0.0000

0.0000

0.0458

0.1368

0.0000

91.8169

100.0000

4

13.9965

0.0000

0.0660

0.0458

0.0000

0.4235

85.4682

100.0000

5

8.0002

0.0000

0.0497

0.0447

0.1889

0.0000

91.7165

100.0000

6

13.9999

0.4004

0.0000

0.0433

0.0000

0.4205

85.1360

100.0000

7

14.0003

0.4019

0.0000

0.0435

0.1216

0.0000

85.4327

100.0000

8

13.9962

0.0000

0.0000

0.0000

0.1480

0.4319

85.4239

100.0000

9

8.0001

0.0000

0.0000

0.0000

0.0000

0.4255

91.5744

100.0000

10

8.0000

0.4026

0.0574

0.0000

0.1295

0.0000

91.4105

100.0000

11

8.0001

0.3996

0.0000

0.0000

0.0000

0.4500

91.1503

100.0000

12

7.9988

0.4009

0.0847

0.0434

0.0000

0.0000

91.4722

100.0000

Las respuestas como °B de cada una de las soluciones son las siguientes: Tabla 52. Respuesta en °B para las soluciones placebo en el análisis de especifidad Instrumento Refractómetro Densímetro Solución

𝒚 (Dto)

𝒚 (Inv)

𝒚 (Dto)

𝒚 (Inv)

1

14.04

14.96

14.089

14.796

2

14.62

15.31

14.724

15.376

3

8.13

8.53

8.064

8.487

4

14.27

15.01

14.294

15.000

5

8.16

8.57

8.136

8.545

6

14.57

15.29

14.644

15.321

7

14.46

15.15

14.488

15.173

8

14.21

14.90

14.184

14.854

9

8.17

8.61

8.160

8.585

10

8.50

8.86

8.536

8.932

11

8.57

9.01

8.620

9.055

12

8.51

8.90

8.582

8.974

120

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Usando una regresión múltiple por el método de mínimos cuadrados, se calculan las sensibilidades parciales reportadas en la tabla 53. Tabla 53. Sensibilidades parciales para los componentes presentes en las soluciones placebo Equipo Refractómetro Densímetro

Directo Invertido Directo Invertido

𝑺𝑨𝑨 0.9963 1.0551 1.0011 1.0462

𝑺𝑨𝑩 0.9323 0.7772 1.0863 1.0408

𝑺𝑨𝑪 0.8214 0.6970 1.4028 1.1905

𝑺𝑨𝑫 1.0480 -0.1425 0.7212 0.7259

𝑺𝑨𝑬 0.3232 -0.3075 0.1278 -0.0279

𝑺𝑨𝑭 0.3684 0.1882 0.3836 0.3614

𝒚𝟎 0.0551 0.1270 -0.0033 0.0798

𝒓𝟐 1.000 1.000 1.000 1.000

Las especifidades calculadas para cada solución son las siguientes: Tabla 54. Especifidades calculadas para las soluciones placebo Instrumento

Refractómetro

Densímetro

Solución

𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒅𝒕𝒐 )

𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒊𝒏𝒗 )

𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒅𝒕𝒐 )

𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒊𝒏𝒗 )

1

0.9969

0.9976

0.9948

0.9958

2

0.9571

0.9688

0.9518

0.9572

3

0.9886

0.9943

0.9937

0.9956

4

0.9818

0.9911

0.9799

0.9822

5

0.9817

0.9884

0.9845

0.9886

6

0.9605

0.9739

0.9571

0.9606

7

0.9681

0.9765

0.9667

0.9700

8

0.9854

0.9915

0.9870

0.9892

9

0.9807

0.9906

0.9800

0.9820

10

0.9449

0.9555

0.9374

0.9446

11

0.9367

0.9553

0.9296

0.9353

12

0.9422

0.9573

0.9318

0.9384

Como se puede corroborar en la tabla 54, las especifidades calculadas para todas las soluciones fueron mayores a 0.90. Se verifica entonces la adecuada especifidad del método en la matriz de bebida gaseosa. Como conclusión adicional, esta prueba confirma la hipótesis del factor de inversión; se puede apreciar que para las soluciones invertidas la sensibilidad parcial de la sacarosa es de 1.0551 y 1.0462, para el refractómetro y densímetro respectivamente, valores muy cercanos al factor de inversión teórico 1.0526. 5.3.8.3.

Linealidad

Las respuestas entregadas por ambos equipos este estudio se reportan en las tablas 55, 56, 57, 58 y 59.

121

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Resultados para lectura en densímetro -

Brix invertido

Tabla 55. Resultados para linealidad por densimetría en Brix invertido °B Teórico

°B Inv. Teórico

7.000

3

Lectura densidad (g/cm )

Lectura °B Inv.

