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TEMA Nº 5 ENZIMAS. En general, todas las reacciones metabólicas están reguladas por las enzimas, unas proteínas globulares que actúan como catalizadores, aumentando la velocidad de aquellas reacciones que son energéticamente posibles. Las enzimas permiten las reacciones en las condiciones de temperatura, presión y pH propios del medio intracelular, reduciendo la energía de activación necesaria para que se produzca la reacción. Las enzimas no experimentan cambios estructurales al final del proceso químico que catalizan. A mediados del siglo XIX, el científico francés Louis Pasteur estudiando la fermentación alcohólica descubrió las enzimas que denominó inicialmente fermentos. Pasteur creía que la actividad enzimática era inseparable de las células vivas, pero en el año 1897 Eduard y Hans Buchner consiguieron extraer y separar, sin que perdieran sucapacidad catalítica, las mismas enzimas de las correspondientes células. capacidad catalítica, las mismas enzimas de las correspondientes células. A principios del siglo XX, E. Fisher observó la especificidad y en el año 1926 J. Summer obtuvo la primera enzima cristalizada y purificada, la ureasa. CONCEPTO Y ESTRUCTURA. Las/os enzimas son las proteínas más especializadas, como corresponde a su acción catalizadora de los procesos biológicos: degradación de nutrientes, transformaciones energéticas, síntesis de moléculas orgánicas, regulación de procesos metabólicos, etc.; incluso se mantienen activas fuera de la célula. La mayoría de las reacciones celulares no se pueden producir espontáneamente a la velocidad adecuada, pues requerirían una elevada temperatura que sería letal para la célula, por la que es decisiva la acción enzimática para conseguir dicha velocidad de reacción. Aunque hemos dicho que los enzimas son generalmente proteínas, existen otros enzimas de naturaleza ribonucleoprotéica, denominados ribozimas. Las enzimas actúan sobre sustancias determinadas, conocidas como sustratos , cuya transformación hacen posible. En muchos casos el sustrato es una sustancia muy compleja que debe transformarse en otra u otras más simples; la enzima se une al sustrato a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticos, hidrófobos, etc., en un lugar específico, el centro activo o centro catalítico. Este centro es una pequeña porción del enzima constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan específicamente con el sustrato debilitando los enlaces que mantienen unidos a los átomos que lo forman y haciendo más sencilla su transformación. Normalmente el centro activo del enzima es como una hendidura, que puede modificarse al unirse con el sustrato.

De los aminoácidos que constituyen las enzimas unos desempeñan una función estructura l, otros facilitan la unión enzimasustrato, llamados de fijación y otros, los catalíticos, hacen posible la transformación del sustrato.

Las enzimas pueden realizar su función con los radicales de sus aminoácidos, otras necesitan además un componente no proteico llamado cofactor ; el conjunto enzima-cofactor se conoce como holoenzima. El cofactor es con frecuencia un ión metálico (Fe2+, Mg2+, etc.), en otros casos es un compuesto orgánico conocido como coenzima . Si el cofactor (ión metálico o coenzima) está unido mediante enlace covalente a la parte proteica (apoenzima) se le conoce como grupo prostético. Son varias las vitaminas que actúan como coenzimas, como se verá más adelante. Las enzimas presentan algunas propiedades típicas: - Son solubles en agua y difusibles en los líquidos orgánicos. - Se requieren en dosis mínimas, ya que, como catalizadores que son, no sufren cambio en la reacción. - Tienen gran actividad, pudiendo transformar un sustrato de masa molecular mucho mayor que ellas. - Hacen que las transformaciones se produzcan a gran velocidad. - Disminuyen la energía de activación y permiten que la reacción se realice a menor temperatura. - Son sustancias muy específicas, no actúan sobre cualquier sustrato. - Se alteran por acción del calor, cambios de pH, radiaciones, etc., como todas las proteínas.

