Panduan Praktikum Kimia Pangan 2016-2017.pdf

PANDUAN PRAKTIKUM MK. KIMIA PANGAN

TIM PENGAJAR MK. KIMIA PANGAN

PROGRAM STUDI ILMU GIZI DEPARTEMEN ILMU GIZI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS DIPONEGORO

PERCOBAAN 1 IDENTIFIKASI DAN FERMENTASI SENYAWA KARBOHIDRAT TUJUAN PERCOBAAN 1. Mengenal beberapa macam identifikasi senyawa karbohidrat 2. Mengenal peristiwa fermentasi senyawa karbohidrat TEORI SINGKAT Karbohidrat atau sakarida menurut struktur kimiawinya dapat didefinisikan sebagai senyawa polihidroksi aldehid atau senyawa polihidroksi keton, yang pada umumnya mempunyai rumus molekul Cn(H2O)m. Senyawa karbohidrat secara umum dapat diklasifikasikan sebagai berikut. 1. Monosakarida a. Aldosa : glyserosa, errythrosa, ribose, gulosa, laktosa, glukosa. b. Ketosa : ribulosa, xylulosa, psikosa, fruktosa, sorbosa, tagatosa, dihidroksi aseton. 2. Oligosakarida a. Disakarida i. Mereduksi : maltosa, laktosa, gentibiosa, selobiosa, melibiosa, turanosa ii. Tak mereduksi : sukrosa, threhalosa b. Trisakarida i. Mereduksi : mannotriosa, robinosa, rhamninosa ii. Tak mereduksi : raffinosa, gentionosa, melezitosa c. Tetrasakarida : stachyosa, schorodosa d. Pentasakarida : verbacosa 3. Polisakarida a. Polisakarida sederhana : amilum, glikogen, dekstrin, selulosa, inulin b. Polisakarida majemuk : heparin, agar-agar, pektin. Karbohidrat Sederhana Karbohidrat sederhana memiliki molekul paling sederhana dibandingkan dengan molekul karbohidrat yang lain. Karbohidrat jenis ini tidak dapat mengalami hidrolisa. Monosakarida merupakan suatu persenyawaan yang netral dan mudah larut dalam air, sukar larut dalam alkohol, dan tidak larut dalam eter. Berdasarkan gugus fungsi yang terdapat dalam molekulnya, monosakarida dibedakan atas aldosa (mempunyai gugus fungsi aldehid) dan ketosa (mempunyai gugus fungsi keton). Dalam banyak hal, sifat-sifat aldosa banyak menyerupai sifat-sifat aldehid, misalnya baik aldosa maupun aldehid dapat mereduksi pereaksi Benedict, pereaksi Fehling, maupun pereaksi Tollens. Pada pemanasannya dengan fenilhidrazin dapat membentuk osazon. Ketosa dalam beberapa hal mempunyai persamaan sifat dengan keton. Fruktosa, salah satu contoh ketosa yang ada di alam, dapat mereduksi pereaksi Benedict, Fehling, maupun Tollens.

Inilah sebabnya kita tidak dapat membedakan glukosa dan fruktosa dengan pereaksi ini. Fruktosa juga dapat membentuk fruktosazon pada pemanasan dengan fenilhidrazin. Monosakarida yang penting terdapat di alam, adalah : CHO

CH2OH

CHO

CHO

CHO C HO H H

C C C

H

O

C

HO

H

C

H

OH

HO

C

H

HO

C

H

H

C

OH

H

C

H

OH

OH

OH

C

H

C

OH

HO

C

H

HO

C

H

HO

C

H

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

OH

CH2OH CH2OH

CH2OH

D-Fruktosa

CH2OH

D-Glukosa

D-Ribosa

CH2OH

D-Galaktosa

D-Manosa

Disakarida Disakarida tersusun atas 2 satuan monosakarida, Umumnya terdiri atas 2 heksosa, sehingga sering disebut heksodisakarida. Rumus molekulnya adalah C12H22O11 yang diturunkan dari 2 x C6H12O6.1H2O. Hanya ada beberapa disakarida yang tersusun atas heksosa dan pentosa. Pada hidrolisa disakarida akan terbentuk komponen-komponen penyusunnya, yaitu 2 molekul monosakarida. Ada beberapa disakarida yang dikenal oleh banyak orang. Diantara disakarida-disakarida tersebut, ada beberapa disakarida yang memiliki sifat sebagai disakarida pereduksi, ada yang tidak memiliki sifat sebagai disakarida pereduksi. Contoh beberapa disakarida yang penting dalam tubuh manusia antara lain. CH OH O

H

H

O

H

H

O

H

H

OH

H

OH

O

O

OH

Laktosa

OH

H H

H

OH

O

H

H

CH2OH

H

H

H H

OH

H H

OH

Selobiosa

H

H

H

CH2OH

CH2OH O

OH

H

OH

OH

Maltosa CH2OH

OH

H

OH

OH

OH

O

H H

OH

H

O

OH H

O H

OH

H

2

H

H

H

H OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

OH

H

H O

OH

H

H

OH

O

OH H

CH2OH

OH

Sakarosa

Polisakarida (Poliosa) Polisakarida mempunyai susunan yang kompleks dengan berat molekul yang besar. Polisakarida tersusun atas satuan-satuan monosakarida yang banyak, bahkan terkadang termasuk juga turunan-turunannya. Hidrolisa pada polisakarida yang terjadi secara sempurna akan menghasilkan komponen-komponen penyusunnya, yaitu monosakarida-monosakarida ataupun

turunannya. Pada umumnya, polisakarida memiliki rasa yang tidak manis, relatif stabil terhadap alkali, mempunyai sifat optik aktif, tetapi tidak menunjukkan peristiwa mutarotasi. Satuan-satuan monosakarida dalam molekul polisakarida ada yang dalam bentuk piranosa dan bentuk furanosa. Polisakarida praktis tidak mereduksi, walaupun ada beberapa polisakarida yang mempunyai gugus fungsi aldehid bebas yang terdapat pada ujung rantai molekulnya, misal pada amilosa atau selulosa. Beberapa contoh struktur dari polisakarida yang sering digunakan, adalah sebagai berikut. O

H OH

H

O

H

H

OH

OH

CH2OH O

H OH

H

H

OH

H

OH

O OH

OH

CH2OH

H

OH

H H

O

Selulosa

H

H

OH

H

OH

OH

H

C

OH

H

O

OH

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Tabung reaksi 2. Penjepit 3. Corong 4. Pengaduk gelas 5. Pipet paseur 6. Gelas beker 7. Gelas ukur BAHAN 1. Glukosa 2. Fruktosa 3. Laktosa 4. Amilum 5. Alfa naftol dalam alkohol 6. Asam sulfat 7. Pereaksi Fehling 8. Pereaksi Benedict

H

C O

O

H OH

O

H OH

H

CH2OH

H

H

OH

H

O

Amilosa

H

H H

H

O

O H

O

H

H

OH

H

CH2OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

9. Resorsinol dalam asam klorida 10. Ragi roti 11. Fenilhidrazin 12. Asam nitrat 13. Natrium karbonat 14. Pereaksi Tollens 15. Asam pikrat

H CH2OH

O

PERCOBAAN DAN CARA KERJA 1. TES UMUM TERHADAP KARBOHIDRAT Tes Molisch + Tes Molisch termasuk dalam tes umum terhadap karbohidrat selain tes Anthron. Namun, dalam pelaksanaannya, tes Molisch merupakan tes umum terhadap karbohidrat yang paling sering dilakukan. Dalam tes Molisch, karbohidrat ditambah larutan alfa naftol dalam alkohol, kemudian melalui dinding tabung reaksi, dialiri asam sulfat pekat. Terbentuknya cincin ungu menunjukkan bahwa terdapat karbohidrat pada sampel tersebut. Untuk monosakarida (seperti heksosa dan pentosa), terjadi 2 tahap reaksi, yaitu dehidrasi monosakarida menjadi furfural (pentosa) atau hidroksi metil furfural (heksosa) dan kondensasi furfural yang terbentuk dengan alfa naftol dan asam sulfat membentuk persenyawaan berwarna ungu (violet). Untuk poliosa dan biosa, maka proses mula-mula adalah terjadi hidrolisa menjadi manosa-manosa. Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, tabung 1 diisi dengan glukosa, tabung 2 diisi dengan fruktosa, tabung 3 diisi laktosa, dan tabung 4 diisi dengan amilum. Pada masing-masing tabung, ditambahkan alfa naftol dalam alkohol, lalu gojog dengan kuat. Kemudian aliri dengan asam sulfat secara hati-hati lewat dinding tabung. Jangan digojog. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Hasil positif adalah terbentuknya cincin ungu. Reaksi :

CH C

HC

C6H12O6 heksosa

C

C

O CH 2OH

O

H

OH HC C O CH 2 OH

CH C C

H

hidroksi metil furfural

O

H2SO4 +

CH C

HC C

alfa naftol

O

C

O CH 2OH HO3 S

SO3H OH

Pertanyaan yang harus dijawab pada laporan resmi : 1. Kesimpulan apa yang Saudara ambil dari percobaan tersebut. 2. Bagaimana analisa Saudara jika tes Molisch dilakukan pada larutan maltosa dan potongan kertas saring. 3. Tulis reaksi kimia yang terjadi pada tes Molisch secara umum.

2. TES KARBOHIDRAT PEREDUKSI Tes Fehling Pereaksi Fehling merupakan campuran yang tersusun atas 2 macam larutan, yaitu. 1. Larutan Fehling A, berisi larutan kuprisulfat 2. Larutan Fehling B, berisi campuran larutan natrium hidroksida dan larutan kalium natrium tartrat yang sering disebut sebagai garam Rochelle atau garam Seignette. Dengan volume yang sama, larutan Fehling A dan larutan Fehling B bila dicampur maka akan diperoleh larutan berwarna biru. Pada tes Fehling, gula pereduksi akan mengalami oksidasi menjadi asam aldonat yang dengan adanya NaOH, maka akan terbentuk garam natrium. Hal sebaliknya terjadi pada pereaksi Fehling yang mengalami reduksi sehingga tembaga yang awalnya memiliki bilangan oksidasi +2 akan menjadi tembaga dengan bilangan oksidasi +1. Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, tabung 1 diisi dengan glukosa, tabung 2 diisi dengan fruktosa, tabung 3 diisi laktosa, dan tabung 4 diisi dengan amilum. Pada masing-masing tabung, ditambahkan campuran larutan Fehling A dan Fehling B. Amati perubahan yang terbentuk. Kemudian panaskan dengan hati-hati. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Hasil positif adalah terbentuknya endapan merah bata. Reaksi : CHO H

C

COONa OH

+ Cu2+ + NaOH + H2O

H

C

OH

+ Cu2O ↓ + 2H+

Pertanyaan yang harus dijawab pada laporan resmi : 1. Apa yang terjadi jika tes Fehling ini dilakukan pada maltosa. 2. Kesimpulan apa yang dapat Saudara ambil dari percobaan diatas 3. Tulis reaksi yang terjadi secara umum 4. Sebutkan beberapa contoh dari karbohidrat pereduksi dan karbohidrat non pereduksi 5. Apa isi dari pereaksi Fehling? Mengapa sebelum akan dipakai, larutan Fejling A dan Fehling B tidak boleh dicampur dahulu? 6. Apa yang terjadi jika sedikit glukosa ditambah pereaksi Fehling dibandingkan dengan glukosa dan larutan Fehling berada dalam jumlah yang sama banyak. Jelaskan analisa jawabanmu. Tes Benedict Pereaksi Benedict tersusun atas kuprisulfat, natrium karbonat, dan natrium sitrat. Seperti halnya pada tes Fehling, pada tes Benedict ini gula pereduksi akan dioksidasi menjadi asam aldonat, sedangkan pereaksi Benedict (sebagai Cu2+) akan tereduksi menjadi Cu2O.

Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, tabung 1 diisi dengan glukosa, tabung 2 diisi dengan fruktosa, tabung 3 diisi laktosa, dan tabung 4 diisi dengan amilum. Pada masing-masing tabung, ditambahkan larutan Benedict. Amati perubahan yang terbentuk. Kemudian panaskan dengan hati-hati. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Hasil positif adalah terbentuknya endapan merah bata. Reaksi : CHO H

C

COONa OH

+ Cu2+ + NaOH + H2O

H

C

OH

+ Cu2O ↓ + 2H+

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : 1. Apa yang terjadi jika percobaan ini dilakukan pada maltosa 2. Kesimpulan apa yang dapat Saudara ambil dari percobaan diatas 3. Tulis reaksi yang terjadi secara umum 4. Apa isi dari pereaksi Benedict? Mengapa pereaksi ini lebih baik daripada pereaksi Fehling? 5. Apa yang terjadi jika glukosa dalam jumlah banyak ditambah pereaksi Benedict dalam jumlah sedikit. Jelaskan analisa jawabanmu. Tes Asam Pikrat Pada tes asam pikrat, digunakan reagen asam pikrat jenuh yang berwarna kuning. Dalam reaksinya, gula pereduksi akan menjadi asam aldonat, sedangkan asam pikrat akan mengalami reduksi menjadi asam pikramat. Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, tabung 1 diisi dengan glukosa, tabung 2 diisi dengan fruktosa, tabung 3 diisi laktosa, dan tabung 4 diisi dengan amilum. Pada masing-masing tabung, ditambahkan larutan asam pikrat jenuh dan natrium karbonat. Amati perubahan yang terbentuk. Kemudian panaskan dengan hati-hati. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Reaksi : O2N

CHO H

OH

OH

C

N O2

OH

aldosa

COONa H

NO2

asam pikrat

C

O2N

NH 2

OH

asam aldonat

NO2

asam pikramat

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : 1. Apa yang terjadi jika percobaan ini dilakukan pada maltosa 2. Tulis reaksi yang terjadi secara umum 3. Kesimpulan apa yang dapat Saudara ambil dari percobaan diatas 4. Tes asam pikrat dikerjakan dalam suasana apa? Warna apa yang terbentuk dari reduksi asam pikrat? Tes Tollens Pereaksi Tollens dibuat dengan mereaksikan larutan perak nitrat dengan ammonium hidroksida berlebihan sehingga endapan yang terjadi dapat larut. AgNO3 + NH4OH Ag2O + NH4OH

Ag2O + H2O + NH4OH Ag(NH3)2OH + H2O

Pada reaksi ini, karbohidrat pereduksi akan teroksidasi menjadi asam aldonat yang membentuk garam ammonium, sedangkan pereaksi Tollens akan tereduksi sehingga terbentuk logam perak yang melekat pada dinding tabung sebagai lapisan tipis yang menyerupai cermin. Cermin perak ini akan hilang jika dibersihkan dengan HNO3 pekat. Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, tabung 1 diisi dengan glukosa, tabung 2 diisi dengan fruktosa, tabung 3 diisi laktosa, dan tabung 4 diisi dengan amilum. Pada masing-masing tabung, ditambahkan larutan Tollens dengan jumlah sama banyak dengan sampel. Amati perubahan yang terbentuk. Kemudian panaskan dengan hati-hati. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Hasil positif adalah terbentuknya cermin perak pada dinding tabung. Reaksi : COONH 4

CHO H

C

+ Ag(NH3)2OH OH

+ Ag ↓ + H2O H

C

OH

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : 1. Apa yang terjadi jika percobaan ini dilakukan pada maltosa 2. Tulis reaksi yang terjadi secara umum 3. Kesimpulan apa yang dapat Saudara ambil dari percobaan diatas 4. Bagaimana cara membuat pereaksi Tollens? 3. TES KHUSUS UNTUK FRUKTOSA Tes Seliwanoff Pereaksi Seliwanoff adalah meta hidroksi benzena atau resorsinol dalam asam klorida. Pereaksi ini digunakan khusus untuk menunjukkan adanya fruktosa (levulosa). Pada tes

Seliwanoff, reaksi terjadi dalam 2 tahap, yaitu proses dehidrasi dari fruktosa oleh HCl yang ada di dalam pereaksi Seliwanoff menjadi hidroksi metil furfural, kemudian dilanjutkan dengan kondensasi antara hidroksi metil furfural dengan resorsinol membentuk persenyawaan berwarna merah. Sukrosa atau sakarosa atau gula tebu, dengan pereaksi Seliwanoff pada pemanasan akan memberikan warna merah. Hal ini disebabkan larutan sukrosa akan mengalami hidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa karena adanya HCl dalam pereaksi Seliwanoff. Fruktosa yang dihasilkan ini akan berkondensasi dengan resorsinol sehingga terbentuklah warna merah Percobaan : Sediakan 2 tabung reaksi bersih, tabung 1 diisi dengan glukosa, dan tabung 2 diisi dengan fruktosa. Pada masing-masing tabung ditambahkan pereaksi Seliwanoff, kemudian panaskan secara bersama-sama. Amati perubahan yang terbentuk, catat dalam laporan. Reaksi : CH 2 OH C

O

HO C

H

HCl

H

C

OH

H

C

OH

3 H2O +

C O CH 2OH

H

O

hidroksi metil furfural

CH 2 OH O

HO

C O CH 2OH

H

O

O

OH

+ 2

O

+ 2 H2O

resorsinol HOH 2 C

4. FERMENTASI Fermentasi karbohidrat adalah perubahan jenis gula oleh pengaruh ragi menjadi etanol dan karbondioksida. Tidak semua jenis gula akan mengalami proses ini. Selain itu, peragian atau fermentasi ini berlangsung oleh pegaruh fermen/ enzim yang dihasilkan oleh mikroba-mikroba yang menumpang hidup pada ragi. Fermen atau ragi yang dihasilkan oleh mikroba-mikroba tersebut adalah biokatalisator yang mengkatalisa tingkat-tingkat reaksi pada fermentasi. Ada banyak enzim yang bekerja pada proses ini. Sebagai sumber fosfat dalam proses fermentasi ini adalah ATP (Adenosin Tri Phosphat) dan disamping itu juga sebagai sumber energi. Apabila ATP melepaskan 1 gugus fosfatnya maka akan terbentuk ADP (Adenosin Tri Phosphat). Fermentasi karbohidrat adalah suatu proses yang kompleks. Reaksinya tidak berjalan spontan, tetapi bertingkat-tingkat dengan hasil-hasil antara yang banyak. Diantara fermen-fermen tersebut, ada diantaranya yang mempunyai Co.I (Coenzim I, Codehidrogenase I, Cozimase I) dan ada juga yang mempunyai Co.II (Coenzim II,

Codehidrogenase II, Cozimase II). Baik Co.I maupun Co.II berperan sebagai pemindah hidrogen dari satu senyawa ke senyawa lain. Sebagai sumber fosfat dalam proses fermentasi ini adalah ATP (Adenosin Tri Phosphat) dan disamping itu juga sebagai sumber energi. Apabila ATP melepaskan 1 gugus fosfatnya maka akan terbentuk ADP (Adenosin Di Phosphat). Fermentasi karbohidrat adalah suatu proses yang kompleks. Reaksinya tidak berjalan spontan, tetapi bertingkat-tingkat dengan hasil-hasil antara yang banyak, Mekanisme fermentasi amilum menjadi etanol dan CO2 secara singkat dapat digambarkan sebagai berikut. Percobaan : Misalkan kita akan meragikan glukosa (dekstrosa) dengan mempergunakan ragi roti. Caranya dengan membuat suspensi roti dengan cara melumatkan roti kemudian menambahkan air dan diaduk baik–baik. Suspensi yang diperoleh dicampur dengan larutan glukosa yang akan diragikan. Campuran yang kita peroleh dimasukkan ke dalam tabung peragian (lihat gambar di samping) sehingga tabung peragian penuh dengan campuran tersebut diatas. Dibiarkan beberapa waktu dan perhatikan dengan seksama.

Gambar Tabung Peragian

Pengamatan : Gelembung – gelembung gas akan timbul pada bagian atas dari tabung fermentasi, yang makin lama makin banyak dan akan menekan cairan ke bawah. Gelembung – gelembung ini adalah gas CO2 hasil fermentasi yang dapat ditunjukkan dengan air barit. Pada bagian atas dari sisa-sisa suspensi dalam tabung fermentasi terdapat cairan yang jernih. Cairan ini adalah etanol yang terbentuk pada proses fermentasi, yang ditunjukkan dengan Liben tes atau lodoform tes. Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : 1. Gambarlah tabung fermentasi dengan baik, dan jelaskan dengan singkat bagaimana fermentasi dapat dilaksanakan dalam tabung tersebut!

2. Tulislah semua tingkat-tingkat reaksi fermentasi ini secara lengkap dalam buku laporan resmi saudara. 3. Singkatan apakah ATP dan ADP ? Tulis rumus struktur dari ke dua senyawa tersebut ! 5. TES OSAZON. Osazon adalah kristal berwarna kuning yang terbentuk apabila kita mereaksikan beberapa jenis monosakarida atau disakarida pereduksi dengan larutan fenilhidrazin. Bentuk osazon untuk beberapa jenis gula bila diperhatikan dengan mikroskop berbeda-beda. Karena itulah dengan melihat bentuk osazon kita dapat mengetahui gula pembentukannya, dengan membandingkan kristal yang terbentuk dengan kristal yang ada dalam tabel osazon. Tes ini sering dipakai untuk membedakan monosakarida atau disakarida pereduksi. Mekanisme reaksi pembentukan osazon dari aldosa secara singkat dapat digambarkan sebagai berikut :

Catatan: Osazon adalah nama umum, maka apabila gula pembentukannya adalah glukosa disebut glukosazon; maltosa disebut maltosazon; pembentuknya fruktosa disebut fruktosazon dan seterusnya. Percobaan : Sediakan 3 buah tabung reaksi bersih, tabung 1 diisi dengan glukosa, tabung 2 diisi dengan maltosa, dan tabung 3 diisi laktosa. Pada masing-masing tabung ditambahkan dengan larutan fenilhidrazin. Masukkan ketiga tabung reaksi di atas ke dalam penangas air yang mendidih dan tunggu sampai terbentuk warna kuning. Ambilah zat yang berwarna kuning tersebut dan periksa dengan mempergunakan mikroskop. Catat hasilnya dalam data pengamatan.

Tugas : 1. Gambarlah bentuk-bentuk kristal dari glukosazon, maltosazon dan laktosazon yang diperoleh. 2. Tulislah mekanisme reaksi kimia tingkat-tingkat reaksi pembentukan glukosazon. 3. Tulislah tingkat-tingkat reaksi pembentukan maltosazon dari maltosa. 4. Tulislah tingkat-tingkat reaksi pembentukan laktosazon dari laktosa. 5. Jelaskan dengan singkat bagaimana dengan dua cara saudara dapat membedakan fruktosa dengan glukosa.