1

2

3

Promedio 3 (g/cm )

7.369

1.02734

1.02734

1.02737

1.02735

7.367

7.367

7.373

7.369

8.000

8.421

1.03163

1.03163

1.03161

1.03162

8.421

8.422

8.417

8.420

9.001

9.474

1.03592

1.03592

1.03591

1.03592

9.468

9.469

9.466

9.468

10.000

10.526

1.04020

1.04023

1.04024

1.04022

10.504

10.512

10.514

10.510

11.000

11.579

1.04459

1.04457

1.04458

1.04458

11.559

11.554

11.556

11.556

11.499

12.104

1.04678

1.04678

1.04676

1.04677

12.069

12.082

12.078

12.076

12.000

12.631

1.04896

1.04898

1.04893

1.04896

12.601

12.607

12.594

12.601

13.000

13.684

1.05339

1.05330

1.05335

1.05335

13.651

13.628

13.642

13.640

14.000

14.737

1.05782

1.05780

1.05776

1.05779

14.691

14.687

14.678

14.685

14.999

15.788

1.06225

1.06225

1.06229

1.06226

15.725

15.725

15.733

15.728

-

1

2

3

Promedio (°B inv.)

Brix directo

Tabla 56. Resultados para linealidad por densimetría en Brix directo °B Teórico

3

Lectura densidad (g/cm ) 1

2

3

7.000

1.02583

1.02585

1.02585

8.000

1.02991

1.02991

9.000

1.03401

10.000

Promedio

Lectura °B directo

Promedio

1

2

3

1.02584

6.996

6.999

6.999

6.998

1.02993

1.02992

8.000

8.001

8.004

8.002

1.03401

1.03401

1.03401

9.004

9.002

9.004

9.003

1.03813

1.03813

1.03813

1.03813

10.002

10.003

10.004

10.003

11.000

1.04228

1.04228

1.04228

1.04228

11.004

11.005

11.006

11.005

11.500

1.04436

1.04437

1.04437

1.04437

11.505

11.505

11.504

11.505

12.000

1.04639

1.04647

1.04641

1.04642

11.989

12.010

11.993

11.997

13.000

1.05062

1.05070

1.05066

1.05066

12.994

13.014

13.004

13.004

13.997

1.05480

1.05485

1.05487

1.05484

13.983

13.994

14.000

13.992

15.000

1.05917

1.05915

1.05916

1.05916

15.008

15.003

15.004

15.005

122

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Resultados para lectura en refractómetro -

Brix invertido

Tabla 57. Resultados para linealidad por refractometría en Brix invertido Lectura índice de refracción 1 2 3

°B Teórico

°B Inv. Teórico

Promedio (IR)

7.000

7.369

1.34372

1.34372

1.34372

8.000

8.421

1.34531

1.34531

1.34531

9.001

9.474

1.34692

1.34692

10.000

10.526

1.34849

11.000

11.579

11.499

Lectura °B Inv.

Promedio (°B inv.)

1

2

3

1.34372

7.37

7.37

7.37

7.37

1.34531

8.43

8.43

8.43

8.43

1.34693

1.34692

9.50

9.50

9.51

9.50

1.34849

1.34849

1.34849

10.53

10.53

10.53

10.53

1.35010

1.35010

1.35009

1.35010

11.57

11.58

11.57

11.57

12.104

1.35090

1.35090

1.35091

1.35090

12.11

12.09

12.10

12.10

12.000

12.631

1.35172

1.35171

1.35171

1.35171

12.62

12.61

12.62

12.62

13.000

13.684

1.35332

1.35332

1.35332

1.35332

13.65

13.65

13.65

13.65

14.000

14.737

1.35498

1.35497

1.35496

1.35497

14.71

14.69

14.69

14.70

14.999

15.788

1.35664

1.35664

1.35664

1.35664

15.76

15.76

15.76

15.76

-

Brix directo (rango bajo)

Tabla 58. Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango bajo °B Teórico

Lectura índice de refracción 1

2

3

Promedio (IR)

7.000

1.34325

1.34326

1.34325

8.000

1.34477

1.34476

9.000

1.34630

10.000 11.000

Lectura °B directo 1

2

3

Promedio (°B)

1.34325

7.00

7.01

7.00

7.00

1.34477

1.34477

8.00

8.00

8.00

8.00

1.34630

1.34633

1.34631

9.01

9.01

9.02

9.01

1.34785

1.34786

1.34786

1.34786

10.02

10.03

10.02

10.02

1.34936

1.34936

1.34936

1.34936

11.00

11.00

11.00

11.00

11.500

1.35014

1.35014

1.35014

1.35014

11.50

11.50

11.50

11.50

12.000

1.35093

1.35093

1.35092

1.35093

12.00

12.01

12.00

12.00

13.000

1.35247

1.35250

1.35248

1.35248

12.99

13.01

12.99

13.00

13.997

1.35401

1.35401

1.35402

1.35401

13.96

13.96

13.96

13.96

15.000

1.35566

1.35566

1.35567

1.35566

14.99

14.99

15.00

14.99

123

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

-

Brix directo (rango alto)

Tabla 59. Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango alto °B Teórico

Lectura índice de refracción 1

2

3

Promedio (IR)

7.000

1.34326

1.34326

1.34327

8.000

1.34477

1.34477

9.000

1.34632

1.34633

10.000

1.34787

11.000

Lectura °B directo 1

2

3

Promedio (°B)