ESPECIFICIDAD. De entre las propiedades de las enzimas merece un comentario la especificidad. La especificidad enzimática se refiere a la capacidad de cada enzima para diferenciar sustancias que tienen características semejantes (especificidad de sustrato) o para realizar una transformación concreta (especificidad de acción). La especificidad de sustrato es absolutacuando un enzima sólo puede catalizar la transformación de una sustancia (en algunos casos sólo puede unirse a uno de los isómeros D o L de una misma sustancia, pero no a los dos); se habla de especificidad de grupo cuando una misma enzima puede catalizar la transformación de un grupo de sustancias que tienen un tipo de enlace determinado (por ejemplo, la α-glucosidasa tiene acceso a glúcidos con enlace α), o que son portadoras de determinado grupo (las fosfatasas separan los grupos fosfatos de cualquier tipo de molécula). CÓMO ACTÚAN LAS ENZIMAS EN LAS REACCIONES QUÍMICAS Las enzimas actúan acelerando la velocidad de una reacción o bien haciendo posible una determinada reacción. Para realizar su acción la enzima se une al substrato, por absorción, encajando la superficie de una en la otra de una forma tal, que se podía comparar con una llave de una cerradura. Esta combinación origina un complejo reversible enzima - substrato intermedio, que luego se descompone para liberar los productos de una

reacción y la enzima que es capaz de unirse a otra molécula del mismo substrato para así comenzar de nuevo la acción EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular. Los amortiguadores fisiológicos.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un

tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima. Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la figura inferior podemos observar una molécula de hemoglobina (proteína que transporta oxígeno) y su coenzima (el grupo hemo). Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: poenzima + grupo prostético= holoenzima

CINÉTICA ENZIMÁTICA. Si se representa gráficamente la velocidad con que aparece el producto (moles del producto que se forman por unidad de tiempo) de una determinada reacción enzimática, en función de la concentración de sustrato inicial, para una cantidad constante de enzima, se obtiene una gráfica del siguiente tipo: Velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato. La velocidad de la reacción catalizada depende inicialmente de la concentración de sustrato Como se puede observar, al aumentar la concentración de sustrato, aumenta también la velocidad de la reacción. Esto resulta lógico, ya que mientras existe enzima libre, a mayor número de moléculas de sustrato, más moléculas de producto aparecerán. Pero llega un momento en que, a pesar de que la concentración de sustrato sigue aumentando, la velocidad no varía. Se alcanza una velocidad máxima que no es posible superar. Esta situación corresponde a la inexistencia de moléculas de enzima libres, pues todas están ocupadas por moléculas de sustrato formando complejos ES. A medida que se forman las moléculas de producto, las enzimas van liberándose y pueden aceptar nuevas moléculas de sustrato que están «a la espera». En la reacción enzimática, la etapa limitante, es decir, la más lenta, corresponde a la unión del sustrato al centro activo para formar el complejo ES, pues, como se ha visto, es un proceso reversible. Existe, por tanto, una constante de equilibrio (Ke)para esta etapa. [E] [S] Ke = --------------------[ES]

Para calcular dicha constante, es preciso conocer la concentración de enzima libre y la concentración de enzima que forma el complejo ES, valores que no se pueden establecer directamente. Sin embargo, cuando la velocidad de la reacción es la mitad de la máxima, el número de moléculas de enzima libres es igual al de enzimas ocupadas, es decir: [E] = [ES] La expresión de la constante de equilibrio en esta situación se simplifica y queda: Ke = [S] La constante así obtenida se denomina de Michaelis-Menten o KM y se define como la concentración de sustrato para la cual la reacción alcanza la velocidad semimáxima. La KM es característica de cada enzima y cuanto menor sea su valor, mayor afinidad tendrá la enzima por el sustrato, ya que se alcanza antes la velocidad semimáxima. La KM se puede calcular fácilmente. Basta con ver en la gráfica de la velocidad respecto a la concentración de sustrato cuál es el valor de éste para el que se alcanza la velocidad semimáxima. Del grado de afinidad, relacionado con la KM, depende la velocidad de la enzima. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten dedujeron una ecuación que también lleva su nombre, que permite calcular la velocidad de una reacción enzimática para cualquier concentración de sustrato, utilizando el valor de KM y de la velocidad máxima. [S] v = vmax × -------------------KM + [S]

