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Meta-análise de estudos genéticos apoia uma associação de variantes comuns a contribuição suscetibilidade Doença comum Associação de poderosos estudos oferecer uma abordagem Identificar variantes genéticas que influenciam suscetibilidade a comuns disease1–4, mas são afetadas pela a impressão de que eles nem sempre reproducible5,6. Em princípio, a inconsistencia pode ser devido a falsos resultados positivos falsos negativos tachonar estudos,- es ou verdade variabilidade em associação entre diferentes populations4–8. A questão essencial é saber se falsos resultados positivos A esmagadora maioria deles explicar a inconsistência. ANALISÁMOS 301 Estudos publicados comunicados que abrange 25 diferentes associações. Houve um grande excesso de estudos reproduzinte os primeiros resultados positivos relatórios, incompatível com a hipótese de não verdadeiro positivo As associações (P < 10–14). Este excesso de repetições não poderiam ser EXPLICAR de forma razoável pela publicação Tendenciosidades e estava concentrado Entre 11 de 25 associações. De 8 de estas 11 associações, reunido do followup análise estudos produzido estadisticamente significante réplica do primeiro relatório, com modestos estimado Efeitos genéticos. Assim, uma considerável fração (mas no âmbito metade) de descrito associações têm um forte indício de réplica; para falsos negativos, destes, underpowered estudos provavelmente contributo a inconsistente réplica. Concluímos que existem Provavelmente muitas variantes comuns no genoma humano com modesto mas comum reais efeitos sobre risco de doença, e que tachonares usante grande número de amostras será convincentemente identificar essas variantes. Das 166 associações entre freqentemente estudadas verda- comum formigas e, selecionamos diseases9 comum um subconjunto de 25 associações de meta-analysis (quadro 1). Após a exclusão da primeira Notícias positivas (definido como o mais rapidamente estudo para conseguir P < 0,05), identificámos 301 adicional estudos publicados entre esses 25 As associações, ou cerca de 12 estudos repetidos potencial por associação. Consideramos a hipótese de que o original Associações são relatados falsas notícias positivas em grande parte. No falta de publicação desta hipótese viés, que predicts cerca de 5% desses 301 estatisticamente significativa estudos devem ser- jargão em P < 0,05, cerca de 1% dos estudos devem ser signifi- jargão em P < 0,01 e assim por diante. Dos 301 estudos, no entanto, 59 atingido P < 0,05 (contra 15 tais estudos expectado por acaso), 26 Estudos tiveram P < 0,01 (contra 3 expectado), e 10 estudos tiveram P < 0,001 (versus <1 expectado). Estas taxas estão em grande excesso de o esperado por acaso na hipótese de não verdadeira relacioCiations (P < 10–14 para a 0,05 e 0,01 significação limiares e P < 10–12 para a 0,001 limiar; P valores determinados por meio do distribuição de Poisson para cada entrada).

Este resultado poderia, teoricamente, ser explicado pela publicação preconceito, O preferencial publicação de estudos estatísticos que permitam atingir significado e não-publicação de estudos que não. Mas Vários linhas de evidência sugerem que este não é o caso. Em primeiro lugar, 47 de 59 estudos com P < 0,05 mostraram um efeito na mesma direcção como que figura no estudo original (inconsistente com ao acaso directionality predito sob o cenário de De verdade associações; P < 10–5 por sinal teste). Segundo calculámos, O número de hipotético não publicado não-significativa tachonares que seriam necessários para explicar este grande excesso de replicatiões. A probabilidade de que qualquer estudo seria seguir-up Por acaso tanto como atingir significância em P < 0,05 e mostrar uma efectuação no mesmo sentido que o relatório original é de 1 de 40. Assim, para dar conta dos observados 47 repetições, iriam Necessidade de se foram extraídos um pool de estudos 40 vezes maior, que é, de 1.880 total publicado e não publicado Estudos (95% intervalo de confiança (c.i.) = 1.381–2.501). Como Existem apenas 301 trabalhos publicados, devemos postular a Existência de um adicional 1.579 não publicado, não-significativa Estudos, ou uma média de 63 não publicado estudos para cada relacioCiation (95% c.eu. = 43–88). Dada a relativa facilidade com que Mesmo com imparcialidade as pequenas nãosignificativa associação estudos têm sido publicado (especialmente se a associação em questão é controVersial), e porque uma média de apenas 13 estudos foram total Na realidade publicada por associação, o presente grau de publicação preconceito parece improvável. Do mesmo modo, fomos capazes de estimar a quantidade real de publicação influenciar na nossa amostra por considerar o número de Estudos que conseguiu P < 0,05 mas não mostrou um efeito