1.34326

7.01

7.01

7.01

7.01

1.34477

1.34477

8.00

8.01

8.01

8.01

1.34632

1.34632

9.03

9.03

9.03

9.03

1.34787

1.34787

1.34787

10.03

10.03

10.03

10.03

1.34936

1.34937

1.34936

1.34936

11.00

11.00

11.00

11.00

11.500

1.35015

1.35016

1.35016

1.35016

11.51

11.51

11.51

11.51

12.000

1.35094

1.35093

1.35094

1.35094

12.01

12.01

12.01

12.01

13.000

1.35249

1.35251

1.35248

1.35249

13.00

13.01

12.99

13.00

13.997

1.35405

1.35403

1.35405

1.35404

13.98

13.97

13.98

13.98

15.000

1.35567

1.35569

1.35568

1.35568

15.00

15.01

15.00

15.00

30.000

1.38109

1.38109

1.38110

1.38109

29.98

29.98

29.98

29.98

34.998

1.39032

1.39032

1.39032

1.39032

35.01

35.01

35.01

35.01

39.998

1.39986

1.39987

1.39987

1.39987

40.01

40.01

40.01

40.01

45.000

1.40974

1.40976

1.40975

1.40975

44.99

45.00

45.00

45.00

50.000

1.42009

1.42008

1.42006

1.42008

50.01

50.01

50.00

50.01

55.000

1.43082

1.43082

1.43082

1.43082

55.02

55.02

55.02

55.02

60.000

1.44187

1.44184

1.44187

1.44186

59.98

60.00

59.99

59.99

64.999

1.45348

1.45346

1.45345

1.45346

65.01

65.00

65.00

65.00

Regresión lineal y homoscedasticidad de los residuos Cada ensayo se ajusta a una regresión lineal y se hallan los correspondientes parámetros, presentados en la tabla 60. Tabla 60. Parámetro de regresión lineal en el análisis de linealidad Densímetro Equipo 𝑏(pendiente) 𝑎(intersecto) 𝑟 𝑟2 𝑆𝑏2 𝑆𝑎2

Invertido

Directo

Invertido

0.00414 0.99668 0.99997 0.99994 3.967E-11 5.631E-09

0.00416 0.99659 0.99997 0.99993 4.309E-11 5.521E-09

0.00153 1.33240 0.99997 0.99993 5.832E-12 8.279E-10

124

Refractómetro Directo (rango bajo) 0.00155 1.33239 0.99996 0.99992 6.970E-12 8.930E-10

Directo (rango alto) 0.00186 1.32843 0.99866 0.99732 1.781E-10 2.016E-07

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

La linealidad en ambos instrumentos teóricamente es polinómica, incluso los polinomios usados para convertir IR o densidad a grados Brix tienen en la literatura un orden de 4 ó 5. Sin embargo cuando se evalúan rangos estrechos en este caso 7 y 15 °B, se puede ver claramente una linealidad alta confirmada en las gráficas y en los coeficientes de correlación (mayores a 0.999). En el caso de lecturas por refractometría para un rango de 7 a 65 °B no cumple este último criterio, y por esta razón podemos asumir la no linealidad. La regresión en este rango más amplio se recalculó usando un polinomio de grado 2, que arrojó los siguientes parámetros ajustados a una ecuación del tipo: 𝑦 = 𝑎𝑥 2 + 𝑏𝑥 + 𝑐 (90) Tabla 61. Parámetros de regresión polinómica en el análisis de linealidad por refractometría en rango alto.

𝑎 𝑏 𝑐 𝑟 𝑟2

Directo (rango alto) 7.3600E-06 1.3661E-03 1.3334 1.0000 1.0000

Para el densímetro se obtuvo las siguientes gráficas: -

Brix Invertido

Figura 28. Regresión lineal para densidad respecto a °B invertido

125

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Figura 29. Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada para Brix invertido

-

Brix directo

Figura 30. Regresión lineal para densidad respecto a Brix directo

Figura 31. Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada para Brix directo

126

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

De las lecturas por refractometría se obtuvo las siguientes figuras de regresión lineal y homoscedasticidad: -

Brix Invertido

Figura 32. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix invertido

Figura 33. Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix invertido

-

Brix directo (rango bajo)

Figura 34. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango bajo

127

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

Figura 35. Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix directo en rango bajo

-

Brix directo (rango alto)

Figura 36. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango alto

Figura 37. Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix directo en rango alto

128

Informe Práctica Profesional POSTOBÓN S.A.

ANOVA y verificación de supuestos en linealidad Tabla 62. ANOVA y pruebas de verificación de supuestos para linealidad Densímetro Equipo

Invertido

Directo

Invertido

Refractómetro Directo Directo (rango bajo) (rango alto)

Verificación de supuestos (homogeneidad y normalidad de residuos) 𝐶𝐸𝑋𝑃 𝐶(𝑘, 𝑣, 𝛼) ¿Homogénea? 𝛼 = 0.05 ¿Normal? 𝛼 = 0.05 (Kolmogorov-Smirnov)