Si tomamos los valores inversos en los dos miembros de la ecuación:

Obtenemos otra ecuación que, representada gráficamente, corresponde a una línea recta con una pendiente de KM / Vmáx y una ordenada en el origen igual a 1 / Vmáx. Esta representación gráfica (denominada de Lineweaver-Burk) resulta muy útil para el estudio cinético de las enzimas.

Representación de Lineweaver-Burk

En las células, la mayoría de las enzimas no están habitualmente saturadas de sustrato; por eso, pese a ser muy eficaces, la velocidad de las reacciones que catalizan está alejada de la velocidad máxima. En estas condiciones, la velocidad de la reacción viene condicionada, sobre todo, por la velocidad a la que las enzimas encuentren sus sustratos en la disolución, controlada por la difusión. Por ello, para acelerar más las reacciones es frecuente que las enzimas se asocien formandocomplejos multienzienzi máticos o que se sitúen dentro de la célula en compartimentos más pequeños, muchas veces asociados a las membranas celulares. Así, por difusión, el producto de reacción de una enzima tiene más probabilidades de encontrar la siguiente enzima.

APLICACIONES INDUSTRIALES

Las enzimas son utilizadas en la industria química, y en otros tipos de industria, en donde se requiere el uso de catalizadores muy especializados. Sin embargo, las enzimas estan limitadas tanto por el numero de reacciones que pueden llevar a cabo como por su ausencia de estabilidad en solventes orgánicos y altas temperaturas. Diversas aplicaciones industriales de las enzimas: LA AMILASA DE HONGOS Y PLANTAS cataliza la degradación del almidon en azucares sencillos USO produccion de azucares desde el almidon, como por ejm en la produccion de jaraba de maiz. En la coccion al horno , cataliza la rotura del almidon de la harina en azucar. La fermentación del azúcar llevada a cabo por levaduras produce el dioxido de carbono que hace subir la masa PROTEASAS: Los fabricantes de galletas las utilizan para reducir la cantidad de proteínas en la harina TRIPSINA: Para pre-digerir el alimento digerido a bebés CELULASAS, PECTINASAS: Aclarador de zumos de frutos RENINA, derivado del estomago de animales rumiantes jóvenes(terneros y ovejas): Producción de queso, usada para hidrolizar proteínas. ENZIMAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS: Actualmente, cada vez mas usadas en la industria láctea. LIPASAS: Se introduce durante el proceso de produccion del queso roquefort para favorecer la maduración LACTASAS: Rotura de la lactosa en glucosa y galactosa PAPAINA: Ablandamiento de la carne utilizada para cocinar AMILASAS, AMILOGLUCOSIDASAS Y GLUCOAMILASAS: Conversion del almidon en glucosa y diversos azucares invertidos GLUCOSAS ISOMERASA:Conversión de glucosa en fructosa durante la producción de jarabe de maíz partiendo de sustancias ricas en almidón. Estos jarabes potencian las propiedades edulcorantes y reducen las calorías mejor que la sacarosa y manteniendo el mismo nivel de dulzor.