na em frente a direcção como que figura no relatório original. Não foram 12 desses estudos; como acima, estes deverão também ocorrem por oportunidade de vez em 40 vezes, e portanto ser proveniente de um pool de 480 Estudos (95% c.eu. = 250–839). Como existem apenas 301 barLEÇA estudos, o presente corresponde a uma média de 179 unpubLEÇA estudos, ou aproximadamente 7 não publicado por estudos ssociation (95% c.eu. = 0–21). Este pequeno grau de publicação preconceito é plausível mas também insuficiente para explicar o grande num- RIC de repetições observamos. Por último, foi feita uma 'funil plano DE analysis10, um gráfico teste para publicação preconceito, e encontraram que apenas três estudos mostraram uma importante prova de publiTion preconceito (Tabela 1 e figo. 1). Assim, o excesso de repetições Observamos não pode ser explicado pela publicação preconceito. Publicado online 13 Janeiro de 2003; doi:10,1038/ng1071 © Página 2 Carta 2 • Natureza genética online publicação antecipada Em particular, apenas 11 das 25 associações tinham mltiplas réplicaÄOES de o relatório original, e estes conta para 44 de 47 repetições (quadro 1). Este grau de agrupante foi não-casual (P = 0,002 por simulação). Assim, mais de metade dos comunicados associaÒes têm pouca ou nenhuma evidência de réplica, mas uma considerável fracTion de associações (11 de 25 para Essaanálise) foram reproduzido muito mais freqentemente do que seria de esperar por acaso. Temos em seguida os possíveis motivos para explorar incoerência de

réplica, especialmente entre as 11 associações com mltiplos repetições e não-repetições. Uma possibilidade é que associaÒes são específicos para determinadas populações. Alternativamente, falsos trabaTivos devido a estratificação étnica mistura e população (descritos no ref.a 1, por exemplo) poderá contribuir para inconsistência. Por último, os estudos com amostras de pequenas dimensões poderia faltar poder de fiavelmente detectar modesto genético, provocando intermitente réplica. Se a incoerência na réplica se deveram a populaçãoOs efeitos específicos para algumas associações, um deve esperar heterogeneity através de estudos (associação de alguma verdade e nenhuma associação populações em outros). Dez associações mostrou uma heterogeneidade significativa. Em seis destes casos, comoNunca, a prova de heterogenidade desapareceram depois que desarmazenada quer um único distantemente estudo ou dos casos anómalos representando menos que 5% de estudos (quadro 2). Assim, para a maioria associaÒes, há apenas poucos elementos para heterogenidade de lado a lado CAD, doença arterial coronariana, infarto do miocárdio; MISSISSÍPI; ins, inserção; del, supressäao; RFLP, restrição-comprimento do fragmento polimorfismo; dinucl. rept., dinucleotide repetir. P valor para publicação viés foi calculada como described10. A norma normal desviar (norma erro divididos por o logue de a razão de chances) para cada um Estudo é regrediram contra os seus precisão (o inverso da norma erro). Se a 90% c.eu. para o intercepto exclui zerar, reflectido no presente quadro como P < 0,10, não existe Provas da publicação preconceito. Página 3 Carta • Natureza genética online publicação antecipada 3 Estudos (embora o poder para detectar heterogenidade é limitado Com número reduzido de estudos). Para os quatro restantes heterossexualGeneous associações, que separa os estudos de etnia não Retirar o heterogenidade (quadro 3), e não poderíamos identificar Qualquer clara metodológico discrepâncias que poderiam dar satisfações O heterogenidade (dados não mostrados). Assim, a população-específicos Efeitos parecem pouco provável para explicar o excesso de repetições. falsos positivos devido aos repetidos população estratificação também parece pouco provável para explicar a maior parte do excesso de repetições, como 9 A 11 multiplicar reproduzido associações foram repetidos usante controlos baseados-familiares ou em mltiplas grupos étnicos. Por outro lado, underpowered não-significativa estudos do Real Associações com modestos efeitos genéticos podem razoavelmente conta por grande parte da variabilidade na réplica. COERENTE com o presente Modelo, EM 8 de 25 original notícias positivas foram reproduzido em um meta-analysis of follow-up estudos genéticos modesta, com efeitos que seria difícil para reproduzir em pequenos estudos (quadro 2). Como