0.386 0.445

0.344 0.445

0.429 0.445

0.425 0.445

0.191 0.296

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

ANOVA 𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺

3.438E-03

3.127E-03

4.689E-04

4.320E-04

7.251E-02

𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆

2.223E-07

2.179E-07

3.268E-08

3.525E-08

1.949E-04

𝑆𝐶𝐹𝐴

2.118E-07

2.079E-07

3.221E-08

3.374E-08

1.949E-04

𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃

1.053E-08

1.007E-08

4.667E-10

1.507E-09

3.133E-09

𝑆𝐶𝑇

3.438E-03

3.127E-03

4.690E-04

4.321E-04

7.271E-02

𝐺𝐿𝑅𝐸𝐺

1

1

1

1

1

𝐺𝐿𝑅𝐸𝑆

28

28

28

28

52

𝐺𝐿𝐹𝐴

8

8

8

8

16

𝐺𝐿𝐸𝑋𝑃

20

20

20

20

36

𝐺𝐿 𝑇

29

29

29

29

53

𝑉𝑅𝐸𝐺

3.438E-03

3.127E-03

4.689E-04

4.320E-04

7.251E-02

𝑉𝑅𝐸𝑆

7.939E-09

7.784E-09

1.167E-09

1.259E-09

3.748E-06

𝑉𝐹𝐴

2.647E-08

2.598E-08

4.027E-09

4.218E-09

1.218E-05

𝑉𝐸𝑋𝑃

5.267E-10

5.033E-10

2.333E-11

7.537E-11

8.704E-11

𝐹1

432999.89

401693.34

401762.6

343169.509

19348.32496

4.196

4.196

4.196

4.196

4.027

𝐹1.𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 ¿Pendiente ≠ 0?

Si

Si

𝐹2

50.261

51.624

172.575

55.963

139935.401

𝐹2.𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠

2.447

2.447

2.447

2.447

1.934

¿Linealidad?

No

Si

No

No

129

Si

No

Si

No

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Significancia de la pendiente e intercepto Tabla 63. Pruebas de significancia para pendiente e intercepto Densímetro Equipo

Invertido

𝑏 𝑡𝑏 Intervalo (𝑏)

Mayor Menor

¿𝑏 ≠ 0 ? 𝑎 𝑡𝑎 Intervalo (𝑎) ¿𝑎 = 0?

Mayor Menor

0.00414 2.048 0.004157 0.004132 Si 0.99668 2.048 0.99683 0.99652 No

Directo 0.00416 2.048 0.004174 0.004147 Si 0.99659 2.048 0.99674 0.99644 No

Invertido 0.00153 2.048 0,001536 0,001526 Si 1.33240 2.048 1,33246 1,33235 No

Refractómetro Directo Directo (rango bajo) (rango alto) 0,00155 0,00186 2,048 2,048 0,001552 0,001883 0,001541 0,001829 Si Si 1,33239 1,32843 2,048 2,048 1,33245 1,32933 1,33233 1,32753 No No

El método llevado a cabo por densimetría y refractometría en rango bajo, directo o invertido, tiene un coeficiente de correlación satisfactorio; sin embargo la homoscedastisidad, especialmente en el densímetro, nos muestra una curva de residuos en forma de U invertida muy similar a la que se debería obtener de datos que siguen una función polinómica. De la misma manera, el método falla en linealidad según la prueba ANOVA para regresión, esto porque la repetibilidad de cada serie de datos es muy buena (numéricamente baja), y aumenta significativamente el valor F2, usado para la verificación de linealidad. Pese a esto se corrobora que la pendiente es estadísticamente diferente de cero tanto en la ANOVA como en la prueba t de significancia. El intercepto de la regresión lineal para los dos métodos es diferente de cero, hecho indiscutible teniendo en cuenta que para ambos equipos el mínimo valor de Brix es el obtenido cuando se analiza agua destilada, que tiene una señal distinta de cero, 0.99820 g/cm3 para el densímetro y un índice de refracción 1.333 para el refractómetro. Las lecturas en refractometría para rango alto son claramente no lineales, hecho que se puede verificar directamente en la gráfica o en el coeficiente de correlación 0.9986. En general se puede confirmar la no linealidad entre las señales, densidad e índice de refracción, y los grados Brix de las soluciones. Sin embargo si tenemos como criterio único el coeficiente de correlación, se puede asumir con un buen grado de confianza, que existe una buena linealidad para un rango de 7 a 14 °B en ambos equipos.

130

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5.3.8.4.

Rango

A partir de los datos de linealidad obtenemos la recuperación y sesgo a distintas concentraciones, reportados en las tablas 64, 65 y 66. Con estos valores se establece el rango de trabajo permitido. Tabla 64. Recuperación (%) para datos de linealidad Densímetro Concentración/Equipo 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 11.50 12.00 13.00 14.00 15.00

Invertido

Directo

100.00 99.99 99.93 99.85 99.81 99.77 99.76 99.68 99.65 99.62

99.96 100.02 100.04 100.03 100.04 100.04 99.98 100.03 99.96 100.03

Refractómetro Directo Invertido (rango bajo) 100.02 100.04 100.11 100.00 100.31 100.15 100.04 100.23 99.95 100.00 99.97 100.00 99.89 100.03 99.75 99.98 99.73 99.73 99.82 99.95

Tabla 65. Sesgo (°B) para datos de linealidad Densímetro Concentración/Equipo 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 11.50 12.00 13.00 14.00 15.00

Invertido

Directo

0.000 -0.001 -0.006 -0.016 -0.023 -0.027 -0.030 -0.043 -0.051 -0.060

-0.002 0.002 0.003 0.003 0.005 0.004 -0.003 0.004 -0.005 0.005

Refractómetro Directo Invertido (rango bajo) 0.001 0.003 0.009 0.000 0.029 0.013 0.004 0.023 -0.006 0.000 -0.004 0.000 -0.014 0.003 -0.034 -0.003 -0.040 -0.037 -0.028 -0.007