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 1 IDENTIFIKASI DAN FERMENTASI SENYAWA KARBOHIDRAT 1. Tes Molisch NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

2. Tes Fehling NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

3. Tes Benedict NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

4. Tes Asam Pikrat NO PERLAKUAN

HASIL

PARAF

5. Tes Tollens NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

6. Tes Seliwanoff NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

7. Tes Osazon NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

8. Fermentasi

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 2 KADAR GULA DALAM MADU TUJUAN PERCOBAAN Penetapan kadar gula pereduksi dan sukrosa dalam madu TEORI SINGKAT Madu adalah bahan yang dihasilkan oleh lebah madu (Apis mellifera) berasal dari sari bunga atau cairan yang berasal dari tanaman hidup dikumpulkan, diubah dan diikat oleh senyawa tertentu oleh lebah disimpan dalam sarangnya. Madu berasa manis, bukan berasal dari bahan tambahan, tetapi karena komponen utamanya yang terdapat dalam madu adalah senyawa karbohidrat terutama glukosa, fruktosa, sukrosa, dan dekstrin. Disamping itu juga mengandung protein, asam amino, enzim glukosidase (invertase atau sakarase) dan diastase asam organik, yaitu asam glukonat, mineral, zat aroma, dan zat warna. ALAT dan BAHAN ALAT 1. Timbangan analitik 2. Botol timbang 3. Erlenmeyer 4. Gelas beker 5. Gelas ukur 6. Labu ukur BAHAN 1. Sampel madu 2. Pb asetat 3. Natrium karbonat 4. Larutan Luff Schoorl 5. KI 6. Asam sulfat 7. Asam klorida

7. Pipet paseur 8. Statif 9. Buret 10. Kompor listrik 11. Pendingin Leibig 12. Pipet volume

8. Natrium hidroksida 9. Natrium tiosulfat 10. Akuades 11. CuSO4 12. Asam sitrat 13. Kalium sulfat

PERCOBAAN dan CARA KERJA Penetapan Kadar Gula Pereduksi  Timbang seksama 5 gram sampel madu, masukkan dalam labu takar 250 mL.  Encerkan dengan akuades dan tambahkan 5 mL larutan Pb asetat  Cek dengan beberapa tetes larutan Na2CO3 10%, jika terbentuk endapan berwarna putih, berarti larutan Pb asetat yang ditambahkan sudah cukup.

        

Tambahkan Na2CO3 kembali sebanyak 15 mL untuk mengendapkan kelebihan Pb asetat Encerkan sampai batas volume labu takar (250 mL), gojog selama 30 menit, diamkan, kemudian disaring Ambil 10 mL dari filtratnya menggunakan pipet volume, masukkan ke dalam erlenmeyer 500 mL Tambahkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 15 mL akuades, batu didih, dan 25 mL larutan Luff Schoorl Hubungkan erlenmeyer dengan pendingin bola, lakukan proses refluks dengan cara didihkan selama 10 menit dengan api kecil Ambil larutan, dinginkan pada air yang mengalir. Setelah dingin, tambahkan ke dalam larutan sebanyak 10 mL KI 20% dan 25 ml larutan K2SO4 25% secara hati-hati. Tambahkan 2-3 tetes indikator kanji ke dalam larutan lalu titrasi dengan Na2S2O3 0,1000 N sampai warna biru hilang Ulangi percobaan di atas pada blangko dengan menggunakan 25 mL akuades dan 25 mL larutan Luff Schoorl

Proses Refluks Perhitungan : Volume (mL) larutan Na2S2O3 yang digunakan contoh = volume (mL) larutan Na2S2O3 blangko – volume (mL) larutan Na2S2O3 sampel Kemudian dijabarkan dengan larutan Na2S2O3 yang normalitasnya 0,1000 N Selanjutnya gunakan tabel / daftar Luff Schoorl, untuk mencari berapa mL gula yang setara dengan mL larutan Na2S2O3 yang digunakan 𝑚𝑔 𝑔𝑢𝑙𝑎 ×

massa gula pereduksi (mg) =

250 10

𝑚𝑔 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

x 100 %

Penetapan kadar Sukrosa  Ambil dengan menggunakan pipet volume sebanyak 50 mL fitrat dari percobaan gula pereduksi sebelumnya, lalu masukkan dalam erlenmeyer 100 ml  Tambahkan 25 mL akuades dan 10 mL HCI 30% lalu panaskan dalam penangas air (70 °C) selama 10 menit  Kemudian dinginkan pada air mengalir, netralkan dengan larutan NaOH 45% dan encerkan sampai volume 250 mL dengan menggunakan labu takar.  Ambil 25 mL larutan dari labu takar, masukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 25 mL larutan Luff Schoorl  Tambahkan beberapa butir batu didih ke dalam erlenmeyer dan hubungkan dengan pendingin bola refluks selama 10 menit.  Setelah mendidih, dinginkan cepat-cepat pada air mengalir, lalu tambahkan 15 mL larutan KI 20% dan 25 mL H2SO4 26,5% secara hati-hati.  Titrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1000 N dengan menggunakan indikator larutan amilum  Ulangi percobaan diatas pada blangko dengan menggunakan 25 mL akuades dan 25 mL larutan Luff Schoorl Perhitungan : Dengan cara yang sama seperti diatas menggunakan tabel kadar gula pereduksi setelah inversi (setelah dihidrolisa dengan HCl 30%) dapat dicari. Selisih kadar gula reduksi setelah inversi dengan kadar gula sebelum inversi merupakan kadar gula sukrosa

TABEL PENETAPAN GULA INVERT DENGAN METODE LUFF SCHOORL mL tiosulfat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Glukosa, Fruktosa 2,4 2,4 4,8 2,4 7,2 2,5 9,7 2,5 12,2 2,5 14,7 2,5 17,2 2,6 19,8 2,6 22,4 2,6 25,0 2,6 27,6 2,6 30,0 2,7 33,0 2,7 35,7 2,7 38,5 2,8 41,3 2,8 44,2 2,9 47,1 2,9 50,0 2,9 53,0 3,0 56,0 3,0 59,1 3,1 62,2

Galaktosa 2,7 2,8 5,5 2,8 8,3 2,9 11,2 2,9 14,1 2,9 17,0 3,0 20,0 3,0 23,0 3,0 26,0 3,0 29,0 3,0 32,0 3,0 35,0 3,1 38,1 3,1 41,2 3,2 44,4 3,2 47,6 3,2 50,8 3,2 54,0 3,3 57,3 3,4 60,7 3,5 64,2 3,5 67,7 3,6 71,3

Laktosa

Maltosa 3,9

3,6 3,7 7,3

3,9 7,8

3,7 11,0

3,9 11,7

3,7 14,7

3,9 15,6

3,7 18,4

4,0 19,6

3,7 22,1

3,9 23,5

3,7 25,8

4,0 27,5

3,7 29,5

4,0 31,5

3,7 33,2

4,0 35,5

3,8 37,0

4,0 39,5

3,8 40,8

4,0 43,5

3,8 44,6

4,0 47,5

3,8 48,4

4,1 51,6

3,8 52,2

4,1 55,7

3,8 56,0

4,1 59,8

3,9 59,9

4,1 63,9

3,9 63,8

4,1 68,0

3,9 67,7

4,1 72,2

4,0 71,7

4,2 76,5

4,0 75,7

4,3 80,9

4,1 78,8

4,4 85,4

4,1 83,9

4,6 90,0

4,1 88,0

4,6 94,6

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 2 KADAR GULA DALAM MADU 1. Penetapan Kadar Gula Pereduksi JENIS LARUTAN VOLUME TIOSULFAT (mL) Blangko

PARAF

Sampel Perhitungan :

2. Penetapan Kadar Gula Sukrosa JENIS LARUTAN Blangko

VOLUME TIOSULFAT (mL)

PARAF

Sampel Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 3 IDENTIFIKASI SENYAWA PROTEIN dan LEMAK TUJUAN PERCOBAAN Mengenal beberapa macam identifikasi senyawa protein dan lemak TEORI SINGKAT PROTEIN Protein adalah senyawa organik yang memiliki bentuk molekul sangat besar dan susunannya sangat komplek serta merupakan polimer dari asam-asam alfa amino. Pada dasarnya, protein bukan merupakan zat tunggal ataupun molekul sederhana, tetapi masih terdiri dari asam-asam amino. Oleh karena protein tersusun atas asam-asam amino, maka susunan kimianya juga mengandung unsur-unsur seperti yang terdapat dalam asam-asam amino penyusunnya, yaitu C, H, O, N, dan kadang-kadang mengandung unsur-unsur lain, seperti misalnya S, P, Fe, atau Mg. Adapun susunan untuk beberapa macam protein adalah sebagai berikut : Karbon : 52,40 – 54,50% Oksigen : 21,00 – 25,5% Hidrogen : 6,90 – 7,30% Belerang : 0,80 – 2,0% Nitrogen : 15,50 – 18,00% Dalam hal ini diabaikan jumlah kecil garam-garam anorganik yang terdapat sebagai campurancampuran ikatan dalam protein. Daftar asam-asam amino penyusun protein 1. Asam monoamino monokarboksilat H C

H

COOH

H3C

H C

H C

OH

NH2

COOH

H3C

Treonin (Thr)

H C

H C

CH3

NH2

H C

COOH

NH2

Sistein (Cys)

H3C

H2 C

COOH

Serin (Ser) COOH

C

H3C

S

H2 C

H2 C

H C

COOH

NH2

Metionin (Met)

Valin (Val) H

HS

H C NH2

Alanin (Ala)

Glisin (Gly)

H2 C

H2 C

HO

COOH

NH2

NH2

H3C

H C

NH2 C

COOH

CH3 H

Isoleusin (Ile)

H3C

H C

H C

COOH

CH3 NH2

Leusin (Leu)

2. Asam monoamino dikarboksilat HOOC

H2 C

H C

COOH

H2 C

HOOC

H2 C

NH2

H C

COOH

NH2

Asam aspartat

Asam glutamat

3. Asam diamino monokarboksilat

H2N

H2 C

H2 C

H2 C

H2 C

H C

COOH

H2N

NH2

Lisin (Lys)

H N

C

H2 C

NH

H2 C

H2 C

Arginin (Arg)

H C

COOH

NH2

4. Asam amino aromatik NH2 H2 C

C

NH2 COOH

H2 C

HO

H

C

COOH

H

Fenilalanin (Phe)

Tirosin (Tyr)

5. Asam amino heterosiklis HC

H2 C

C

N

NH C H

H C

COOH

C CH

NH2

N H

Histidin (His) HO

CH

Prolin (Pro)

H C

COOH

NH2

Triptofan (Trp)

H C

COOH

N H

H2 C

CH N H

COOH

Hidroksi prolin

Telah diketahui banyak sekali macam protein. Senyawa-senyawa ini mempunyai sifat kolid, yang menyebabkan sangat sukar dipisahkan dan dimurnikan dari campurannya. Perbedaan antara bermacam-macam protein ini kadang-kadang tidak jelas, sehingga sukar sekali menentukan apakah sebuah sediaan protein terjadi dari satu macam molekul protein atau molekul-molekul dari berbagai macam protein. Dalam semua sel hidup ditemukan protein. Peranan utama protein dalam tubuh manusia adalah untuk membangun sel baru, memelihara sel-sel yang telah ada dan mengganti sel-sel yang telah rusak atau aus. Protein dapat pula berperan sebagai sumber energi, apabila konsumsi makanan berenergi tinggi yaitu lemak dan karbohidrat tidak mencukupi. Berbagai jenis protein ada yang mempunyai peranan spesifik untuk tubuh, misalnya sebagai pengatur metabolik

(hormon), sebagai biokatalisator (enzim), sebagai pertahanan tubuh (antibodi), sebagai pembawa sifat turunan, sebagai pengangkut oksigen dalam darah dan masih banyak lagi fungsi yang lain. Susunan Protein Rantai peptida merupakan tulang punggung dari struktur protein, sedangkan ikatan peptida merupakan faktor utama dalam menentukan konfigurasi rantai tersebut. Linus Pauling dan Robert Corey telah dapat menentukan secara tepat geometri dari peptida lengkap dengan berbagai macam ukuran dan besarannya. Protein mengandung sebuah atau lebih rantai polipeptida. Stabilitas struktur protein pada umumnya dipertahankan oleh dua jenis ikatan kovalen yang kuat (peptida dan disulfida) dan tiga jenis ikatan non kovalen yang lemah (hidrogen, hidrofobik, dan elektrostatik). Dalam molekul protein yang besar, ikatan sistein (ikatan disulfida), ikatan elektrostatik (ikatan garam), ikatan hidrogen, dan interaksi hidrofobik, tidak hanya terdapat dalam satu rantai polipeptida, tetapi dapat pula menghubungkan rantai polipeptida yang satu dengan rantai polipeptida yang lain. Protein merupakan makrobiomolekul dari asam-asam alfa amino dengan susunan kompleks dan berat molekul berkisar antara 5.000 sampai beberapa juta. Struktur tiga dimensi protein tersebut dapat dijelaskan dengan mempelajari tingkat organisasinya yaitu yang menyangkut struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener. Struktur primer protein tidak lain adalah jumlah, macam, serta urutan asam-asam amino yang membentuk rantai polipeptida. Susunan tersebut merupakan rangkaian unik dari asam amino, dengan gugusan R (rantai samping pada polipeptida) berada pada posisi trans. Struktur primer menentukan sifat dasar dari berbagai protein. R1

H

CH

O

N

R3

C

H

CH

O

N

R5

C

CH

N

C

CH

N

C

CH

N

C

H

O

R2

H

O

R4

H

O

Struktur primer protein

Struktur sekunder protein adalah rantai polipeptida yang memililit seperti sipral membentu alfa heliks, yang distabilkan oleh ikatan hidrogen dari rantainya sendiri.

