Laboratorio Bioquímica Médica.docx

Práctica morfología celular Daniela Campo, Julián Esteban Cuéllar, María del Mar Zarta Sanclemente Departamento de automática y electrónica, Universidad Autónoma de Occidente Cali, Colombia [email protected] [email protected] [email protected]

Abstract— A practice of microscopy was carried out in order to know an optical microscope, its components and respective functions, as well as its proper mode of use. To achieve this objective different samples were used, identifying structures such as cells, cell walls and nuclei, red blood cells, white blood cells, platelets, among others, so it was necessary to change the objective of the microscope to obtain a closer image of the studied object. In addition to the above, an analysis was performed to determine what happens with the image when the platen is moved, what are the parameters of a normal blood count and what is the importance of the reagents applied to the samples.

I. INTRODUCCIÓN El origen del microscopio se dio en la antigüedad cuando las personas solían usar espejos curvos o esferas de cristal con agua, las cuales permitían ver las cosas pequeñas con mayor aumento y detalle. El microscopio óptico fue el que inauguró la era de la microscopía en el siglo XVII, es el tipo más básico de microscopio y su funcionamiento está basado en un juego de lentes y el uso de luz visible para aumentar la imagen de una muestra, dicho microscopio está compuesto de dos partes esenciales: el sistema óptico y el sistema mecánico. [1] La microscopía está definida como un conjunto de métodos utilizados para observar objetos que el ojo humano no alcanza a visualizar, dichos métodos usan instrumentos tales como la lupa, microscopio de luz y microscopio electrónico para hacer efectiva su función. Realizando énfasis en el microscopio de luz, el sistema óptico de este contiene todos aquellos elementos de manipulación de la luz para obtener la imagen aumentada; en dicho sistema se encuentra un foco, también conocido como fuente de luz, emitiendo rayos dirigidos a la muestra, los cuales son previamente concentrados hacia ella al pasar a través de un condensador; además, este condensador va acompañado de un diafragma, el cual regula la luz a emitir. Para incrementar el tamaño de la imagen a observar se hace uso de un conjunto de lentes con diferentes aumentos conocidos como objetivos, para finalmente por medio del ocular observar la imagen de la muestra ampliada por el objetivo. El sistema mecánico suministra un soporte estructural a los elementos del sistema óptico, este cuenta con una base que permite la estabilidad del microscopio y un brazo, que es la estructura más importante del dispositivo debido a que conecta la base con el sistema óptico, adicionalmente se encuentra la platina, una pieza horizontal donde se deposita la lámina con la muestra; para regular la posición de la platina se hace uso de dos componentes conocidos como tornillo macrométrico y micrométrico. Por último en la parte superior del brazo se tiene

el revólver, donde se encuentran montados los objetivos, teniendo en cuenta que este es el elemento que se debe girar para seleccionar el objetivo deseado, unido a este se encuentra un tubo que conecta los objetivos con el ocular. [1] Este laboratorio se lleva a cabo con el fin de aplicar los conceptos teóricos aprendidos previamente sobre microscopía, logrando comprender el principio de funcionamiento de un microscopio de luz junto con el reconocimiento de sus componentes, para así identificar de diversas estructuras en las muestras observadas a través de imágenes de buena calidad y resolución. II.

OBJETIVOS

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Entender el principio de la microscopía de luz, conocer las partes del microscopio y sus respectivas funciones.

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Utilizar correctamente el microscopio de luz para la observación de estructuras con el detalle que permite su correcto uso. III. MATERIALES Y MÉTODOS

Durante la práctica de laboratorio se hizo uso de los siguientes materiales: ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

Aceite de inmersión. Colorante de Wright. Lugol. Láminas portaobjetos. Láminas cubreobjetos. Láminas de colección. Microscopio de luz. Recorte de una letra de revista. Recipiente para descartar las láminas. Mucosa bucal. Una cebolla pequeña.