expectado, todos os 8o estavam entre as 11 associações com mltiplos repetições. Mais rácios previsionais chances foram entre 1,1 e 2; A maioria dos casos extremos, um risco relativo de 1,07 para HTR2A e esquizofrenia, exigindo um estudo de caso–controle 6.900 pares Para atingir 80% a motor em P < 0,05, muito maior do que típico relacioCiation estudos com centenas de pessoas. Um dos aspectos da análise importante é que a estiamigo do efeito genético no primeiro relatório positivo é influenciado para cima. Na verdade, de 24 de 25 associações, as chances proporção no primeiro Provas de publicação preconceito: Fig. 1 Assinalar traçar análises para detectar publicação preconceito. Todos os dados ponto repreUm estudo separado sents indicada para a associação. Para cada estudo, as chances proporção é Plotada em um logarítmico escala contra a precisão (a recíproca de O desvio padrão). Está ausente, Se influenciar pequenos estudos terão chances rácios que são de modo extensivo disseminado mas ainda centrado em torno da razão de chances as estimativas fornecidas pelo maior, mais preciso estudos. Neste caso, o plano vai lembrar um funil sobre sua lado com a boca para o eixo y (topo). Se influenciar está presente, parte da diversãonel boca (pequenos estudos com chances rácios próximo a 1) será omitente (baixo). formal critérios estatísticos estão descritos na lenda a Tabela 1. aStatistically significativas em modelos efeitos fixos e aleatório. bStatistically significativas no modelo de efeitos fixos em direção oposta à apenas; relatório original. OU, esticasado reunido odds ratio; CAD, doença arterial coronariana, infarto do miocárdio; MISSISSÍPI. Página 4 Carta 4 • Natureza genética online publicação antecipada Relatório positivo excedidas o efeito genético estimado pela metaanálise das restantes estudos. Este resultado é coerente com o principal conclusão de uma recente revisão da associação studies11. Nós Hipotetizar que esta é uma consequência coerente sobrestimação O 'fenômeno' a maldição do vencedor, recentemente descritas no conjuntoMARIUSZ de vinculação studies12 e talvez mais claramente descrita para leilġes (ver ref.a 13 por exemplo). Se todos os participantes local leilão oferta que são preconceituosos mas impreciso estimativas de um item da verdade Valor, o preço de venda final será um ascendente influenciado estimativa de O valor, porque o sucesso da proposta vencedora está condicionada a que Sendo a maior oferta de um conjunto de estimativas sem vieses. Por um semelhante lógica, o efeito genético de uma associação estudo será influenciado

sobe, na condição de que esse estudo é o primeiro a chegar estatística significado e ser publicado. Em qualquer caso, o expectado grau de sobe viés pode ser matematicamente modelado e predito. Para 23 de 25 estudos inicial positiva, a sobrestimação do Efeitos genéticos foi consistente com um vencedor a maldição do fenômeno (Apenas 3 dos 23 valores P sob os nossos vencedor a maldição do modelo foram <0,1, e nenhuma foi <0,01). Uma consequência do vencedor's praguejamento é que a razão de chances no primeiro estudo não pode ser positiva USADA para estimar a resistência do efeito genético, como foi salientado em anteriores authors11,12. De modo notável, dois estudos em nosso primeiro positivo GYS1 e análise (ABCC8 Íntron 24 com diabetes tipo 2) EXTREMAMENTE sobreavaliado o real efeito genético, numa medida que Foi inconsistente com um vencedor do praguejamento (P < 10–5 em ambos os casos). Estes dois estudos podem representar as associações limitada a uma forte Muito específicos da população, mas pode também ser simplesmente danificado estudos. nossos resultados corroboram duas conclusões: falsas complementares associação positiva são abundantes em literatura, mas existem Real também muitas associações escondimento entre os dados. Estas de verdade Associações provavelmente conferir maior risco de uma modestamente comum Doença e assim são difíceis de detectar. Além disso, alguns dos esse verdadeiros associações estão dispersos por já publicados Associações. A nossa análise foi limitado a associações com comMon as variantes, como não existem o bastante publicada association Estudos com raras variantes para permitir meta-analysis, provavelmente Devido a maiores desafios do estudante raras variants14. Assim, Apesar de o nosso apoio a contribuição dos resultados variantes comuns A doença comum, eles não tratar de uma maneira ou outra o Contribuição da variação de rara doença comum. UM recente estudo também revisadas associações entre verda- comum formigas e disease11 comum. É difícil comparar suas directamente Resultados porque incluíam to ours notícias positivas na sua primeira Análises, e porque nossa revisão parece ser mais abrangente (por exemplo, identificámos 48 estudos de uma associação entre DRD3 e esquizofrenia, comparado com 25 em seus study11). Para 8o de 36 associações em sua análise, o reunido a razão de chances excedidas 1, Apesar de não terem rejeitar publicação preconceito como um possível explaNação. Apesar das dificuldades em comparação, o panorama geral está É encorajador semelhante: quando todos os estudos publicados são combinados, Cerca de 20–30% dos estudos genéticos associação são statistiCamente previsionais modesta significativa, com efeitos genéticos. Propomos três recomendações gerais. Em primeiro lugar, à luz de O aparentemente elevada proporção de falsas notícias positivas no acesoerature, mais rigorosos critérios para interpretante association tachonarIes são necessários. Uma única associação significativa deveria, de modo nominal