Gambar Struktur α-heliks protein Struktur tersier protein terbentuk karena terjadinya pelipatan rantai polipeptida, sehingga membentuk protein globuler. Kemantapan dari struktur ini didukung oleh ikatan-ikatan elektrostatik, ikatan sistin, dan antaraksi hidrofobik. Ikatan sistin merupakan ikatan yang terkuat dalam mempertahankan struktur.

Ikatan yang mendukung stabilitas struktur protein Struktur kuartener protein dibentuk oleh dua atau lebih rantai polipeptida yang saling dihubungkan oleh ikatan elektrostatik dan ikatan hidrogen. Polipeptida yang membangun struktur kuartener ini dapat sama atau berbeda. Protein dengan struktur kuartener sering disebut poligomer dan bagian-bagian pembentuk poligomer disebut protomer. Beberapa contoh oligomer: (a) amilase, dengan 2 buah protomer; (b) hemoglobin dan katalase, masing-masing dengan 4 protomer; (c) virus mosaik tembakau dengan 2130 protomer. Ikatan-ikatan yang terdapat pada molekul protein Protein tersusun atas rantai-rantai polipeptida. Rantai polipeptida yang satu dengan rantai polipeptida yang lain dihubungkan oleh adanya ikatan-ikatan tertentu. Ikatan-ikatan yang terdapat dalam molekul protein adalah ikatan peptida, ikatan sistin, ikatan garam, ikatan ester,dan ikatan hidrogen. 1. Ikatan Peptida Ikatan peptida atau ikatan amida asam adalah ikatan yang terdapat dalam rantai peptida itu sendiri, yaitu ikatan antara asam amino yang satu dengan asam amino yang lain. CH3 N H

CH

H2C C

N

O

H

CH

SH

CH2OH

C

N

O

H

CH

H2C

C

N

O

H

CH

H2 C C O

H2 C

H2 C

NH2

Karena ikatan ini terdapat dalam rantai peptida, maka ikatan ini selalu ada dalam molekul protein. Banyak sedikitnya ikatan peptida dalam molekul protein dapat dites dengan menggunakan tes Biuret. 2. Ikatan Sistin Ikatan sistin atau ikatan disulfida dalam molekul protein adalah secara homopolar atau secara kovalen, yaitu ikatan atom-atom di dalam molekul disebabkan karena persekutuan elektron-elektron yang dimiliki bersama oleh dua atom S. H H O

H

N C

C

C

H

S

H H

S

N

C

H

C

atau

H C

H

H

H2C

S

S

CH2

O

Ikatan sistin dalam molekul protein terjadi bila terdapat ke dua buah sisa asam amino yang terdapat dalam rantai peptida berdekatan. Ikatan ini dapat menghubungkan dua rantai polipeptida tetapi dapat pula hanya terdapat satu rantai peptida. C H

C

H2 C

N

H

S

S

H

N

H2 C

C

O

C

H

H2C

S

S

CH2

N

C

C

N

C

C

H

H

O

H

H

O

Ikatan sistin dikenal pula sebagai ikatan disulfida dan terjadi apabila dua residu asam amino sistein berdekatan. Protein yang mengandung banyak ikatan-ikatan ini bila dibakar mempunyai bau tidak enak. LIPIDA Dalam ilmu kimia yang dimaksud dengan lemak adalah suatu ester antara gliserol dengan asam lemak, dimana ketiga radikal hidroksil dari gliserol diesterkan. Jelaslah bahwa lemak adalah suatu trigliserida (triasil gliserol). Disamping trigliserida dikenal pula digliserida (diasilgliserol) dan monogliserida (monoasil gliserol). Kedua gliserida yang terakhir ini, yaitu digliserida dan monogliserida meskipun suatu ester tetapi bukanlah suatu lemak. O

O

O

H2C

O

C O

R1

H2 C

O

C O

R1

H2 C

HC

O

C O

R2

HC

O

C

R2

HC

OH

H2C

O

C

R3

H2 C

H2 C

OH

trigliserida

OH

digliserida

O

C

monogliserida

R1

Gliserol atau Gliserin Gliserol, gliserin atau 1,2,3-propanatriol merupakan alkohol jenuh bermartabat tiga, alkohol primer atau alkohol sekunder. Pada suhu kamar adalah zat cair yang tidak berwarna, kental, netral terhadap lakmus dan rasanya manis. Dalam keadaan murni mempunyai sifat higroskopis. Dapat bercampur dengan air, tetapi tidak larut dalam karbon tetraklorida, kloroform, dietil eter, karbon disulfida dan benzena. Dehidrasi gliserol dapat terjadi karena penambahan kalium hidrogen sulfat pada suhu tinggi. Hasil dehidrasi adalah aldehida alifatik tak jenuh yang mempunyai aroma khas dan disebut akroleina atau propenal. Reaksi ini sering dipakai untuk identifikasinya gliserol meskipun tidak spesifik. H2C

OH

HC

OH

KHSO4

CH2=CH―CH=O + 2 H2O

210 ºC H2C

OH

reaksi dehidrasi gliserol

Gliserol dapat mencegah terbentuknya endapan pada reaksi antara tembaga sulfat encer. Hal ini disebabkan karena terbentuknya persenyawaan komplek yang larut. Hasil oksidasi gliserol tergantung kuat tidaknya oksidator yang dipakai. Dengan oksidator lemah akan terbentuk gliseraldehida, sedang dengan oksidator kuat akan terjadi asam gliserat. H2C OH

H C

C

OH

H

gliseraldehid

O

H2C OH

H C

C

OH

OH

O

asam gliserat

Gliserol mempunyai banyak pemakaian, terutama sebagai bahan dasar untuk sintesa senyawa-senyawa organik yang lain. Dalam kedokteran gliserol dipakai sebagai laksansia atau pencahar. Pada konsentrasi 25%, gliserol bekerja sebagai antiseptik. Disamping sebagai pelarut dan pemanis, gliserol dipakai pula sebagai pengawet vaksin dan ferment. Asam-asam Lemak Asam lemak tidak lain adalah asam monokarboksilat yang rantai karbonnya tidak bercabang dan radikal karboksilnya ada di ujung rantai karbon tersebut. Baik yang terdapat pada tanaman, manusia atau hewan, asam lemak mempunyai jumlah atom karbon genap dan dapat berupa asam lemak jenuh maupun asam lemak tidak jenuh. Lipida sederhana dan lipida majemuk semuanya mempunyai unit penyusun asam lemak. a. Asam-asam lemak jenuh Asam-asam lemak jenuh (saturated fatty acids) tidak mempunyai ikatan rangkap dalam struktur kimianya. Beberapa asam lemak jenuh telah diketahui sebagai penyusun lemak hewan atau minyak tanaman.

Rumus C3H7─COOH C5H11─COOH C7H15─COOH C9H19─COOH C11H23─COOH C13H27─COOH C15H31─COOH C17H35─COOH

Nama Trivial asam butirat asam kaproat asam kaprilat asam kaprat asam laurat asam miristat asam palmitat asam stearat

Nama Sistematik asam butanoat asam heksanoat asam oktanoat asam dekanoat asam dodekanoat asam tetradekanoat asam heksadekanoat asam oktadekanoat

b. Asam-asam lemak tidak jenuh Rantai karbon dari asam-asam lemak tidak jenuh (unsaturated fatty acids) mempunyai sebuah atau lebih ikatan rangkap dua. Pada umumnya asam-asam lemak yang terdapat di alam dengan memiliki satu atau lebih ikatan. Asam-asam lemak yang mempunyai dua buah ikatan rangkap atau lebih, maka ikatan rangkapnya adalah non konjugasi. Dengan demikian, ikatan-ikatan rangkap tersebut tidak terletak berdampingan, tetapi dipisahkan oleh gugusan metilena (―CH2―). ─ CH = CH ─ CH = CH ─ konjugasi

─ CH = CH ─ CH2 ─ CH = CH ─ non konjugasi

Beberapa contoh asam lemak tak jenuh yang telah banyak dikenal, antara lain :  Asam palmitoleat (asam-9-heksadekenoat) C15H29─COOH CH3 ─ (CH2)5 ─ CH = CH ─ (CH2)7 ─ COOH  Asam oleat (asam-9-oktadekenoat) C17H33─COOH CH3 ─ (CH2)7 ─ CH = CH ─ (CH2)7 ─ COOH  Asam linoleat (asam-9,12-oktadekadienoat) C17H31─COOH CH3 ─ (CH2)4 ─ CH = CH ─ CH2 ─ CH = CH ─ (CH2)7 ─ COOH  Asam linolenat (asam-9,12,15-oktadekatrienoat) C17H31─COOH CH3 ─ CH2 ─ CH = CH ─ CH2 ─ CH = CH ─ (CH2)7 ─ COOH  Asam arakidonat (asam-5,8,11,14-eikosatetraenoat) C17H31─COOH CH3 ─ (CH2)4 ─ CH = CH ─ CH2 ─ CH = CH ─ CH2 ─ CH = CH ─ CH2 ─ CH = CH ─ (CH2)3 ─ COOH Asam-asam lemak yang mempunyai dua buah ikatan rangkap atau lebih, seperti : asam linoleat, asam linolenat, dan asam arakidonat, sangat dibutuhkan oleh tubuh tetapi tidak dapat dibuat di dalam tubuh, sehingga harus diperoleh dari luar yaitu dari lemak makanan. Asam lemak yang demikian ini disebut asam lemak esensial. Sebaliknya ada pula asam-asam lemak non esensial, yaitu asam-asam lemak yang dibutuhkan oleh tubuh dan tubuh sendiri dapat