Los dos equipos tanto en Brix invertido como directo presentan una excelente recuperación en las concentraciones evaluadas; sin embargo, el sesgo en las lecturas invertidas son claramente altas. Esto puede tener varias causas: la muestra no fue totalmente invertida, aunque ya se ha verificado que la inversión si es total, o la sacarosa pesada tenía trazas de otros componentes, en esto último afecta principalmente la humedad. Las lecturas en Brix invertido en el densímetro tienen un sesgo aceptable para concentraciones entre 7 y 12 °B, en directo se acepta todo el rango (7 a 15 °B). Similarmente en el refractómetro para el rango de calibración bajo se recomienda 131

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una lectura entre 7 y 12 °B para muestras invertidas, y entre 7 y 13 °B para directas. Tabla 66. Recuperación y sesgo (°B) para datos de linealidad por refractometría en rango alto Refractómetro (Rango alto) %R Sesgo (°B) 100.14 0.010 100.08 0.007 100.33 0.030 100.30 0.030 100.00 0.000 100.08 0.010 100.08 0.010 100.00 0.000 99.85 -0.021 100.02 0.003 99.93 -0.020 100.03 0.012 100.03 0.012 99.99 -0.003 100.01 0.006 100.04 0.020 99.98 -0.010 100.01 0.007

Concentración/Equipo 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 11.50 12.00 13.00 14.00 15.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00

Para el caso específico de análisis de grados Brix en jarabes (rango alto), el sesgo es aceptable en todo el rango evaluado (7 a 65 °B), sin embargo las lecturas de Brix a concentraciones bajas (9 y 10 °B) tienen un sesgo alto. Por lo tanto se recomienda no hacer mediciones a soluciones con similares concentraciones cuando se tiene calibrado el refractómetro para lecturas en rango alto. 5.3.8.5.

Sensibilidad

Para las respuestas aproximadamente lineales la sensibilidad se expresa como la pendiente de la ecuación de calibración, según la tabla 67. Tabla 67. Sensibilidades para respuestas aproximadamente lineales Densímetro Concentración/Equipo

Sensibilidad

Refractómetro

Invertido 𝒈/𝒄𝒎𝟑 °𝑩

Directo 𝒈/𝒄𝒎𝟑 °𝑩

Invertido 𝑰𝑹 °𝑩

Directo (rango bajo) 𝑰𝑹 °𝑩

0.004145

0.004161

0.001531

0.001547

132

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En el caso de respuestas no lineales (rango alto), se puede usar la siguiente ecuación, que corresponde a la derivada del polinomio y así calcular la sensibilidad a distintas concentraciones: 𝑦 = 1,472 ∗ 10−5 𝑥 + 1,3661 ∗ 10−3 (91) Donde 𝑥 es la concentración en grados Brix y 𝑦 la sensibilidad en 𝑰𝑹 °𝑩 De igual forma en la tabla 68 está reportada la sensibilidad para distintas concentraciones. Tabla 68. Sensibilidades a varias concentraciones para rango alto en refractometría Directo (rango alto) °B

Sensibilidad

7.00

0.00147

8.00

0.00148

9.00

0.00150

10.00

0.00151

11.00

0.00153

11.50

0.00154

12.00

0.00154

13.00

0.00156

14.00

0.00157

15.00

0.00159

30.00

0.00181

35.00

0.00188

40.00

0.00195

45.00

0.00203

50.00

0.00210

55.00

0.00218

60.00

0.00225

65.00

0.00232

𝑰𝑹 °𝑩

Estas sensibilidades son numéricamente bajas, sin embargo si tomamos en cuenta la precisión de cada instrumento en la señal de respuesta, 0.00003 como índice de refracción para el refractómetro y 0.000005 g/cm3 para el densímetro, se puede observar que la sensibilidad es relativamente alta

133

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5.3.8.6.

Precisión

Repetibilidad La repetibilidad instrumental en el densímetro aunque fue calculada no se ajusta a los requerimientos necesarios para ser considerada como repetible, ya que el instrumento cuando realiza la lectura en una muestra puede regresar parte de esta al vial con la muestra original y contaminarla, después de la tercera lectura se obtienen datos no concordantes e incluso se obtienen desviaciones estándar mayores a las obtenidas en la repetibilidad del método, lo cual es claramente improbable. El rango alto (hasta 60 °B) para el refractómetro se usa específicamente en la lectura de jarabes, estas muestras no son sometidas a ningún tipo de inversión y por lo tanto su análisis no requiere ningún pre-tratamiento, por tal motivo la repetibilidad del método será la misma que la repetibilidad del instrumento. Los resultados a distintas concentraciones en el análisis de repetibilidad se reportan en la tabla 69. Tabla 69. Repetitividades para densimetría y refractometría Densímetro Concentración (°B inv.) n

Refractómetro

8.421

11.579

14.736

8.421

11.579

14.736

40.00

60.00

10

10

10

10

10

10

10

10

11.567 11.556

14.673 14.700

40.008

59.985

0.0048 0.0047

0.0042

0.0135

0.0329 0.0321

0.0105

0.0225

Promedio (°B) Instrumento Método

N/A 8.424

N/A 11.546

N/A 14.688

8.411 8.434

Desviación estándar (°B) Instrumento Método

N/A 0.0035

N/A 0.0033

N/A 0.0080

0.0032 0.0051

0.0048 0.0070

Coeficiente de variación CV (%) Instrumento Método

N/A 0.0416

N/A 0.0289

N/A 0.0548

0.0376 0.0612

0.0418 0.0605

Los intervalos de confianza para los promedios se calculan a partir de un 𝑡 = 2,2622, calculado para 𝛾 = 9 y 𝛼 = 0,05.

