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CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA, ETANOL Y PROTEÍNAS

I.INTRODUCCIÓN En un proceso biotecnológico es deseable el aumento de la población de los microorganismos a los cuales se les refiere normalmente con el nombre de biomasa, así como también es deseable la obtención de un producto secundario o resultante. Para que la biomasa muestre un crecimiento en su población, es necesario que los microorganismos cuenten con condiciones ambientales óptimas para su desarrollo. Estos microorganismos tienen un metabolismo cambiante y poco predecible, lo cual indica; que si hay cambios, aunque sean de poca magnitud en las condiciones (temperatura, pH, velocidad de agitación, etc.), y los elementos que componen el medio ambiente en el cual se encuentran, afectan de manera directa el desarrollo de los microorganismos impidiéndoles crecer. (Flores-Morfin, J., 1999) La gran mayoría de métodos instrumentales requieren una calibración, proceso que relaciona la señal analítica medida con la concentración del analito. Uno de los métodos más frecuentemente utilizados es el uso de una curva de calibración. Para realizar el método de la curva de calibración se procede a realizar una serie de soluciones de concentración conocida de analito, los cuales se introducen en el instrumento y se registra la señal instrumental. Normalmente esta señal se corrige por medio de la señal de una blanco analítico en el que se establece el cero de absorbancia, este blanco contiene todos los componentes de la matriz de análisis (ejemplo: solución de glucosa, etanol) a excepción de analito que se desea medir. (Skoog, D. A., 2001)

II. MARCO TEORICO Espectrofotometría: La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la absorbancia se puede usarla ley de Lambert- Beer, esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución. La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último,

depende de ε, una constante de proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción, que es específica de cada cromóforo. La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan de: Figura 1. Partes de un espectrofotómetro.

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos. Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone

en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta. (Abril, Bárcena, Fernández, Galván, Jorrín, Peinado, Meléndez &Túnez).

III. MATERIALES

• Micropipeta de 1000μL • Micropipeta de 200μL • Micropipeta de 100μL • Baño termostático • Vórtex. • Espectrofotómetro • Baño de hielo • Tubos tapa rosca • Gradillas • Balones volumétricos de 100 ml • Glucosa • DNS • Solución madre de levadura

IV. PROCEDIMIENTO

 Preparación del reactivo DNS ▪ Pesar 2 g de NaOH y Disolverlos de 100 mL de agua destilada y 37,5 g de Tartrato de Sodio y potasio.

▪ Agregara 1,25 g de DNS, bajo calentamiento a baño de Maria

Aforar a 250 destilada.

mL con agua

Almacenar a temperatura ambiente y proteger de la Luz

 Elaboración de la curva estándar de glucosa

• Preparar una solución madre de glucosa a 1,0 g/L en un balón de 200 ml.

• Hacer las siguientes diluciones en tubos de ensayo usando las micropipetas • Tomar 1 mL de cada una de las diluciones preparadas, servir en otro tubo de ensayo y adicionar a cada una 1000 μL de DNS, incluyendo al blanco.

Tapar cada tubo para evitar pérdidas de muestra por evaporación.

Leer las absorbancias de las soluciones a 540 nm.

Realizar una curva de calibración de concentración de glucosa en g/L versus absorbancia.

• En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones, guardar todos los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar.

• Pasados los 5 minutos exactos, llevar las soluciones a un baño de hielo durante 5 minutos o hasta el momento que se vaya a realizar las lecturas de las absorbancias.

• Llevar todas las soluciones al baño termostático a una temperatura de 80-90°C durante 5 minutos.

• Hacer un ajuste lineal de los datos.

 Elaboración de la curva estándar de biomasa

Preparar una solución madre de levadura de panadería de 200 mL.

V. RESULTADOS

•Hacer las siguientes diluciones partiendo de una dilución en la cual el valor de absorbancia corresponda a 1,0:

• Leer las absorbancias de las soluciones a 600 nm.

• Realizar una curva de calibración de concentración de biomasa en g/L versus absorbancia.

 CURVA ESTANDAR DE BIOMASA N° de tubos Concentración Absorbancia Promedio ABS 1 0.1 0.231-0.230-0.233 0.231 2 0.2 0.421-0.422-0.422 0.422 3 0.3 0.613-0.612-0.611 0.612 4 0.4 0.791-0.792-0.795 0.793 5 0.5 0.985-0.985-0.984 0.985 6 0.6 1.084-1.083-1.083 1.084 7 0.7 1.207-1.206-1.207 1.207 8 0.8 1.300-1.302-1.301 1.301 9 0.9 1.351-1.350-1.351 1.351 10 1.0 1.417-1.418-1.418 1.418 Tabla 1. Resultado final de absorbancia de la prueba de biomasa

BIOMASA 1.2

ABSORBANCIA

1 f(x) = 0.72x - 0.13 R² = 0.96

0.8 0.6

CONC Linear (CONC)

0.4 0.2 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

CONCENTRACION

Grafica 1. ABS vs Concentración de biomasa

 CURVA ESTÁNDAR DE GLUCOSA

N° de tubos Concentración Absorbancia Promedio ABS 1 0.1 0.127-0.127-0.128 0.127 2 0.2 0.370-0.369-0.369 0.369 3 0.3 0.504-0.506-0.507 0.505 4 0.4 0.860-0.866-0.868 0.864 5 0.5 1.166-1.166-1.169 1.167 6 0.6 1.380-1.383-1.384 1.382 7 0.7 1.667-1.671-1.674 1.670 8 0.8 1.718-1.722-1.725 1.721 9 1.0 2.172-2.182-2.181 2.178 Tabla 1. Resultado final de absorbancia de la prueba de glucosa

GLUCOSA 1.2

absorbancia

1 f(x) = 0.42x + 0.04 R² = 0.99

0.8

Concentración Linear (Concentración)

0.6 0.4 0.2 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

concentracion

Grafica 1. ABS vs Concentración de glucosa

VIII. DISCUSIONES Se desarrolló con eficacia un procedimiento para determinar la concentración de (azúcares reductores) por el método del ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS); la determinación de estos azúcares se realizó para obtener una curva de calibración, con este reactivo (DNS) que tiene capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de 540nm en el espectrofotómetro.

Las gráficas muestran resultados satisfactorios ya que el valor de R, obtenidos tanto en la prueba de azúcares como de Biomasa fueron de 0.9875 y 0.9612 respectivamente. Existe una relación entre intensidad de color y la concentración de la sustancia, con base en la Ley de Lambert-Beer podemos afirmar que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que es específica de cada cromóforo.

IX.BIBLIOGRAFÍA 1.Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman (2001) Principios de Análisis Instrumental. 5ta Edición, Editorial McGraw‐Hill. 2.Gamero-Inda, E.; Flores-Morfin, J.; “Fuzzy control of a biotechnology process” FuzzyInformation Processing Society, 1999. NAFIPS.