membuatnya melalui proses biokimiawi yang rumit. Asam butirat, asam palmitat, asam stearat dan asam oleat adalah contoh-contoh dari asam-asam lemak non esensial. Klasifikasi Lemak Lemak netral, trigliserida atau triasil gliserol yang diperoleh dari hewan-hewan berderajat tinggi, dikenal sebagai lemak hewani dan di Indonesia pada umumnya merupakan bahan padat (fat). Lemak yang didapat dari tanaman disebut lemak nabati, yang di Indonesia pada temperatur biasa merupakan zat cair (minyak). Sebagian besar lemak hewani merupakan zat padat, sebab lemak hewani pada umumnya mengandung asam-asam lemak jenuh rantai panjang sebagai unit penyusunnya. Lemak yang terdapat pada ikan paus, ikan cod dan ikan herring pada suhu biasa merupakan zat cair sehingga dikenal sebagai minyak ikan. Lemak nabati merupakan zat cair, karena pada umumnya mengandung sebuah atau lebih asam lemak tidak jenuh sebagai unit penyusunnya. Lemak nabati banyak terdapat dalam kacang-kacangan, buah-buahan, biji-bijian dan akar tanaman. Hanya wujud atau bentuk fisik saja yang membedakan antara lemak dan minyak. Disebut lemak apabila pada suhu kamar berbentuk padat, dan disebut minyak apabila pada suhu kamar berbentuk cair. Padat atau cairnya suatu lemak, sebenarnya tergantung dari beberapa faktor, antara lain : iklim, panjang atau pendeknya rantai karbon dari asam-asam lemak penyusunnya, serta banyak atau sedikitnya ikatan-ikatan rangkap dari asam-asam lemak penyusunnya. Asam lemak jenuh yang banyak menyusun lemak alam adalah asam stearat dan asam palmitat dan asam lemak tidak jenuh yang banyak menyusun lemak atau minyak alam adalah asam oleat. Diantara sekian banyak lemak yang telah dikenal, ada yang mempunyai sebuah atau lebih ikatan rangkap dua, dan lemak yang demikian ini disebut lemak tidak jenuh (unsaturated fat). Lemak yang tidak mempunyai ikatan rangkap dalam struktur kimianya disebut lemak jenuh (saturated fat). Tripalmitolein adalah salah satu contoh lemak tidak jenuh sedang tripalmitin adalah salah satu contoh lemak jenuh. O H2C

O

HC

O

(CH2)7 C H

C H

(CH2)5 CH3

C

(CH2)7 C H

C H

(CH2)5 CH3

O H2C

O

O

C O

C

atau

H2C

O

HC

O

C O

C15H29

C

C15H29

O

(CH2)7 C H

C H

(CH2)5 CH3

H2C

O

C

C15H29

tripalmitolein O H2C

O

C O

HC

O

C

O

H2 (CH2)7 C

H2 C

(CH2)5 CH3

H2 (CH2)7 C

H2 C

(CH2)5 CH3

O H2C

O

C

H2 (CH2)7 C

H2 C

atau

H2C

O

HC

O

C O

C15H31

C

C15H31

O (CH2)5 CH3

tripalmitin

H2C

O

C

C15H31

Berdasarkan atas komposisinya atau berdasarkan atas asam-asam lemak yang menjadi penyusunnya, maka lemak dibedakan atas lemak berasam satu, lemak berasam dua dan lemak berasam tiga. Baik lemak berasam satu, berasam dua atau berasam tiga dapat merupakan lemak jenuh maupun lemak tak jenuh. Lemak berasam satu adalah lemak yang ketiga asam lemak penyusunnya adalah sama. Tristearin dan triolein adalah dua buah contoh dari lemak berasam satu. O H2C

O

HC

O

O

C O

C17H35

H2C

O

C

C17H35

HC

O

O H2C

O

C O

C17H33

C

C17H33

O

C

C17H35

gliseriltristearat atau tristearin

H2C

O

C

C17H33

gliseriltrioleat atau triolein

Lemak berasam dua adalah lemak dimana jika terdapat tiga asam lemak yang menjadi penyusunnya, hanya dua asam lemak yang sama. Gliseril-1-oleo-2,3-distearat atau 1-oleo-2,3distearin dan gliseril-2-palmito-1,3-distearat atau 2-palmito-1,3-distearin adalah contoh dari lemak berasam dua. O H2C

O

HC

O

O

C O

C17H33

H2C

O

C

C17H35

HC

O

O H2C

O

C O

C17H35

C

C17H31

O

C

C17H35

gliseril-1-oleo-2,3-ditristearat atau 1-oleo-2,3-distearin

H2C

O

C

C17H35

gliseril-2-palmito-1,3-distearat atau 2-palmito-1,3-distearin

Lemak berasam tiga adalah lemak dimana ketiga asam lemak penyusunnya tidak sama. O H2C

O

HC

O

O

C O

C17H35

H2C

O

C

C17H33

HC

O

O H2C

O

C

C O

C17H31

C

C3H7

O C17H31

gliseril-1-stearo-2-oleo-3-palmitat atau 1-stearo-2-oleo-3-palmitin ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Neraca analitis 2. Tabung reaksi 3. Pipet paseur

H2C

O

C

C17H35

gliseril-1-palmito-2-butiro-3-stearat atau 1-palmito-2-butiro-3-stearin

4. Gelas beker 5. Corong BAHAN 1. Sampel protein 2. Reagen Ninhidrin 3. Sampel lemak / minyak 4. Kuprisulfat 5. NaOH 6. Asam nitrat 7. Alfa-naftol dalam alkohol 8. Asam sulfat 9. Asam trikloroasetat 10. Asam fosfomolibdat

11. Asam fosfowolframat 12. Feriklorida 13. Merkuriklorida 14. Plumboasetat 15. Asam glioksilat 16. Asam pikrat 17. Ammonia 18. Akuades 19. Akua bromata 20. Kalium permanganat

PERCOBAAN dan CARA KERJA Tes Ninhidrin Larutan protein encer dengan reagen Ninhidrin akan terbentuk warna ungu sampai biru yang indah. Percobaan : Sediakan tabung reaksi bersih, isi dengan sampel protein, kemudian tambahkan beberapa tetes Ninhidrin, kocok dan perhatikan warna yang terbentuk. Catat dalam laporan. Reaksi :

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Tulislah warna yang terbentuk dan reaksi kimia percobaan Ninhidrin b. Apakah reaksi ini berlaku untuk semua macam protein? Bagaimana jika larutan protein diganti dengan larutan asam amino. Tes Biuret Tes biuret juga merupakan tes umum untuk protein. Bahkan juga untuk asam amino. Tes ini dapat dipakai untuk mengetahui banyak sedikitnya ikatan-ikatan peptida dalam molekul protein yang kita selidiki, dengan melihat warna larutan hasil percobaan. Terbentuk warna merah bila molekul protein yang kita selidiki kecil (sedikit ikatan-ikatan peptidanya) dan terbentuk warna ungu bila molekul protein yang kita selidiki besar (banyak mengandung ikatan-ikatan peptida) Percobaan : Sediakan tabung reaksi bersih, isi dengan sampel protein, kemudian tambahkan beberapa tetes kuprisulfat dan NaOH encer. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Reaksi : CuSO4.5H2O + 2 NaOH Cu(OH)2

Cu(OH)2 + Na2SO4 + 5 H2O Cu2+ + 2 OH‾

COOH

2

R

CH

H

N

O

C

R

CH

H

N

O

C

R

CH NH2

H2N

R

O

H

R

O

H

R

CH

C

N

C H

C

N

C H

COOH

COOH

Cu2+

+ Cu2+ H2N

H C

C

N

CH

C

N

CH

R

O

H

R

O

H

R

ikatan peptida ikatan kompleks berwarna ungu

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Warna apakah yang terbentuk pada percobaan saudara? Kesimpulan? b. Bilamana terbentuk warna ungu? Dan bilamana terbentuk warna merah?

c. Apakah reaksi ini berlaku untuk semua macam protein? Tes Xanthoprotein Tes ini khusus untuk protein yang mengandung asam amino dengan gugus fenil (misal : fenilalanin, tirosin, dll). Dalam hal ini, terjadilah proses nitrasi dari asam-asam amino dengan gugus fenil ini. Proses demikian dapat terjadi pula jika kulit kita terkena asam nitrat pekat terjadi warna kuning. Warna kuning ini adalah hasil nitrasi protein yang terdapat dalam kulit kita. Percobaan : Sediakan tabung reaksi bersih, isi dengan sampel protein, kemudian tambahkan beberapa tetes asan nitrat pekat. Panaskan, amati warna yang terbentuk. Kemudian tambahkan ammonia, amati perubahan yang terjadi, catat pada laporan. Reaksi :

H2C

H2C

C

C H

O protein

H N

+ HO―NO2 +

C

C H

NO2

H N

+ H2 O

O protein

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Reaksi ini khusus untuk protein yang mengandung asam amino apa sebagai penyusun? b. Tulislah reaksi kimianya! c. Warna apa yang terjadi sekiranya kulit kita terkena asam nitrat pekat? Mengapa demikian? Jelaskan ! Tes Molisch Tes ini khusus untuk mukoprotein (glikoprotein) yaitu protein majemuk yang gugus protetisnya karbohidrat. Tes Molisch ini sebenarnya adalah tes umum terhadap adanya karbohidrat, tetapi dapat pula dipakai untuk menunjukkan adanya protein yang mempunyai gugus prostetis karbohidrat. Dalam hal ini protein majemuk oleh pengaruh asam sulfat akan terhidrolisa menjadi protein sederhana dan karbohidrat. Karbohidrat yang terjadi ini juga mengalami hidrolisa menjadi monosakarida-monosakarida. Monosakarida yang terbentuk ini akan mengalami dehidrasi menjadi furfural/hidroksi metil furfural, yang kemudian terkondensasi dengan α-naftol membentuk persenyawaan yang berwarna ungu. Dari hal ini dapat disimpulkan bahwa yang memberikan warna ungu bukan protein tetapi adalah karbohidrat.

Percobaan : Sediakan tabung reaksi bersih, isi dengan sampel protein, kemudian tambahkan beberapa tetes alfa-naftol dalam alkohol, gojog kuat. Lalu tambahkan asam sulfat pekat dengan hati-hati melewati dinding tabung reaksi. Jangan digojog. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Bila protein yang saudara miliki mempunyai gugus prostetis karbohidrat, akan terbentuk cincin berwarna ungu. Reaksi : Bila monosakaridanya adalah heksosa, maka reaksinya secara singkat dapat digambarkan sebagai berikut :

C6H12O6

H2SO4

C

C

-3H2O

C

C

O CH2OH

heksosa

C

O CH2OH

H

O

hidroksi metil furfural

OH

C C

C

C

O

C

+

H

hidroksi metil furfural

C

C

C

C

H2SO4

C

O

O CH2OH

alfa naftol HO3S

SO3H OH

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Apakah reaksi ini berlaku untuk semua macam protein? Kalao tidak untuk protein yang manakah? b. Reaksi Molisch ini sebenarnya reaksi umum untuk menunjukkan adanya apa? Mengapa berlaku untuk mukoprotein? c. Apa yang akan terjadi bila tabung reaksi saudara kocok dengan hati-hati? d. Tuliskan reaksi kimia dari percobaan yang saudara lakukan! Tes Hopkin’s Cole Tes ini khusus untuk protein yang mengandung asam amino triptofan sebagai komponen penyusunnya. Bila larutan protein encer dan mengandung asam amino triptofan sebagai komponen penyusunnya ditambah asam glioksilat dan asam sulfat pekat akan terbentuk persenyawaan yang berwarna ungu.