ser visto como provisório até que tenha sido independentemente reproduzido Pelo menos uma vez e de preferência por duas vezes. A revisão desses 25 associaÒes sugere que dois estudos com P < 0,01 ou um único estudo (com excepção da primeira positivo) com P < 0,001 é de modo forte preditor de futuro réplica (dados não mostrados). Em segundo lugar, grandes estudos deve ser incentivada, com colaborativo Provavelmente os esforços necessários para atingir o tamanho da amostra de muitos tuAreias do caso–controlo pares que é necessário para estudos definitivos de variantes comuns com modestos efeitos genéticos. Até mesmo as grandes amostras Serão necessários para detectar gene–gene ou gene–ambiente InteracÒes ou associações específicas para definir subgrupos ou para corrigir experimentante associação de mltiplas fenótipos. De contribuir para aumentar a Dimensão eficaz da amostra, relatórios da associação deveriam incluir um meta-análise de todos os dados disponíveis publicados para dar uma mais robusto A estimativa do efeito genético. Para facilitar essa meta-análises e minimizar publicação preconceito, todos os estudos que cumpram doença association as normas de qualidade mínima deve ser publicado. Essas normas Poderia incluir explícito fenótipo definições, listagem completa de todos fenótipos analisadas, localização precisa do polimorfismo(s), baixa Genotipificação taxa de erro, análise que evita sobreposição com previOus estudos e disponibilidade de genótipo contagens de casos e conTrols (ou dados equivalentes para família-com base estudos). Publicação não-significativa resultados poderiam ser incentivados utilizando fóruns como um Estudo da associação base de dados comum ou 'breve relatórios' e 'negativos Resultados' secções de revistas da especialidade, com com o pro- crédito suficiente veja incentivos para publicação. Por último, os nossos resultados sugerem um possível produtivo avenue para ser humano doença genética em o futuro próximo. É provável que um fração (talvez um publicados anteriormente trimestre) de associações representa o verdadeiro associações com doença comum. Assim, usante grande número de amostras para testes em todos os previamente comunicados às associações, talvez Inicialmente centrado sobre as associações que já foram reproduzido pelo menos uma vez, seria provavelmente identificar uma significativa Número de variantes que afetam o risco de doença comum. Página 5 Carta • Natureza genética online publicação antecipada 5 Métodos Selecção de associações para análise. Em um estudo anterior, identificámos 160 Associações entre doença e risco polimorfismos comum (definido como tendo pelo menos dois alelos com 1% na freqüência >popu-

Tion) quando a associação não foi consistentemente reproducible9. Especificamente, Estas associações tinha três ou mais distintos estudos publicados no total, em menos um dos que atingiram significância estatística (um 'positiva' estudo) e a Pelo menos 25% de que não atingiram significância (negativos estudos). A minimizar problemas decorrentes de mltiplos hipótese experimentante, limitámos a nossa análise para a 130 estudos de variantes com uma única associada alelo ou genótipo e dicotômico fenótipos como doente versus saudáveis. Temos também o tratamento relatórios que envolva diferentes polimorfismos na mesma Gene como separar as associações. Embora marcadores em associações em muâltiplos Um gene pode apoiar o general noção que variar em que gene é relacioSões com doença suscetibilidade, não é possível avaliar plenamente se uma associação em provas previr um marcador de outro sem saber o marcador padrão de vinculação desequilíbrio (CorrelaEntre os marcadores tion) na população em estudo. Foram selecionados 25 destas associações para análise mais aprofundada, 8 associações escolhido ao acaso acrescido de todas as associações para identificar três doenças de interest para nós: diabetes tipo 2 (9 associações), associações transtorno bipolar (2) Associações e esquizofrenia (6). É que se buscou identificar todas publicadas Estudos para estes 25 associações independentes por vários perscruta da literaTivo publicados através aproximadamente 2001 maio (tendo o cuidado de identificar casos em que mltiplas papéis discutiram o mesmo conjunto de dados e choosIng apenas um representante papel). A análise estatística Para cada estudo., comparamos o nmero de risco (ou alelos Genótipos) nos casos e de controlo e calculados