La metodología aplicada se resume en el siguiente diagrama de flujo:

Diagrama 1. Metodología aplicada durante la práctica de laboratorio

IV. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS La primera muestra a analizar fue con recorte de una letra dee revista, esto con el fin de afianzar los conocimientos previamente adquiridos y familiarizarse un poco más con el microscopio, pues la calidad de la imagen obtenida depende mucho del uso correcto del mismo. En la figura 1 se puede observar la imagen obtenida de la letra de una revista.

Fig 3 Epidermis de cebolla en microscopía de luz. Tomada por el equipo de trabajo.

Fig 1. Recorte de una letra por microscopía de luz. Tomada de referencia [2].

Como se puede observar la imagen obtenida está al revés, esto no significa que se haya manipulado mal el microscopio; pues el objetivo muestra una imagen real, aumentada e invertida [3], además cuando se mueve la lámina hacia adelante la imagen se moverá hacia atrás, todo lo anterior se debe principalmente a que los lentes de los objetivos son convexos, por lo que hacen converger los rayos luminosos que lo atraviesan, proyectando una imagen invertida y afectando la percepción del movimiento de la muestra; por otro lado dichos objetivos tienen un punto focal muy pequeño, una vez la luz atraviesa la muestra, los lentes y el punto focal del objetivo, su trayectoria se verá afectada, posteriormente la imagen es observada por un segundo lente llamado ocular, el cual actúa únicamente como lupa [4]. En la figura 2 se muestra la transformación por la que atraviesa la imagen antes de llegar al ojo.

En la mayor parte de la imagen se visualiza una tonalidad amarillenta, lo que corresponde al citoplasma; por otra parte la imagen obtenida se asemeja a una secuencia de ladrillos, pues las diversas células, además de ser alargadas se encuentran delimitadas por su respectiva pared celular, característica de las células vegetales, esta puede ser diferenciada gracias a que adquiere una tonalidad mucho más oscura, adicionalmente se visualizan círculos color ocre, correspondientes a los núcleos de las células. En la figura 4 se puede apreciar esta muestra un poco más de cerca, enfocando uno de los núcleos observados.

Fig 4. Núcleo de una célula de epidermis de cebolla. Tomada por el equipo de trabajo.

Al tener un acercamiento mayor de la muestra es posible identificar lo que sería el ADN de la célula enrollado y empaquetado al interior del núcleo.

Fig 2. Transformación de los rayos de luz al atravesar la muestra y los diferentes lentes del microscopio. Tomada de referencia [4].

Como segunda muestra se tomó una porción pequeña de epidermis proveniente del bulbo de una cebolla, al cual se le adicionó una gota de Lugol y se cubrió con una laminilla para finalmente colocarla en la platina, la figura 3 muestra el resultado obtenido.

Como tercera muestra se hizo uso de un raspado de mucosa bucal, la cual se obtuvo tras frotar un hisopo sobre la parte interna de la mejilla en la cavidad bucal, para posteriormente realizar un extendido sobre la lámina, adicionalmente se agregó una gota de colorante de Wright a la muestra, obteniendo los siguientes resultados:

Para la última parte del laboratorio la muestra de sangre fue presentada por la docente durante la clase, donde se utilizó el objetivo de 100x para visualizar una imagen más clara y detallada, por lo que fue necesario aplicar aceite de inmersión sobre la muestra, la función principal de este es incrementar la resolución de la imagen gracias a su alto índice de refracción, reduciendo la dispersión de la luz, además evita el rozamiento del lente del objetivo con la muestra. Posterior a esto se recorrió la lámina para ubicar los diferentes tipos de glóbulos blancos, se puede observar que la cantidad de glóbulos blancos a comparación de los rojos es muy pequeña, si en algún momento se llegase a tener la misma proporción de leucocitos y eritrocitos puede indicar un caso de leucemia. En las siguientes imágenes se visualizan los resultados obtenidos, logrando identificar 3 tipos de glóbulos blancos:

Fig 5. Muestra de mucosa bucal. Tomada por el equipo de trabajo.