Percobaan : Sediakan tabung reaksi bersih, isi dengan sampel protein, kemudian tambahkan beberapa tetes asam glioksilat, gojog kuat. Lalu tambahkan asam sulfat pekat dengan hati-hati lewat dinding tabung. Jangan digojog. Amati perubahan yang terjadi, catat dalam laporan. Bila protein yang dianalisa mempunyai komponen penyusun asam amino triptofan akan terbentuk warna ungu. Reaksi : protein C

H C

O

CH2

NH

protein C

H C

O

CH2

H N

H2SO4

C

H C

O

CH2

NH

C

H C

O

CH2

H N

O

N

N CH

H COOH

H

CH N

N COOH

H

H

Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Tes Hopkin’s Cole ini khusus untuk protein yang bagaimana? b. Tulislah reaksi kimia dari percobaan yang saudara lakukan! c. Apakah fungsi asam belerang dalam percobaan ini? d. Tulislah rumus struktur asam glioksilat, asam oksalat, dan asam glikolat ! Tes Sulfida Tes ini khusus untuk protein yang mengandungasam amino metionin, sistein, atau sistin. Percobaan : Sediakan tabung reaksi, isilah dengan larutan putih telur encer dan tambahkan dengan volume yang sama larutan NaOH 40%. Panaskan sekitar 1 menit untuk mengubah S organik menjadi S sulfida. Kemudian tambahlah beberapa tetes larutan Pb asetat. Jika protein yang dianalisa mengandung S, maka akan terbentuk endapan / warna hitam. Reaksi : Na2S + Pb(CH3COO)2

PbS + 2 CH3COONa hitam Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi :

a. Tes khusus ini khusus untuk protein yang mengandung asam amino apa sebagai komponen protein? b. Tulis reaksi kimia dari percobaan yang saudara lakukan ! c. Tuliskan rumus struktur dari 3 buah asam amino yang mengandung belerang yang saudara ketahui ! Reaksi Presipitasi Larutan protein encer dapat diendapkan dengan penambahan reagensia tertentu. Reagensia yang sering dipakai untuk mengendapkan larutan protein diantaranya adalah larutan garamgaram logam berat, alkaloid reagensia, amonium sulfat, dan alkohol pekat. Seperti halnya asam-asam amino, protein pada pH tertentu bersifat sebagai zwitter ion (ion dwi kutub atau ion dipolar), jadi mempunyai muatan positif dan negatif.

2

protein

H

H

H C

protein

COOH

C

COO

+ H+

protein

NH2

NH2

COO

NH3

melepas dan menangkap proton

protein

C

zwitter ion

Pengendapan dengan alkaloid reagensia Alkaloid reagensia adalah reagensia yang dipakai untuk mengendapkan larutan alkaloid. Reagen ini misalnya : asam pikrat, asam gallat, asam suifosalisilat, asam fosfowolframat, asam fosfomolibdat, dan lain-lain. Reagen ini juga digunakan untuk mengendapkan larutan protein. Pengendapan protein dengan alkaloid reagensia dapat menjadi reaksi balik jika protein dalam bentuk dwi kutub pada suasana asam. H

H protein

C

+ H+

COO

protein

NH3

C

COOH

(kation)

NH3

Ion negatif dari alkaloid reagensia akan bergabung dengan protein yang bermuatan positif (kation) sehingga terbentuk garam proteinat yang mengendap. Misalnya protein dalam bentuk sebagai kation ini dengan asam pikrat (berwarna kuning), terbentuk endapan protein pikrat. OH

H protein

C

O2N

COO

OH

H

NO2

+

protein

NH3 NO2

C

O2N

COOH

NO2

+

NH3 NO2

Warna endapan pada umumnya tergantung dari warna alkaloid reagensia yang ditambahkan. Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, isilah dengan sampel protein. Tabung 1 tambahkan larutan asam pikrat, tabung 2 tambah asam trikloroasetat, tabung 3 tambah asam fosfomolibdat, dan tabung 4 tambah asam fosfowolframat. Perhatikan endapan-endapan yang terbentuk. Catat dalam laporan. Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Bersifat sebagai apakah protein dalam reaksi ini? Alkaloid reagensia bersifat sebagai apa? b. Tulislah masing-masing reaksi kimianya dan apakah warna endapan yang terjadi? c. Apakah alkaloid reagensia itu? Sebutkan 4 contohnya Pengendapan dengan garam-garam logam berat Larutan garam-garam logam berat, misalnya feriklorida, kuprisulfat, merkuriklorida, dan plumboasetat dapat dipakai untuk mengendapkan larutan protein. Pengendapan ini dapat berlangsung dengan baik apabila larutan protein dalam bentuk dwi kutub pada suasana alkalis. H protein

H

C

COO

+ OH-

protein

NH3

C

COO

(anion)

NH2

Kation dari logam-logam berat dengan protein yang bersifat sebagai anion akan bergabung membentuk garam proteinat yang mengendap. Warna dari endapan juga ditentukan oleh warna garam-garam logam berat yang ditambahkan. Misalkan yang dipakai untuk mengendapkan larutan kuprisulfat atau larutan feriklorida, maka reaksi-reaksi kimianya adalah sebagai berikut H

2

protein

C

H

COOH

+ Cu2+

protein

H protein

C NH2

Cu

COO

NH2

NH2

3

C

Cu proteinat (biru)

2

H COOH

+ Fe3+

protein

C NH2

Fe

COO

Fe proteinat (kuning)

3

Percobaan : Sediakan 4 tabung reaksi, isilah dengan sampel protein. Tabung 1 tambahkan larutan feriklorida, tabung 2 tambahkan kuprisulfat, tabung 3 tambahkan merkuriklorida, dan tabung 4

tambahkan plumboasetat. Amatilah baik-baik warna endapan yang terbentuk. Catat dalam laporan. Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : a. Dalam percobaan ini, protein bersifat sebagai apa dan garam-garam logam berat bersifat sebagai apa? b. Apakah warna masing-masing endapan yang terbentuk? Tulis masing-masing reaksi kimianya! c. Sebutkan garam-garam logam berat lain yang saudara ketahui Percobaan Hehler Larutan protein encer ditambah asam nitrat. Terbentuklah lapisan berwarna putih dari protein yang telah mengalami denaturasi karena pengaruh asam mineral pekat. Percobaan : Sediakan tabung reaksi bersih, isilah dengan sampel protein. Tambahkan dengan asam nitrat, amati perubahan yang terjadi. Catat dalam laporan. Pertanyaan yang harus dijawab dalam laporan resmi : Apa saja yang mempengaruhi terjadinya denaturasi protein? Sebutkan dan jelaskan ikatan-ikatan apa saja dalam molekul protein yang dipengaruhinya! Noda Lemak/Minyak Teteskanlah lemak cair atau minyak pada kertas saring atau kertas biasa yang telah disediakan, kemudian biarkan beberapa waktu. Noda lemak/minyak tersebut sukar hilang. Bandingkan apabila minyak yang digunakan diganti dengan air. Test untuk menguji adanya ikatan rangkap pada lemak tak jenuh Lemak tak jenuh mempunyai ikatan rangkap dalam struktur kimianya. Adanya ikatan rangkap ini dapat ditunjukkan dengan beberapa tetes larutan akuabromata atau larutan kalium permanganat encer. Bila lemak tak jenuh ditambah dengan larutan akuabromata beberapa tetes, maka warna akuabromata tersebut akan dilunturkan. Lemak tak jenuh juga melunturkan warna larutan kalium permanganat encer. Percobaan : Sediakan 2 tabung yang telah diisi lemak cair atau minyak. Pada tabung 1, tambahkan 2-3 tetes larutan akuabromata, dan pada tabung 2, tambahkan 2-3 tetes larutan kalium permanganat. Kocok kedua tabung tersebut, warna akuabromata dan kalium permanganat akan luntur. Catat hasilnya dalam data pengamatan.

Bila lemak tak jenuh tersebut misalnya triolein maka reaksi kimianya digambarkan sebagai berikut : O H2C

O

HC

O

C O

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

C

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

O H2C

O

C

+ 3 Br2 + H2O

H2C

O

HC

O

O

Br

Br

C

(CH2)7 C H Br

C H Br

(CH2)7

CH3

(CH2)7 C H Br

C H Br

(CH2)7

CH3

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

O C O H2C

O

C

O H2C

O

HC

O

C O

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

C

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

O H2C

O

C

+ 3 KMnO4 + H2O

H2C

O

O

OH

OH

C

(CH2)7 C H OH

C H OH

(CH2)7

CH3

(CH2)7 C H OH

C H OH

(CH2)7

CH3

(CH2)7 C H

C H

(CH2)7

CH3

O HC

O

C O

H2C

O

C

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 3 IDENTIFIKASI SENYAWA PROTEIN dan LEMAK 1. Tes Ninhidrin

NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

2. Tes Biuret

NO

3. Tes Xanthoprotein

NO

4. Tes Molisch

NO

5. Tes Hopkin’s Cole

NO

6. Tes Sulfida

NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

HASIL

PARAF

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

7. Tes Presipitasi dengan Alkaloid

NO

PERLAKUAN

8. Tes Presipitasi dengan Garam Logam Berat

NO

9. Tes Hehler

NO

10. Tes Noda Lemak

NO

PERLAKUAN

HASIL

PARAF

11. Tes Ikatan Rangkap NO PERLAKUAN

HASIL

PARAF

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 4 KADAR PROTEIN TUJUAN PERCOBAAN Penetapan kadar protein dengan metoda Mikro Kjeldahl TEORI SINGKAT Protein adalah senyawa organik makromolekul yang susunannya sangat komplek terdiri dari beberapa asam-asam alfa amino karboksilat yang satu dengan yang lain terikat melalui ikatan peptida. Secara umum rumus asam amino sebagai berikut : H O

gugus amino

H 2N

C

gugus karboksil

C OH

R

gugus rantai cabang

Adapun yang dimaksud ikatan peptida adalah ikatan amida asam, yaitu ikatan yang terdiri dari gugus karboksilat dari asam amino satu dengan gugus asam amino dari asam amino lainnya. Karena protein tersusun oleh polimer asam-asam alfa amino, maka unsur penyusun dari protein sama seperti unsur penyusun dari asam amino, yaitu C, H, O, dan N disamping juga sering ditemukan S, P, dan logam lainnya. Rumus umum protein dapat disajikan sebagai berikut R2

R1 HN

C H

C

N

O

H

CH

R3 C

N

O

H

CH

R4 C

N

O

H

CH

R5 C

N

O

H

CH

C O

struktur umum protein

Dilihat dari struktur asam amino ada 2 gugus fungsional yang penting, yaitu gugus karboksilat yang bersifat asam dan gugus amino yang bersifat basa, sehingga asam amino bersifat sebagai senyawa amfolit, artinya asam-asam amino dapat bersifat sebagai asam maupun sebagai basa tergantung dari lingkungannya. NH2 H

C

NH3

COOH

R

asam amino yang tidak mengion

H

C

COO

R

asam amino dipolar (ion zwitter)

ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Erlenmeyer 6. Set distilasi 2. Gelas beker 7. Pipet volume 3. Gelas ukur 8. Pipet paseur 4. Labu Kjeldahl 5. Corong BAHAN 1. Sampel protein 2. NaOH 3. HCl 4. Indikator pp 5. H2SO4 pekat

6. K2SO4 7. CuSO4 8. Akuades

PERCOBAAN dan CARA KERJA Protein yang mengandung nitrogen (N) sebanyak 14-18 % jika didestruksi dengan asam sulfat pekat akan menjadi asam amino penyusunnya dan selanjutnya asam amino yang terbentuk akan terurai menjadi CO, CO2, H2O, SO2, dan (NH4)2SO4. Dalam suasana alkalis (NH4)2SO4 yang terbentuk akan berubah menjadi NH4OH, kemudian didistilasi. Hasil distilasi ditangkap dengan asam. Kelebihan asam dititrasi kembali dengan basa (dengan NaOH) Reaksi : NH2 protein

C H

+ H2SO4

COOH

NH3 + H2SO4

CO2 + H2O + NH3 + SO2 (NH4)2SO4

(NH4)2SO4 + NaOH NH3 + HCl Kelebihan HCl :

Na2SO4 + NH3 + 2 H2O NH4Cl

HCl + NaOH

NaCl + H2O

Percobaan :  Timbang saksama sampel sebanyak 3 gram dalam gelas beker.  Tambahkan 20 mL H2SO4 pekat, 5 gram K2SO4, dan 0,5 gram CuSO4. Campur menjadi satu.  Pindahkan campuran ke dalam labu Kjeldahl dan tambahkan beberapa butir batu didih.



