Determinación De Proteínas En Vegetales.docx

1. Objetivo Determinar la cantidad total de proteínas que puede contiene una muestra vegetal usando el método de modificado de Lowry de Thermo Scientific Pierce.

2. Procedimiento experimental Se pesarán 0,150 mg de muestra y se triturará en un mortero de porcelana. La añadiremos en un tubo de ensayo junto a 5 mL de NaOH 1M. Se agita y se filtra. Se introducen 16 mL de patrón BSA con concentración 0,5 mg/mL a partir de una disolución madre, la cual se usará para preparar patrones de concentraciones de concentración 0, 0,1, 0,2, 0,3 y 0,4 mg/mL diluyendo con NaOH. Con ayuda de una pipeta, se cogerán 0,2 mL de muestra y 0,2 mL de cada patrón y del blanco en viales. Se adiciona 1 mL de reactivo de Lowry a cada muestra esperando 30 segundos entre una muestra y la siguiente y se deja reposar 10 minutos. Seguidamente, se añade a cada muestra 0,1 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se deja reposar de nuevo durante 30 minutos. Finalmente, se leerán las absorbancias a 750 nm.

3. Resultados Primeramente, se anotarán los volúmenes de BSA y NaOH junto a su absorbancia para cada muestra en la siguiente tabla: Tabla 1. Datos de volúmenes para preparación de patrones y datos de absorbancia. Muestra VolumenNaOH 1M (mL) Volumendisolución (mL) patrón Blanco 5 0 1 4 1 2 3 2 3 2 3 4 1 4 5 0 5

[BSA] (mg/mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

[Proteina] (mg/mL) Absorbancia 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0 0,0480 0,131 0,232 0,349 0,428

Conociendo los datos de absorbancia, se realizará una recta de calibrado de absorbancia frente a concentración (mg/mL) para calcular las concentraciones de proteína.

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Absorbancia frente a [Proteína] (mg/mL) 0.5 y = 0.8983x - 0.0266

Absorbancia

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

0.1

-0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

[Proteina] (mg/mL)

Gráfica 1. Recta de calibrado; absorbancia frente a concentración de proteína (mg/mL). Tabla 2. Valores de pendiente y ordenada de la recta de calibrado. Pendiente Ordenada

0,8983 -0,0266

Gracias a estos datos de pendiente y ordenada de la recta de calibrado, se podrá calcular la concentración de proteínas de la muestra mediante la siguiente expresión: [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] (𝑚𝑔) = 𝑚𝐿

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 − 𝑂𝑟𝑑𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

siendo los valores de absorbancia los mostrados en la siguiente tabla: Tabla 3. Datos de absorbancia y concentración de proteína (mg/mL) junto a sus medias para cada muestra. Absorbancia Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Media

0,368 0,361 0,378 0,369

[Proteina] (mg/mL) 0,439 0,431 0,450 0,440

Sabiendo el valor de la concentración de proteína y que cada muestra es de 5 mL, podremos calcular la cantidad de masa de la proteína en cada ensayo. Para ello, multiplicamos por 5 mL cada concentración para, finalmente, obtener los siguientes datos recogidos en la Tabla 4: Tabla 4. Datos de masa de proteína en cada muestra (mg) y su valor medio.

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Absorbancia Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Media

0,368 0,361 0,378 0,369

[Proteina] (mg/mL) 0,439 0,431 0,450 0,440

Masa proteína (mg) 2,20 2,16 2,25 2,20

Como se puede observar, la concentración media es de 0,440 mg/mL, por lo que calculando la masa media de proteína de ella, se obtendrá un valor de 2,20 mg de proteína. Cabe destacar que los datos de masa champiñón en cada muestra han sido los siguientes: Tabla 5. Masa de champiñón (mg) por muestra. Masa champiñón (mg) 0,156 0,151 0,161

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 2

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