Es importante resaltar la función del colorante de Wright en este punto de la práctica; en primer lugar, Se le llama tinción o coloración a la técnica utilizada en microscopía cuya función es mejorar el contraste de la imagen vista al microscopio, pues todas las células son incoloras excepto de los glóbulos rojos, por lo tanto el colorante permite resaltar las estructuras en los diferentes tejidos. Es necesario aclarar que se debe usar un colorante específico dependiendo de lo que se desee observar o la muestra que se esté analizando, en esta práctica se usó Lugol y colorante de Wright. -

Colorante de Wright: Se encuentra formado por Azul de Metileno y sus derivados oxidados, el colorante ácido Eosina y colorantes básicos, estos últimos unen a los componentes ácidos de las células, ácidos nucleicos, gránulos en neutrófilos y proteínas ácidas, las cuales se tiñen de un color rojo púrpura, mientras que la eosina se une a la hemoglobina, componentes básicos de las estructuras celulares y los gránulos de los eosinófilos. El balance entre el azul de metileno, sus derivados oxidados y la Eosina, proporciona una tonalidad azul y diversas intensidades en la coloración. [5]

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Lugol: Se utiliza esta disolución como indicador en la prueba del yodo, que sirve para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por presentar distintos colores según las ramificaciones que presente la molécula. El Lugol no reacciona con azúcares simples como la glucosa o la fructosa. [6]

Fig 6. Muestra de sangre donde se visualiza un monocito .

Fig 7. Muestra de sangre donde se visualizan linfocitos.

Teniendo en cuenta lo anterior, gracias al colorante de Wright es posible apreciar que en la figura 5 lo que se encuentra teñido de un color azul claro son células, las cuales poseen una forma irregular, además este colorante permite visualizar el núcleo de las diversas celular gracias a que adquieren una coloración mucho más oscura. Fig 8. Muestra de sangre donde se observa un neutrófilo.

Si se realiza una comparación de los resultados obtenidos de la segunda y tercera muestra, es posible notar que las células eucariotas animales tienen un menor tamaño que las células vegetales, además de encontrarse más dispersas gracias a la presencia de la matriz extracelular.

En las figuras anteriores es posible identificar que en su mayoría las células observadas corresponden a glóbulos rojos, células sin núcleo con una tonalidad púrpura, algunos parecen ser huecos debido a su biconcavidad, gracias a esto su membrana es mucho

más delgada en el centro de la célula, permitiéndole llevar a cabo con éxito su función de transportar oxígeno. Por otro lado se visualizan pequeños puntos con igual tonalidad, estas son las plaquetas, es decir, restos de células de gran tamaño (megacariocitos) que han sido destruidas al pasar por el torrente sanguíneo y cuya función principal es ayudar a la coagulación. Adicionalmente, en cada figura se puede observar un tipo de glóbulo blanco; en el caso de la figura 6 resalta en el lado izquierdo un elemento de gran tamaño con núcleo arriñonado y gran cantidad de citoplasma, el cual se torna gris, esta descripción corresponde a un agranulocito de tipo monocito, el cual se encarga de fagocitar; en la figura 7 se identifican 2 linfocitos, caracterizados por ser mononucleares, con poco citoplasma y tener la capacidad de crear anticuerpos para atacar un virus específicos; por último, la figura 8 corresponde a un glóbulo blanco polimorfonuclear de tipo neutrófilo, siendo lo gris el citoplasma y los círculos morados el núcleo, que pueden tener diferentes formas, estos son especializados en matar bacterias mediante la expulsión de secreciones al romper sus gránulos.