Pasang labu Kjeldahl tersebut pada statif dengan kemiringan 45° dan diberi tutup corong pada mulut labu.

Gambar Proses Destruksi Basah

     



Panaskan hati-hati dengan lampu kecil sampai larutan berwarna hitam (sekitar 60 menit) Pemanasan dilanjutkan sampai terbentuk larutan berwarna hijau jernih dan tetap dilanjutkan selama 15 menit sambil digojog. Setelah pemanasan selesai, larutan didinginkan, kemudian secara kuantitatif dipindahkan ke dalam labu alas bulat 500 mL dengan cara membilas dengan akuades. Tambahkan akuades sampai volumenya sekitar ½ dari volume labu. Tambahkan 100 ml larutan NaOH 40% dan beberapa batu didih Lakuka proses distilasi pada larutan tersebut dan tampung destilatnya dalam erlenmeyer yang berisi 50 mL larutan HCl 0,1000 N dan 3 tetes larutan indikator fenolftalein (ujung alonga harus tercelup dalam larutan HCl 0,1000 N tersebut. Periksa alat distilasi, bila ada kebocoran segera betulkan.

nga

Gambar Proses Distilasi



Setelah proses distilasi berlangsung 15-20 menit, teteskan indikator fenolftalein pada tetesan distilat.

 

Jika pada pengecekan dengan indikator pp, tetesan distilat tidak berwarna merah lagi, maka proses distilasi dapat dihetikan. Ambil hasil distilasi, lalu titrasi dengan larutan NaOH 0,1000 N dengan indikator fenolftalein sampai larutan berwarna pink.

Perhitungan : Kadar Protein =

𝑉 × 𝑁 𝐻𝐶𝑙 − 𝑉 × 𝑁 𝑁𝑎𝑂𝐻 × 14 × 6,25 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑝𝑒𝑛𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

x 100%

V = Volume (mL) N = Normalitas (N) 6,25 = kesetaraan protein TABEL KONVERSI dari KADAR NITROGEN (N) MENJADI KADAR PROTEIN BERBAGAI MACAM BAHAN No. Bahan Faktor Konversi 1. Bir, Sirup, biji-bijian, ragi, makanan ternak, buah6,25 buahan, teh, anggur 2. Beras 5,95 3. Roti, gandum, macaroni, bakmi 5,70 4. Kacang Tanah 5,46 5. Kedelai 5,75 6. Kenari 5,18 7. Susu kental manis 6,38

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 4 KADAR PROTEIN Penetapan Kadar Protein VOLUME HCl (mL)

VOLUME NaOH (mL)

PARAF

Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 5 KADAR, BILANGAN ASAM, BILANGAN PENYABUNAN, BILANGAN IODIUM, dan KETENGIKAN LEMAK TUJUAN PERCOBAAN 1. Menentukan kadar lemak 2. Menentukan bilangan asam. Penyabunan, iodium dan peroksida ketengikan suatu lemak / minyak TEORI SINGKAT Lemak atau lipida yang disebut juga lipoid secara kimia dapat didefinisikan suatu senyawa ester antara gliserol dengan asam lemak suku tinggi, dimana ketiga gugus hidroksil dari gliserol diesterkan semua. Secara umum rumus struktur dari lemak dapat disajikan sebagai berikut O H2C

O

HC

O

C O

R1

C

R2

O H2C

O

C

R3

Gambar Rumus Umum Struktur Lemak Adapun lemak dapat diklasifikasikan sebagai berikut : 1. Berdasarkan konsistensinya dapat dibedakan lemak padat, yaitu lemak yang pada suhu kamar konsistensinya padat, dan lemak cair, yaitu lemak yang pada suhu kamar konsistensinya cair atau disebut minyak. 2. Berdasarkan asam lemak penyusunnya lemak dapat dibedakan menjadi : a) Lemak berasam 1, yaitu lemak yang ketiga asam lemak penyusunnya sama. b) Lemak berasam 2, yaitu lemak dengan asam lemak penyusunnya yang sama hanya 2. c) Lemak berasam 3, yaitu lemak yang ketiga asam lemak penyusunnya berbeda. Baik lemak berasam 1, 2 atau 3, asam lemak penyusunnya bisa jenuh atau tidak jenuh. Adapun yang dimaksud asam lemak jenuh yaitu asam lemak yang rantai C nya tidak mempunyai ikatan rangkap, sedangkan asam lemak tidak jenuh adalah asam lemak yang rantai C nya mempunyai ikatan rangkap. Karena itu, ada istilah lemak jenuh dan lemak tidak jenuh, Dinyatakan sebagai lemak jenuh, jika lemak tersebut asam lemak penyusunnya terdiri dari asam lemak jenuh, sedangkan dinyatakan sebagai lemak tidak jenuh, jika asam lemak penyusun lemak tersebut terdapat asam lemak tidak jenuh. Sifat-sifat kimiawi lemak adalah sebagai berikut : 1. Dapat mengalami hidrolisis, yaitu peristiwa lisis / pecahnya lemak menjadi senyawa penyusunnya, yaitu gliserol dan asam lemak. Hidrolisis ini dapat terjadi karena katalis enzim, oksida, maupun basa.

2. Reaksi adisi, dimana reaksi adisi terjadi karena 1, 2 atau ke 3 asam lemak penyusunnya mempunyai ikatan rangkap. Reaksi adisi dapat berlangsung karena hidrogen maupun halogen yaitu klor, brom dan iod (CI2, Br2 atau I2). ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Timbangan analitik 8. Gelas arloji 2. Set alat sokhlet 9. Buret 3. Gelas beker 10. Statif 4. Gelas ukur 11. Set alat refluks 5. Pipet volume 12. Pipet ukur 6. Pipet paseur 7. Erlenmeyer BAHAN 1. Sampel lemak / minyak 2. Petroleum eter 3. Akuades 4. Etanol 5. NaOH 6. Indikator pp 7. HCl

8. Kloroform 9. Pereaksi iodium-bromin 10. KI 11. Natrium tiosulfat 12. Indikator kanji 13. Asam asetat

PERCOBAAN dan CARA KERJA Penetapan Kadar Lemak / Minyak  Timbang sampel lemak / minyak sebanyak 4 gram, tambahkan bahan pembantu (pasir bersih yang telah dipijarkan) campur hingga homogen, lalu bungkus dengan kertas saring  Masukkan campuran tersebut dalam tabung ektraksi soklet.  Pasang tabung soklet pada labu destilasi yang berisi pelarut petroleum eter, diatas soklet yang telah dilengkapi pendingin bola, kemudian alirkan air sebagai pendingin.  Panaskan (proses ekstraksi) selama 4 jam, atur aliran ekstrak tiap 10 menit  Pindahkan ekstrak lemak / minyak dalam petroleum eter ke dalam botol timbang yang telah ditera  Uapkan pelarut (petroleum eter) di atas penangas air  Timbang sampai bobot tetap / konstan. Jika belum konstan, maka lakukan pemanasan dengan oven pada temperatur 100 °C

Gambar Set Alat Sokhlet

Penetapan Bilangan Asam  Timbang sebanyak 20 gram lemak / minyak, lalu masukan ke dalam erlenmeyer.  Tambahkan 50 mL alkohol 95% lalu hubungkan erlenmeyer dengan pendingin bola.  Refluk larutan sampai mendidih, lalu gojog kuat-kuat agar asam lemak bebasnya larut.  Ambil larutan tersebut dan dinginkan, kemudian tambahkan indikator fenolftalein dan titrasi dengan larutan baku NaOH 0,1000 N.  Titik akhir titrasi dinyatakan setelah terjadi warna pink Perhitungan : Bilangan asam adalah bilangan yang menunjukan banyaknya mg NaOH / KOH yang dapat menetralkan 1 gram lemak / minyak. massa lemak / minyak (mg) =

𝑉 × 𝑁 1

x BM NaOH

Karena sampel lemak/minyak adalah 20 gram, maka bilangan asam lemak / minyak tersebut dinyatakan sebanyak = x mg/20 gram Penetapan Bilangan Penyabunan  Timbang sebanyak 3 gram lemak / minyak, lalu masukkan ke dalam erlenmeyer  Tambahkan 100 mL larutan NaOH 0,1000 N dalam alkohol, lalu hubungkan erlenmeyer dengan pendingin bola.

 

Refluk larutan sampai mendidih, kemudian dinginkan. Tambahkan 3 tetes indikator fenolftalein, lalu titrasi dengan larutan HCl 0,1000 N sampai warna merah jambu tepat hilang

Perhitungan : Bilangan penyabunan adalah bilangan yang menunjukkan banyaknya mg NaOH / KOH yang dapat menyabunkan 1 gram lemak / minyak. massa NaOH (mg) =

𝑁 × 𝑁 𝑁𝑎𝑂𝐻 − 𝑉 × 𝑁 𝐻𝐶𝑙 1

x BM NaOH

Karena sampel lemak/minyak adalah 3 gram, maka bilangan penyabunan lemak / minyak tersebut dinyatakan sebanyak = x mg/3 gram Penetapan Bilangan Iodium :  Timbang saksama lemak / minyak sebanyak 0,5 gram, lalu masukkan dalam erlenmeyer.  Tambahkan 10 mL kloroform dan 25 mL pereaksi iodium-bromin, gojog, lalu diamkan di tempat gelap  Tambahkan 10 mL larutan KI 10% dan 100 mL akuades, kemudian titrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1000 N menggunakan indikator larutan kanji.  Titik akhir titrasi tercapai ketika warna biru tepat hilang  Ulangi perobaan diatas pada larutan blangko Perhitungan : Bilangan iodium adalah bilangan yang menunjukan banyaknya iodium yang dapat diadisi oleh 100 gram lemak tidak jenuh Bilangan iodium =

(𝑉 𝑡𝑖𝑜𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑔𝑘𝑜 − 𝑉 𝑡𝑖𝑜𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

x N tiosulfat x 12,691

Penetapan Tingkat Ketengikan (Rancidity)  Timbang saksama 5 gram sampel lemak / minyak, lalu masukkan ke dalam erlenmeyer bertutup.  Tambahkan 30 mL larutan campuran asam asetat-kloroform (perbandingan volume 3:2). Goyangkan sampai sampel terlarut semua.  Tambahkan 0,5 mL larutan jenuh KI dan diamkan selama 1 menit sambil digoyang-goyang  Tambahkan 30 mL akuades ke dalam larutan  Titrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1000 N dengan menggunakan indikator larutan kanji, sampai warna larutan biru tepat hilang.