134

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Tabla 70. Intervalos de confianza para densimetría y refractometría en el análisis de repetibilidad Concentración Teórica (°B inv.) 8.421 11.579 14.736 40.00 60.00

Densímetro (°B) Instrumento Método N/A 8.424±0.00251 N/A 11.546±0.00238 N/A 14.688±0.00575 N/A N/A N/A N/A

Refractómetro (°B) Instrumento Método 8.411±0.00226 8.434±0.00369 11.567±0.00346 11.556±0.00500 14.673±0.00346 14.700±0.00337 40.008±0.00302 59.985±0.00969

Precisión intermedia Antes de realizar cualquier análisis sobre la precisión intermedia se debe determinar si los analistas tienen una varianza similar, para esto usamos una prueba F tal como se indica en la tabla 71. Tabla 71. Verificación de varianzas similares entre analistas para precisión intermedia Equipo Concentración (°B inv.) n (por analista) 𝐹 𝛾1 = 𝛾2 𝐹1−∝/2 𝐹∝/2 ¿Varianzas iguales? (𝛼 = 0.05)

Densímetro 8.421 14.736 9 9 0.860 1.109 8 8 0.226 0.226 4.433 4.433 Si

Si

Refractómetro 8.421 14.736 9 9 1.688 1.000 8 8 0.226 0.226 4.433 4.433 Si

Si

Tabla 72. Resultados del análisis de precisión intermedia Equipo Concentración (°B inv.) n (por analista) n (total)

Densímetro 8.421 14.736 9 9 18 18

Refractómetro 8.421 14.736 9 9 18 18

Promedio (°B) Analista 1 Analista 2 Total

8.412 8.416 8.414

14.676 14.679 14.677

8.427 8.432 8.429

14.683 14.683 14.683

0.00866 0.00667 0.00802

0.00500 0.00500 0.00485

0.1028 0.0791 0.0952

0.0341 0.0341 0.0330

Desviación estándar (°B) Analista 1 Analista 2 Total

0.00592 0.00638 0.00628

0.00985 0.00935 0.00949

Coeficiente de variación CV (%) Analista 1 Analista 2 Total

0.0703 0.0758 0.0746

0.0671 0.0637 0.0646

135

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Los intervalos de confianza de los promedios se calculan para cada analista a partir de un 𝑡 = 2,306, calculado para 𝛾 = 8 y 𝛼 = 0,05, en el caso del intervalo de confianza global un 𝑡 = 2,1098, calculado para 𝛾 = 17 y 𝛼 = 0,05 Tabla 73. Intervalos de confianza para la precisión intermedia Intervalos de confianza Equipo Concentración (°B inv.) Analista 1 Analista 2 Total

Densímetro

Refractómetro

8.421

14.736

8.421

14.736

8.412±0.00455 8.416±0.00490 8.414±0.00312

14.676±0.00757 14.679±0.00719 14.677±0.00472

8.427±0.00666 8.432±0.00512 8.429±0.00399

14.683±0.00384 14.683±0.00384 14.683±0.00241

El método pasa los criterios de aceptación para la repetibilidad y precisión intermedia en las concentraciones evaluadas, las desviaciones estándar son menores a 0.02 y 0.03 °B respectivamente, y la precisión intermedia es menor a dos veces la repetibilidad del método en términos del coeficiente de variación coeficiente de variación. Cabe anotar que a los jarabes no se les hace ningún pre-tratamiento, la lectura se realiza directamente en el refractómetro y prácticamente en ausencia de pasos intermedios, por esto se puede asumir que la repetibilidad del método y precisión intermedia son similares. 5.3.8.7.

Exactitud

Exactitud por datos de linealidad Ver tablas 64 y 65. Exactitud por patrones En el densímetro para la calibración con agua destilada se calculan los siguientes sesgos: Tabla 74. Resultados de exactitud para calibración con agua destilada en densimetría Patrón

T (°C)

Agua ultra-pura

20

Densidad Teórica 3 (g/cm ) 0.99820

n 5

Densidad Promedio 3 (g/cm ) 0.998204

Sesgo 3 (g/cm ) 0.000004

En la calibración con patrón de referencia se calcula el sesgo de la señal y de grados Brix arrojando los siguientes resultados:

136

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Tabla 75. Resultados de exactitud para calibración con patrón de referencia en densimetría Estándar Agua 8 °B 11 °B 14 °B Estándar Agua 8 °B 11 °B 14 °B

T (°C) 20.00 20.00 20.00 20.00

Densidad Teórica 3 (g/cm ) 0.99820 1.02995 1.04230 1.05495

T (°C) 20.00 20.00 20.00 20.00

3 3 3 3

Densidad Promedio 3 (g/cm ) 0.99817 1.02989 1.04227 1.05490

°B Teórico

n

°B Promedio

%R

Sesgo (°B)