CELULASAS: Utilizadas para degradar la celulosas en azucares que pueden ser fermentados LIGNINASAS: Utilizada para eliminar residuos de lignina

PROCESOS DE INTERÉS EN ALIMENTOS CON ENZIMAS O CÉLULAS INMOVILIZADAS Una enzima es una proteína que actúa disuelta en un medio acuoso, por lo que su recuperación para un segundo uso es prácticamente imposible, a menos que se sujete a un soporte sólido que pueda recuperarse y emplearse repetidas veces o incluso empacarse en una columna por la que se haga pasar la corriente líquida con el sustrato. Esto es particularmente importante para aquellas enzimas de alto costo. En algunos casos no es deseable que la enzima activa quede en el producto, por lo que se hace necesario un proceso de inactivación, que podría actuar en detrimento de la calidad del mismo. Por lo anteriormente expuesto, desde la década de 1960 se ha desarrollado un sin número de formas en las que una enzima puede unirse a un soporte sólido de manera que se facilite su recuperación del medio de reacción o su uso continuo. Además, estas formas proporcionan generalmente mayor estabilidad a la enzima al restringir el movimiento de la molécula. Se han desarrollado biocatalizadores con enzimas puras o parcialmente puras e incluso con células inmovilizadas conteniendo una actividad enzimática. La aplicación de sistemas inmovilizados directamente en alimentos es limitada, principalmente debido a que los sistemas alimentarios son físicamente complejos, lo que dificulta el contacto de la enzima con el sustrato. Sin embargo, estos sistemas son de gran valor para transformar sustratos en solución o como herramientas analíticas, como se verá más adelante. Las enzimas se pueden inmovilizar por diferentes métodos, dentro de los que se encuentran los siguientes: • Captura en una matriz de gel de poliacrilamida, agar, alginato, gelatina o Sephadex®. • Unión covalente a un soporte, como metales, vidrio, cerámica, nylon, celulosa, Sepharosa® o Sephadex®. • Unión a membranas semipermeables. • Adsorción en un sólido por interacciones hidrofóbicas o electrostáticas. • Adsorción seguida de entrecruzamiento covalente a la matriz. • Entrecruzamiento molecular para formar una matriz granular insoluble.

¨ Algunas de las consideraciones para la elección del método de producción del biocatalizador son el rendimiento de inmovilización, la carga máxima de enzima que puede ser inmovilizada, la estabilidad operacional del biocatalizador, la estabilidad del soporte ante las condiciones de operación del reactor (temperatura, presión, esfuerzos de corte, presencia de otras enzimas, etcétera), difusión del sustrato hacia la enzima y de los productos hacia fuera del catalizador, necesidad de cofactores, susceptibilidad a contaminación microbiana y costo. También se debe evaluar si conviene inmovilizar a la enzima pura a una preparación enzimática con menor pureza; incluso a las células completas, siempre y cuando no interfiera alguna actividad residual, y el sustrato y producto difundan libremente a través de la membrana. En algunos casos, para evitar una barrera difusional se suele dar un tratamiento de permeabilización celular previo a la inmovilización. Es importante no confundir un proceso enzimáticocon células completas, con una fermentación o bioconversión con células inmovilizadas.

ANÁLISIS QUÍMICO CON ENZIMAS La alta especificidad de las enzimas ha permitido convertirlas en una herramienta analítica muy útil para la detección y cuantificación de sustancias de naturaleza muy variada. De hecho, las enzimas junto con los anticuerpos son los “reactivos” más específicos que se conocen, por lo que su aplicación para la determinación de un compuesto específico en matrices de composición compleja, como los

alimentos, es de gran utilidad. Adicional a la alta especificidad, se requiere de una preparación enzimática de alta pureza y estabilidad, que no sea inhibida por sustancias que pudieran estar presentes en la muestra, y que funcione a la temperatura y pH de las condiciones de experimentación. Para realizar la detección, el analito generalmente es el sustrato de la reacción enzimática que al ser transformado por la enzima, genera un producto que puede ser detectado por algún método simple, como un electrodo de H2O2 o un espectrofotometro de absorbancia. El mismo principio aplica si el analito no es directamente determinado y en su lugar se cuantifica un cofactor; éste es el caso de las reacciones donde participan enzimas de óxido reducción, donde se mide la absorbancia generada por las coenzimas NADH o NADPH a 340 nm.