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Hematocrito (Hto): Hace referencia al volumen de glóbulos rojos en sangre sobre el volumen sanguíneo total, es expresado como un porcentaje, por lo tanto en hombres es normal encontrar un porcentaje entre el 41 a 53%, en mujeres de 35 a 45% y en niños de 30 a 40%. La causa principal que se presenten niveles bajos de hematocritos es la anemia, aunque también existen otros factores tales como: embarazos, hemorragias, leucemia, problemas en la médula ósea, hipertiroidismo, entre otras. Si por el contrario se presentan niveles altos puede estar dado por: problemas de hidratación, enfermedades pulmonares crónicas o problemas cardiacos.

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Volumen corpuscular medio (VCM): Con este se determina el tamaño medio de los glóbulos rojos, es muy útil ya que ayuda a clasificar el tipo de anemia en macrocítica o microcítica dependiendo de si los glóbulos rojos son más grandes o pequeños de lo normal. Lo que se considera normal está entre 88 a 100 fl (femtolitros por glóbulos rojos), los valores por debajo de lo normal puede indicar una pérdida exagerada de sangre, déficit de hierro, una talasemia, o alguna anomalía congénita de la hemoglobina; valores por encima están directamente relacionados con el déficit de la vitamina B12 y ácido fólico, entre las causas se encuentran trastornos con el hígado, o la ingesta de alcohol.

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Hemoglobina corpuscular media (HCM): Este índice indica la cantidad de hemoglobina que contiene cada glóbulo rojo, el valor estándar está entre 32 a 36 g/dl, los niveles bajos indican que podría existir una anemia por falta de hemoglobina, al ser una proteína formada por hierro se presentaría un déficit de este, pero si los niveles están más altos del valor estándar podría estar indicando un déficit de la vitamina B12 o ácido fólico, aunque es muy raro encontrar casos de anemias hipercrómicas.

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Leucocitos: Conocidos también como glóbulos blancos, su función principal es la defensa frente a agresiones externas. Existen varios tipos de leucocitos:

En un análisis de sangre, también conocido hemograma o conteo sanguíneo completo (CSC), es posible evidenciar todos los componentes de la sangre, la cantidad y proporción en el organismo y si hay alguna alteración; los componentes analizados en dicha prueba son: -

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Hematíes o glóbulos rojos: Son una de las células más importantes en el organismo, su función es transportar oxígeno a través del organismo. Los niveles considerados normales es de 4,5 a 6 millones por microlitro (µl) en hombres, 4,0 a 5,5 millones por microlitro (µl) en mujeres y 3,9 a 5,0 millones por microlitro en niños. Si se presentan niveles bajos de glóbulos rojos se debe a la presencia de hemorragias, por lo que el oxígeno necesario a las demás células no llega a las demás células, lo que en últimas produce a anemia;, por otro lado? si los niveles de hematíes es alto se le conoce como poliglobulia, por lo general se incrementa la producción de glóbulos rojos cuando hay una disminución de oxígeno en la sangre, un ejemplo son las personas que fuman cigarrillo, el tabaco disminuye el oxígeno en la sangre por lo cual producirán más glóbulos rojos, es importante aclarar que si los niveles de glóbulos rojos está elevado no está relacionado directamente a una enfermedad. Hemoglobina (Hb): La hemoglobina se encuentra en el interior de los glóbulos rojos, es una proteína formada de hierro responsable de que la coloración de la sangre sea roja, se encarga que el oxígeno y los nutrientes lleguen a todos los tejidos del cuerpo humano y en adición transporta el dióxido de carbono a los pulmones para que sea expulsado; es normal encontrar entre 200 a 300 moléculas de hemoglobina en un glóbulo rojo. Los niveles normales de hemoglobina es de 13,5 a 17,5 g/dl en hombres, 12 a 16 g/dl en mujeres y 10,3 a 15 g/dl en niños. Si se presentan niveles bajos de esta proteína, quiere decir que hay una deficiencia en el funcionamiento de los glóbulos rojos, también conocido como anemia, pero si se presentan niveles altos la persona puede presentar poliglobulia, problemas pulmonares, cardiopatías o simplemente vive en una zona de mucha altitud.