0.000 8.000 11.000 14.000

3 3 3 3

7.994 11.003 14.007

99.921 100.030 100.052

-0.006 0.003 0.007

n

Sesgo 3 (g/cm ) -0.00003 -0.00006 -0.00003 -0.00005

Para el análisis de Brix en el refractómetro se calcularon los siguientes sesgos: Tabla 76. Resultados de exactitud para refractómetro en un rango de calibración alto y bajo Rango

Bajo

Alto

Patrón

T (°C)

°B Teórico

n

°B Promedio

%R

Sesgo

AG12.50

23.9

12.17

3

12.183

100.11

0.013

Solución sacarosa 25.00 °B

23.9

25.00

3

24.987

99.95

-0.013

Solución sacarosa 25.00 °B

23.3

25.00

3

25.020

100.08

0.020

Solución sacarosa 60.00 °B

23.2

60.00

3

60.020

100.03

0.020

OIL BSLP23

23.1

71.35

1

71.380

100.04

0.030

El método en general es satisfactorio teniendo en cuenta los criterios de aceptación, todos los sesgos fueron menores a 0,03 °B en el rango de trabajo y respecto a los patrones que, en algunos casos, superaban las concentraciones de los rangos de calibración. 5.3.8.8.

Incertidumbre

Debido a que los datos se encuentran agrupados en conjuntos de 10 lecturas y a diferentes concentraciones, es necesario el cálculo por el procedimiento de suma de cuadrados.

137

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Método por densimetría Tabla 77. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando densímetro Ensayo 1 2 3 4 5 6 Promedio (°B) Desv. estándar (°B) ni 2

SCi (°B ) Parámetro 2

SCP (°B ) 2

11.23

10.50

11.23

10.89

11.23

10.50

0.010

0.011

0.008

0.011

0.010

0.011

10

10

10

10

10

10

0.0008656

0.0011641

0.0005401

0.0010081

0.0008656

0.0011641

Valor

Observación

0.0056076

VP (°B )

0.0001038

SDP (°B)

0.0101904

SDr (°B)

0.00804

SDL (°B)

0.00626

2*SDL (°B)

0.01251

Sesgo (°B)

0.007

U (°B)

0.02038

Corresponde a la mayor desviación estándar en el estudio de repetibilidad del método para el densímetro (tabla 69)

Corresponde al mayor sesgo encontrado en el densímetro (tabla 75) Nivel de confianza de 95 % y asumiendo distribución normal de los datos.

Método por refractometría (rango bajo) Tabla 78. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando refractómetro en un rango de calibración bajo Ensayo 1 2 3 4 5 6 Promedio (°B) Desv. estándar (°B) ni 2

SCi (°B ) Parámetro 2

SCP (°B ) 2

11.20

10.52

11.23

10.91

11.20

10.52

0.007

0.010

0.010

0.011

0.007

0.010

10

10

10

10

10

10

0.00044

0.00096

0.00089

0.00104

0.00044

0.00096

Valor 0.0059400

VP (°B )

0.0000943

SDP (°B)

0.0097101

SDr (°B)

0.00699

SDL (°B)

0.00674

2*SDL (°B)

0.01348

Sesgo (°B)

0.013

U (°B)

Observación

0.01942

Corresponde a la mayor desviación estándar en el estudio de repetibilidad del método para el refractómetro en el rango bajo (tabla 69)

Corresponde al mayor sesgo encontrado en el refractómetro para el rango bajo (tabla 76) Nivel de confianza de 95 % y asumiendo distribución normal de los datos.

138

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Método por refractometría (rango alto) Tabla 79. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando refractómetro en un rango de calibración alto Muestra Control 60 °B 59.987

Parámetro Promedio (°B) Desv. estándar (°B)

0.0141

ni

30 2

SCi (°B ) Parámetro 2

Valor

VP (°B )

0.0001995

SDP (°B)

0.0141259

SDr (°B)

0.0135

SDL (°B)

0.00416

2*SDL (°B)

0.00832

Sesgo (°B)

0.030

U (°B)

0.00579

0.02825

Observación

Corresponde a la desviación estándar en el estudio de repetibilidad para el refractómetro a 60 °B (tabla 69)

Corresponde al mayor sesgo encontrado en el refractómetro para rango alto (tabla 76) Nivel de confianza de 95 % y asumiendo distribución normal de los datos.

El estimado de la incertidumbre es muy bajo y satisfactorio, menor a 0.06 °B. Se resalta que este parámetro está asociado al Laboratorio Central, el cual dispone de buenos equipos y se encuentra metrológicamente un rango más alto que los laboratorios ubicados en las plantas productoras. Un hecho peculiar se reporta en el cálculo de incertidumbre para el refractómetro en rango alto, el valor 2*SDL (0.00832 °B) es mucho menor al sesgo reportado (0.03 °B), cuando, en teoría, este último debería ser menor. Se atribuye este hecho a que la repetibilidad del método es muy similar al SDP y por lo tanto su diferencia es muy pequeña, sin embargo el sesgo queda definido y es reportado en conjunto con la incertidumbre para evitar futuras confusiones.

139

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5.4.