os valores de P pela análise com 1 χ2 grau de liberdade (Fisher ou pelo teste se a qualquer das células no expectado Mesa eram inferiores a 5). A situação de transmissão-desequilíbrio experimentante Na matriz–prole Trios é algebricamente equivalente ao tratamento do número de As transmissões de cada alelo como o número de ocorrências de que o alelo no casEs e considerando a realização dos controlos a ser uma grande população com igual numRIC de cada alelo (reflictam a expectado 50:50 transmissão proporção). UTILIZÁMOS alelo contagens a menos que o original positivo relatório mostrou uma associação mais forte A doença risco com uma determinada diplóide genótipo mais do que com um allele. ANALISÁMOS todos os estudos utilizando a mesma fenótipo que foi relatada

associados no estudo original positivo para essa associação. COMPARÁMOS a Número de valores observados estudos com abaixo de um P determinado limite com o Número de tais estudos expectado por acaso utilizando uma distribuição de Poisson. Nós realizada funil parcela anaâlise em described10. Para determinar se houve não-casual agrupante da réplica Estudos (follow-up relatórios com P < 0.05 e associação na mesma orienÑO que o relatório original), que efectuámos 10.000 simulações de nossos dados. Em cada aleatoriamente simulaçäao, temos 47 estudos repetidos a cada um as 25 associações com uma probabilidade proporcional ao número total de Estudos publicados para cada associação. Para obter um empírico P valor, nós contado o nmero de simulações em que o grau de agrupante de Estudos repetidos correspondido ou excedidas a atual os dados observados. Por associação, testamos a recolha de estudos (excluindo a Em primeiro lugar relatório positivo) de homogeneidade utilizando um coeficiente de Pearson χ2 bondade-de-fit15; As associações foram considerados homogéneos para P > 0,05. Para HomogeUTILIZÁMOS Neous associações, o Epílogo Statistical Package (epicentro softmercadoria) para calcular a reunido a razão de chances e 95% c.eu. para a razão de chances usando tanto a efeitos fixos efeitos ao acaso um model16,17 e model18. Para heterogeneous associações, nós alinhado os estudos de acordo com as suas individUal χ2 os valores de a bondade-de-combinar teste, retirou o estudo com o χ2 maior valor e repetiu este processo até uniformidade foi atingido. Se a associação se tornou homogéneos após a remoção ou um estudo ou menos que 5% dos estudos, nós recalculado o macacão a razão de chances e 95% C.i., e que quaisquer novas medidas foram tomadas. Meta-análises que exigia a Remoção de mais de um número limitado de distantemente estudos para alcançar uniformidade foram analisados por meio de três novas abordagens. Para estes persistentemente heterogênio associações, que nos colocámos dois Fontes potenciais de heterogenidade. Em primeiro lugar, temos estratificado os estudos por étnicoRado e repetiu a análise separadamente para cada grupo étnico. Em segundo lugar, a métodos de cada estudo foi avaliado por um epidemiologista quem foi cegar o resultado de cada estudo para determinar se metodológico As discrepâncias foram evidentes em qualquer dos estudos. Foram retiradas da meta-análise de estudos com evidentes falhas ou diferenças metodológicas e repetiu a análise. Se nenhuma destas abordagens resultou na homoeliminados sucessivamente geneity, temos estudos com a maior contribuição para heterogenidade como em cima de até uniformidade foi atingido. Embora a

desta forma desarmazenada estudos não podem ser considerados casos anómalos, mudante tachonarSei que mais contribuem para a heterogenidade é uma forma imparcial de alcançante A homogeneidade exigida para meta-analysis. Meta-análises foram consideDerou ter reproduzido o relatório original se a 95% c.i em torno do pool. razão de chances para os estudos excluídos homogéneos utilizando tanto fixo e1 casual-efeitos modelos. Para a análise, a maldição do vencedor calculámos a probabilidade de observante uma razão de chances pelo menos tão grande como o descrito inicial positiva em cada estudo, dado o tamanho da amostra e alelo frequências no estudo, supondo que O real efeito genético foi de modo exacto estimado pelo o restante estudos (Quadro 2). Não podemos então refinado o cálculo de suponente que uma primeira positivo Relatório seria reunir pelo menos uma das três condições que tornam uma publicação rápida Provavelmente: P < 0,01, a razão de chances ≥ 2 ou uso de família-com base dos controlos. (Estes requiÒes são razoáveis, como 24 dos 25 primeiros relatórios positivos alcançados pelo menos um dos Estas três condições.) O valor P sob o vencedor do praguejamento modelo é o Relação entre o valor P para os dados reais no primeiro relatório dividida pelo valor de P Para os dados que minimamente atingir um destes três condições.