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linfocitos: Se caracterizan por la carencia de gránulos, los linfocitos son los encargados de combatir agentes extraños específicos que hay en el organismo, además poseen memoria inmunológica. Los niveles normales en el cuerpo humano están entre el 15 al 45%. Cuando hay una elevación en los linfocitos se conoce como linfocitosis, aparece cuando hay infecciones agudas, crónicas, alergias farmacológicas o en la leucemia, por el contrario, si hay niveles bajos de este tipo de glóbulos blancos se le conoce como linfopenia, se presenta en personas que han pasado por quimioterapia o existe alguna falla en su sistema inmune.

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Neutrófilos: Tiene gránulos y su función principal es destruir bacterias, sólidos y restos celulares, rompiendo sus gránulos y

expulsando secreciones al exterior. El nivel estándar está entre el 45 al 75%, cuando hay una elevación se conoce como neutrofilia y está relacionado con las infecciones, quemaduras, hemorragias agudas, procesos inflamatorios, consumo de tabaco entre otros; la neutropenia se da cuando los niveles son bajos, haciendo que la persona sea muy vulnerable a tener cualquier tipo de infección fácilmente.

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Eosinófilos: Presenta gran número de gránulos en su interior, no está presente en el cuerpo en grandes cantidades, pues los niveles normales están entre el 0 y 3%, es muy raro encontrar niveles por debajo del estándar pero cuando están por encima podría indicar la presencia de una infección, asma, alergias o parásitos, se puede asociar a enfermedades intestinales y pulmonares.

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Plaquetas: Son esenciales para la coagulación sanguínea, aunque sean los elementos más pequeños de la sangre, lo que hacen es cerrar los vasos sanguíneos permitiendo que la sangre se coagule para tapar las lesiones cuando se produce alguna herida, los niveles normales están entre los 150,000 y los 400,000 por microlitro (µl), una trombocitopenia ocurre cuando las plaquetas están por debajo del valor normal, y esto puede deberse a un mal funcionamiento de la médula ósea, impidiendo una buena coagulación y provocando hemorragias en diferentes partes del cuerpo como la nariz, encías, hematomas en la piel entre otros. La púrpura trombocitopénica idiopática se caracteriza por la formación de anticuerpos que destruyen las plaquetas al no reconocerlas como propias del organismo. La trombocitosis aparece cuando el número de plaquetas es elevado y puede formar trombos dentro de las arterias, ésta elevación puede darse sin justificación o puede darse por un mal funcionamiento de la médula, así como reacción a hemorragias agudas o ciertas enfermedades.

Velocidad de segmentación globular (VSG): Este parámetro mide la velocidad a la que se sedimentan los glóbulos rojos de la sangre en un tiempo determinado (1-2 horas aproximadamente). Los niveles normales están entre 0 y 10 mm/hora en hombres y entre 0 y 20 mm/h en mujeres. No suelen presentarse niveles muy bajos, sólo cuando se proporciona un tratamiento y es con el fin de confirmar que está funcionando, pero cuando los niveles son altos se puede asociar al mieloma, los linfomas, las leucemias, y algunos procesos inflamatorios como lo son el lupus y la artritis reumatoide; adicionalmente se puede elevar por procesos fisiológicos como el embarazo o la menstruación, también se puede presentar en algunos ancianos. [7]