CONCLUSIONES

Los métodos de análisis fisicoquímico en POSTOBÓN S.A. en general poseen pequeñas diferencias respecto a los publicados por organizaciones de referencia nacionales e internacionales; las diferencias encontradas se documentaron y comunicaron con el fin de realizar los ajustes pertinentes, actualmente se lleva a cabo este proceso de forma interna en la compañía. La validación arrojó valores que en general cumplieron los criterios de aceptación señalados. El parámetro que menos se ajustó a lo requerido fue la linealidad; sin embargo es bien sabido que las respuestas, índice de refracción o densidad, y los valores dados como grados Brix se ajustan a una ecuación polinómica, que incluso es usada internamente en los equipos para realizar la conversión respectiva. La precisión en general para el Laboratorio Central fue satisfactoria, los valores encontrados se usarán como referencia para la aceptación o rechazo de lecturas dudosas. Se verificó, además, el rango de trabajo comprendido entre 7 y 12 °B para bebidas gaseosas y 7 a 60 °B para jarabes; se estableció el sesgo en cada nivel de concentración y la incertidumbre asociada en cada equipo. Otros parámetros como la especifidad confirmaron la identidad en la medición, en otras palabras, lo que realmente se está midiendo es azúcar y que las interferencias, aunque contribuyen en la lectura, no lo hacen de manera significativa. Se verificó en su totalidad la capacidad del Laboratorio Central para efectuar el análisis de Brix en bebidas gaseosas y jarabes. La prueba de robustez fue la que más tiempo de análisis requirió, de esta se extrajeron conclusiones que pueden ser de interés para quienes ejecuten el método. Se cuantificaron los efectos de los factores que contribuyen negativa o positivamente el análisis de grados Brix en bebidas gaseosas y jarabes, se estableció que: -

Las muestras no deben dejarse por ningún motivo más de 24 horas sin debido almacenamiento. No se requiere eliminación de burbujas por ultrasonido para jarabes. La cantidad de HCl 2.5 normal necesario para una inversión total está entre 1 gota (0.05 ml) y 4 gotas (0.2 ml), cantidades menores o mayores pueden afectar los resultados, aunque esto depende de la matriz analizada. En el rango evaluado de 20 a 30 ml el volumen a invertir no es significativo. La temperatura de inversión debe ser mayor a 90 °C.

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-

La agitación de las muestras antes de la lectura es relevante para el refractómetro mas no para el densímetro. El tiempo mínimo de retardo en la lectura para muestras entre 10 y 30 °C es de 50 segundos, cuando estas estén a temperatura ambiente el análisis puede realizarse a 3 segundos o menos.

En posteriores validaciones se tiene como referente el presente estudio. El marco teórico y las metodologías expuestas serán la base del protocolo a seguir, esto con miras a la acreditación del laboratorio según la NTC ISO/IEC 17025. En la tabla 80 se presenta una síntesis de los parámetros de validación calculados en el presente estudio. Tabla 80. Reporte de validación para método de determinación de grados Brix por densimetría y refractometría. Parámetro

Densimetría

Refractometría (rango bajo)

Refractometría (rango alto)

Criterio de aceptación

𝑆𝑝𝑒𝑐 (𝐴𝑖𝑛𝑣 )

0.9553 *

0.9352 *

N/A

> 0.9

𝑆𝑝𝑒𝑐 (𝐴𝑑𝑡𝑜 )

0.9367 *

0.9262 *

N/A

> 0.9

𝑟

0.99997

0.99996

0.99866

> 0.999

ANOVA

No cumple

No cumple

No cumple

Invertido

7 - 12 °B

7 - 12 °B

N/A

Directo

7 - 15 °B

7 - 13 °B

7 – 65 °B

Especifidad

Linealidad

Rango

Invertido

0.004145

Directo

0.004161

Sensibilidad

Repetibilidad Precisión intermedia Exactitud Incertidumbre

Desviación estándar Desviación estándar Sesgo (Patrón) U (95 %)

g/cm 3

0.001531

°B g/cm 3

0.001547

°B

IR °B IR °B

N/A 𝑦 = 1.472 ∗ 10−5 𝑥 + 1.3661 ∗ 10−3

0.0080 °B *

0.0070 °B *

0.0135 °B *

< 0.02 °B

0.00949 °B *

0.00802 °B *

0.0135 °B *

< 0.03 °B

0.007 °B *

0.013 °B *

0.030 °B *

< 0.03 °B

0.02038 °B

0.01942 °B

0.02825 °B

< 0.06 °B

* Corresponde a la concentración/solución con el valor del parámetro más cercano al criterio de aceptación (el peor de los casos).

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5.5.

RECOMENDACIONES Y TRABAJOS FUTUROS

Para estudios futuros en el método de análisis Brix, sea por adquisición de equipos nuevos, cambio de tecnologías u otras modificaciones al método, se recomienda tener en cuenta los parámetros de validación calculados como una referencia y ayudarse de los estudios de robustez para determinar las condiciones que pueden o no afectar significativamente el método. En POSTOBÓN S.A. se planea realizar la validación en varios métodos que tienen características similares; los diseños de experimentos y cálculos efectuados en el presente trabajo junto con el marco teórico sentarán las bases para estos estudios, sin embargo se debe tener en cuenta que no es necesario evaluar todas las características con el detalle que se hizo en el presente proyecto; esto dependerá del alcance que se le quiera dar al estudio.

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