LAS ENZIMAS COMO INDICADORES DE CALIDAD DE ALIMENTOS El control de calidad de ciertos alimentos se puede llevar a cabo rutinariamente de manera indirecta a través del análisis de la actividad de ciertas enzimas; la presencia o la ausencia de algunas enzimas en particular se relaciona con una determinada condición microbiológica o química de un producto. Por ejemplo, la pasteurización y el escaldado son procesos térmicos que se han diseñado para la eliminación de ciertas enzimas o microorganismos. En este sentido, se ha encontrado que la inactivación de la peroxidasa (EC 1.11.1.7) puede indicar el grado de escaldado en vegetales, que como ya se ha explicado anteriormente, se utiliza para inactivar enzimas que causan el oscurecimiento de tejidos vegetales. Si la peroxidasa se inactiva totalmente, eso indicaría un tratamiento excesivo que repercutiría en detrimento de la textura del vegetal. El tratamiento correcto sería tal que se conservara del 5 al 10% de la actividad presente originalmente. La actividad de esta enzima también se ha utilizado para determinar el tratamiento óptimo para desnaturalizar enzimas lipolíticas que pueden causar rancidez en avena.29 Otro ejemplo importante es la determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina endógena de la leche (EC 3.1.3.1), como indicador de la eficiencia del proceso de pasteurización. La prueba es muy sencilla, ya que su presencia se mide colorimétricamente utilizando fenilfosfato como sustrato y midiendo la absorbancia del fenol que se libera.

TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE APLICADA A LA PRODUCCIÓN Y MODIFICACIÓN DE ENZIMAS DE INTERÉS EN ALIMENTOS El extraordinario desarrollo de las técnicas de manipulación de ADN ha tenido un efecto muy importante en la producción de enzimas utilizando microorganismos, ya que se han podido sobre expresar en organismos diferentes lográndose una mayor productividad o se han modificado sus características operacionales de acuerdo a las necesidades industriales. El principio de la tecnología de ADN recombinante, o ingeniería genética, es la clonación, que consiste en obtener el gen que codifica para la proteína de interés para después insertarlo en un vector que, generalmente, tiene una alta frecuencia de replicación. Posteriormente, varias moléculas del vector, con el gen clonado,

se introducen en un organismo hospedero donde se va a producir la enzima de interés, proceso conocido como: transformación (figura 5.23). El gen, una vez clonado, puede ser sujeto a modificaciones en su secuencia, con el fin, por ejemplo, de aumentar la termoestabilidad mejorar la eficiencia catalítica o modificar la especificidad enzimática, actividad que se conoce como “ingeniería de proteínas”. Los avances, utilizando esta tecnología, han hecho posible clonar y manipular cualquier gen, así como sobre producir la proteína de interés en un hospedero de naturaleza bacteriana o fungal, preferentemente. Escherichia coli y Bacillus subtilis se utilizan como hospederos cuando se busca una alta expresión de enzimas no glicosiladas. En particular se elige al bacilo cuando se quiere que la enzima se produzca extracelularmente. Levaduras como Saccharomyces, Kluyveromyces o Pichia pastoris y hongos como Aspergillus niger, son los hospederos de elección cuando se trata de expresar una proteína extracelular que requiere ser glicosilada. Los procedimientos para la transferencia de genes entre especies, que pueden estar muy alejadas filogenéticamente, tuvieron algunos problemas en el inicio, sobre todo cuando se intentó clonar genes de organismos eucariotes en procariotes debido a la presencia de intrones, fragmentos del gen que no codifican para la proteína, y que los últimos no son capaces de procesar. El problema se resolvió partiendo del ARN mensajero maduro, que ya ha eliminado autocatalíticamente los intrones, para la síntesis del ADN complementario (cADN) utilizando la enzima transcriptasa reversa. Una vez teniendo el ADN se siguió la misma metodología para clonar en un vector de expresión y poder transformar a la célula hospedera. Éste fue el procedimiento utilizado para clonar la quimosina, de origen bovino, en hospederos como E. col