V. CONCLUSIONES El laboratorio se llevó a cabo de forma satisfactoria logrando dar cumplimiento a los objetivos propuestos, pues se comprendió el principio de funcionamiento de la microscopía óptica a través de la visualización de diferentes muestras, por lo que era de suma importancia la adecuada manipulación del instrumento. Para esto primero se coloca la muestra previamente manipulada en la platina, se debe girar el revólver hasta que se encuentre en el objetivo con el menor aumento, para posteriormente con el anillo macrométrico graduar la altura de la platina hasta encontrar el punto de enfoque, es importante tener en cuenta que cuando se pase a un aumento mayor se debe usar el anillo micrométrico para enfocar la imagen, además entre mayor sea el aumento menor es la cantidad de luz que pasa por el objetivo, por lo que es necesario incrementar la potencia de la fuente de luz; cuando se requiera usar el objetivo de aumento más alto (x100) el revólver se debe ajustar en un punto medio entre los objetivos para así facilitar la aplicación del aceite de inmersión, esto ayudará a proteger el objetivo de diferentes daños y mejorar la resolución de la imagen obtenida. Adicionalmente, gracias al buen manejo del microscopio se observaron a detalle las muestras, logrando identificar diversas estructuras las cuales fueron descritas a lo largo del informe. Sin embargo durante el laboratorio pueden presentarse ciertos percances que alteran los resultados o la velocidad de su obtención, entre estos se encuentra una mala manipulación de alguna de las partes del microscopio, en especial el anillo macrométrico y micrométrico, al cambiar de un objetivo a otro por accidente se mueve el anillo macrométrico tratando de enfocar mejor la muestra o de mover el micrométrico, pues estos se encuentran unidos, por lo que la muestra se desenfoca y es necesario repetir el proceso de ajuste, generando un gasto de tiempo innecesario; la solución a esta problemática está ligada a la concentración y atención del estudiante que está realizando la prueba, sin embargo sería de gran ayuda separar los dos anillos para que funcionen de forma independiente. Por otra parte, Es muy común notar que las personas olvidan ajustar la intensidad de la fuente de luz al usar objetivos de mayor aumento generando una pérdida considerable de la visibilidad de la muestra, esto podría solucionarse moviendo la resistencia variable de un anillo independiente, a el revólver, para que funcionen de forma conjunta. Otra posible causa de error se encuentra en la obtención de las muestras, pues si no se realiza adecuadamente el raspado bucal o se retira únicamente la epidermis del bulbo de la cebolla, no se podrán observar de forma clara, impidiendo la identificación de las diversas estructuras que lo componen, nuevamente gran parte de la responsabilidad del éxito de la práctica recae sobre el estudiante y la forma en la que obtiene la muestra, pero resultaría de gran ayuda contar con herramientas más especializadas para la obtención de las mismas, pues al realizar el extendido del raspado bucal se podían apreciar restos de hisopo que perjudicaban la visualización de la muestra.

REFERENCIAS [1]

S.N. S.F. El microscopio óptico. Mundo microscopio. Recuperado de: https://www.mundomicroscopio.com/

[2]

Gil, Jheysonn. (12 de junio de 2012). Biología 1: Laboratorio N° 2 microscopía. Blogspot. Recuperado de: http://jheysonngilromero.blogspot.com.co/2012/06/laboratorio-n-2microscopia.html

[3]

Caña, Jhoan.S.F. Por qué la letra en el microscopio se vio al revés. México. Scribd. Recuperado de: https://es.pdfcoke.com/doc/272032012/Por-Que-La-Letra-en-ElMicroscopio-Se-Vio-Al-Reves

[4]

McDoogleburger, Amelia. (Julio 27 de 2017). Why do compound microscopes invert the images? Healfully. Recuperado de: https://healthfully.com/do-compound-microscopes-invert-images5208588.html

[5]

QUIMICA CLINICA APLICADA S.A.. (Julio de 2011). COLORANTE WRIGHT Para diagnóstico “in vitro”. Recuperado de: http://www.cromakit.es/pdfs/inserts/997939.pdf

[6]

Juan Diego. (27 de agosto 2016). reactivo de lugol. recuperado de:https://www.coursehero.com/file/p39041h/REACTIVO-DELUGOL-El-lugol-o-soluci%C3%B3n-de-Lugol-es-unadisoluci%C3%B3n-de-yodo/

[7]

Tuñón, Maria Dolores. (19 de enero de 2018). Análisis de sangre. Webconsultas. Recuperado de: https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/resultados-y-valoresde-un-hemograma-12159