Perhitungan : Bilangan peroksida adalah banyaknya miligram ekivalen dari pertoksida dalam setiap 1000 gram sampel lemak / minyak BIlangan peroksida =

𝑚𝐿 𝑡𝑖𝑜𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡 × 𝑁 𝑡𝑖𝑜𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡 × 1000 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔𝑟𝑎𝑚 )

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 5 KADAR, BILANGAN ASAM, BILANGAN PENYABUNAN, BILANGAN IODIUM, dan KETENGIKAN LEMAK 1. Penetapan Kadar Lemak / Minyak BERAT SAMPEL VOLUME (gram) PELARUT (mL)

BOBOT AKHIR

PARAF

BOBOT AKHIR

PARAF

Perhitungan :

2. Penetapan Bilangan Asam BERAT SAMPEL VOLUME (gram) PELARUT (mL)

Perhitungan :

3. Penetapan Bilangan Penyabunan BERAT SAMPEL VOLUME (gram) PELARUT (mL)

BOBOT AKHIR

PARAF

BOBOT AKHIR

PARAF

Perhitungan :

4. Penetapan Bilangan Iodium BERAT SAMPEL VOLUME (gram) PELARUT (mL)

Perhitungan :

5. Penetapan Tingkat Ketengikan BERAT SAMPEL VOLUME (gram) PELARUT (mL)

BOBOT AKHIR

PARAF

Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 6 KADAR VITAMIN C TUJUAN PERCOBAAN Menetapkan kadar vitamin C dalam buah jeruk. TEORI SINGKAT Vitamin C atau disebut juga asam askorbat adalah salah satu vitamin yang dapat larut dalam air, mempunyai rumus molekul C6H8O6 dengan rumus struktur disajikan sebagai berikut : OH

OH

OH HOH2C

C O

O

H

Gambar Struktur vitamin C / asam askorbat Vitamin C mempunyai kristal berwarna putih, bentuk lempeng atau jarum, tidak berbau, rasa asam, titik lebur 190 °C sampai dengan 192 °C, larut dalam air, tidak larut dalam kloroform maupun eter. Vitamin C merupakan senyawa reduktor, peristiwa reduktornya disebabkan dengan lepasnya 2 atom hidrogen pada atom C nomor 2 dan nomor 3 membentuk asam dehidroaskorbat. Sifat reduktornya dapat ditunjukkan dengan pereaksi Fehling, Benedict, dan biru metilena. Sifat reduksinya dapat merubah asam dehidroaskorbat menjadi asam askorbat kembali. Reaksinya dapat disajikan sebagai berikut : OH

OH

HOH2C

+ 2H

C O H

Asam askorbat

O

─2H

OH

O

OH HOH2C

C O

O

O

H

Asam dehidroaskorbat

Secara biokimia fungsi vitamin C belum diketahui secara jelas, tetapi ada yang melaporkan bahwa vitamin C dapat berfungsi sebagai kofaktor dalam proses hidrolisis enzimatik residu prolin pada kolagen membentuk hidroksi prolin. Peranan lain dalam tubuh sebagai antioksidan dan aktivator beberapa enzim pemecah zat putih telur dan perekat antar sel. Untuk mengetahui kadar atau kemurnian vitamin C dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu cara volumetric dengan metoda iodimetri cara Yacop dan cara 2,6 diklorofenol indofenol dan dengan cara spektrofotometris.

ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Labu takar 2. Pipet volume 3. Pipet paseur 4. Buret 5. Erlenmeyer 6. Gelas ukur 7. Gelas beker BAHAN 1. Sampel buah jeruk 2. H2SO4 3. Larutan iodium 4. Kanji 5. Akuades PERCOBAAN dan CARA KERJA Penetapan kadar vitamin C dilakukan dengan metode iodimetri cara Yacop. Dasar reaksinya adalah sebagai berikut. I2 + H2O

2 HI + On OH

OH

O

OH HOH2C

+ On

C O H

O

OH HOH2C

C O

O

O

H

Asam askorbat Asam dehidroaskorbat Cara kerja :  Timbang saksama sebanyak 200-300 gram sampel jeruk kemudian diblender sampai halus.  Ambil sebanyak 25 gram sampel jeruk yang telah halus tersebut, laku tambahkan dengan 75 mL aqua dest, gojog kuat-kuat, kemudian disentrifuge atau disaring.  Ambil filtrate, lalu masukkan ke dalam labu takar 100 mL dan tambahkan akuades hingga batas volume (100 mL).  Ambil dengan pipet volume sejumlah 25 ml filtrat yang diperoleh dari tahap sebelumnya, lalu tambahkan 75 mL akuades dan 25 mL larutan H2SO4 2N, kemudian dititrasi dengan larutan baku iodium 0,1000 N dengan menggunakan indikator larutan kanji.  Nilai kesetaraan : tiap mL larutan iodium 0,1000 N setara dengan 8,8 mg vitamin C

Perhitungan : 1 ml 0,1000 N Iodium = 8,8 mg vitamin C 𝑉 𝑁 𝑥 𝑚𝑔 𝑣𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛 𝐶 × = 1 0,1 8,8 𝑚𝑔 𝑣𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛 𝐶 =

𝑉 𝑁 × × 8,8 𝑚𝑔 1 0,1

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 6 KADAR VITAMIN C Penetapan Kadar Vitamin C VOLUME SAMPEL (mL)

VOLUME IODIUM (mL)

PARAF

Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 7 GARAM BERIODIUM TUJUAN PERCOBAAN Penetapan kadar Kalium Iodat dalam garam beriodium TEORI SINGKAT Iodium adalah salah satu mineral yang merupakan unsur utama dalam pembentukan hormon tiroksin dan triiodotironin yang berperan dalam beberapa proses metabolisme dalam tubuh. Untuk keperluan pembentukan hormon tersebut diperlukan kira-kira 100 mcg tiap hari. Adapun bahan makanan yang banyak mengandung iodium adalah kebanyakan berasal dari laut, seperti ikan laut, disamping daging dan sayur-sayuran. Akibat defisiensi iodium dapat menyebabkan beberapa penyakit, diantaranya adalah kritinisme, yaitu terlambatnya dalam pertumbuhan dan perkembangan mental, pembesaran kelenjar tiroid, penebalan pembuluh darah, dan sebagainya. Salah satu usaha untuk menanggulangi gangguan akibat kekurangan iodium yang murah adalah iodinasi garam dapur (mengkonsumsi garam beriodium). ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Gelas beker 2. Gelas ukur 3. Pipet volume 4. Pipet paseur 5. Labu takar 6. Gelas arloji 7. Buret 8. Erlenmeyer BAHAN 1. Garam 2. Akuades 3. HCl 4. KI PERCOBAAN dan CARA KERJA 1. Pembuatan Larutan Baku Na2S2O3 0,0050 N Pipet 1 ml larutan Na2S2O3 0,1000 N, masukan ke dalam labu takar 500 mL, lalu tambahkan akuades hingga batas volume. Gojog sampai tercampur sempurna.

2. Pembakuan Larutan Baku Na2S2O3 0,0050 N  Timbang seksama sebanyak 30 mg K2Cr2O7 yang telah dikeringkan pada suhu 120 °C selama 4 jam.  Masukkan ke dalam labu takar 500 mL bersumbat kaca, lalu gojog kuat.  Kemudian tambahkan 3 gram kalium iodida (KI), 8 gram Na2CO3, dan 5 mL HCl, lalu tambahkan akuades hingga batas volume.  Simpan larutan di tempat gelap selama 10 menit. Kemudian ambil sebanyak 20 mL dari larutan tersebut.  Tambahkan indikator kanji, lalu titrasi dengan larutan baku Na2S2O3.  Tiap mL larutan Na2S2O3 0,1000 N setara dengan 4,9030 mg K2Cr2O7 Perhitungan : 1 mL Na2S2O3 0,1000 N = 4,9030 mg K2Cr2O7 𝑉 𝑁 30 × = 1 0,1000 4,9030 𝑁=

30 1 × × 0,1000 4,9030 𝑉

3. Penetapan Garam Kalium Iodat dalam Garam Beriodium  Timbang seksama 25 gram sampel garam beriodium, lalu larutkan dengan akuadest dalam erlenmeyer bersumbat kaca.  Tambahkan 2 mL HCl dan 0,1 gram kristal KI, lalu gojog.  Kemudian titrasi dengan larutan baku Na2S2O3 0,0050 N menggunakan indikator kanji sampai warna biru larutan tepat hilang.  Tiap ml Na2S2O3 0,1000 N setara dengan 3,567 mg KIO3 Dasar reaksi KIO3 + 5 KI + 6 HCl 3 I2 + KCl + 3H2O I2 yang dibebaskan dititrasi dengan Na2S2O3 3 I2 + 6 Na2S2O3

6 NaI + 3 Na2S4O6

Perhitungan : 1 mL Na2S2O3 0,1000 N = 3,567 mg KIO3 𝑉 𝑁 𝑥 𝑚𝑔 𝐾𝐼𝑂3 × = 1 0,1000 3,567 𝑚𝑔 𝑉

𝑁

𝑥 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝐾𝐼𝑂3 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = 1 × 0,1000 × 3,567 𝑚𝑔

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 7 GARAM BERIODIUM 1. Pembuatan Larutan Baku Na2S2O3 0,0050 N Perhitungan :

2. Pembakuan Na2S2O3 0,0050 N NO BERAT K2Cr2O7 (mg)

VOLUME Na2S2O3 (mL)

PARAF

3. Penetapan Garam Kalium Iodat dalam Garam Beriodium NO BERAT SAMPEL (gram) VOLUME Na2S2O3 (mL)

PARAF

Perhitungan :

Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 8 KROMATOGRAFI TUJUAN PERCOBAAN 1. Melakukan pemisahan dan identifikasi suatu campuran komponen senyawa kimia dengan metode kromatografi 2. Identifikasi beberapa senyawa organik TEORI SINGKAT Analisis suatu bahan kimia baik kualitatif maupun kuantitatif akan memberikan hasil yang baik jika hasil pengukuran sesuai dengan sifat-sifat spesifik dari senyawa yang terukur untuk mendapatkan hasil yang tidak ragu, maka bahan yang diperiksa harus bebas atau dipisahkan dari senyawa pengganggu. Ada beberapa cara pemisahan suatu komponen senyawa kimia. Diantara cara-cara pemisahan yang dianggap lebih representative dan biasa digunakan adalah metode kromatografi. Kromatografi adalah suatu teknik atau metode pemisahan suatu campuran yang terdiri dari beberapa komponen senyawa kimia dengan menggunakan sistem distribusi secara kontinyu di antara dua fasa, yaitu fasa bergerak dan fasa diam. Fasa diam (stationary phase) biasanya berupa zat padat atau zat cair. Sedang fasa gerak (mobile phase) biasanya berupa zat cair atau gas. Metoda pemisahan dilakukan berdasarkan adanya dukungan beberapa perbedaan sifat fisik dari senyawa yang dipisahkan. Sifat fisik yang dimaksud adalah : 1. Adanya kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam zat cair 2. Adanya kecenderungan suatu molekul untuk teradsorbsi pada permukaan zat padat yang halus dengan permukaan yang luas atau zat cair airnya 3. Adanya kecenderungan suatu molekul suatu senyawa kimia untuk masuk dalam fasa uap Dari sifat-sifat tersebut dapat dikatakan bahwa tidak ada suatu senyawa yang mempunyai sifat fisik yang persis sama. Atas dasar sifat tersebut maka suatu campuran yang terdiri dari beberapa komponen senyawa kimia dapat dipisahkan dengan kromatografi berdasarkan sifat fisiknya. Pembagian Kromatografi Berdasarkan perbedaan fasa diam dan fasa gerak yang dipakai, metoda pemisahan dengan kromatografi dapat digolongkan : 1. Fasa diam zat padat dan fasa gerak zat cair Termasuk dalam golongan ini adalah kromatografi lapis tipis / KLT / TLC dan kromatografi kolom 2. Fase diam zat padat dan fasa gerak gas Termasuk dalam golongan ini adalah kromatografi gas padat 3. Fasa diam zat cair dan fasa gerak zat cair Termasuk dalam golongan ini adalah kromatografi kertas, fasa diamnyazat cair dan selulosa dari kertas sebagai penyangga/penyokong

4. Fasa diam zat cair dan fasa gerak gas Termasuk dalam golongan ini adalah kromatografi gas cair dan kromatografi kolom kapiler Untuk mengisi acara praktikum di sini yang dibicarakan dan yang dilakukan adalah kromatografi kertas. Mengenai metoda kromatografi yang lain yang berdasarkan bentuk fasa diam dan fasa gerak serta metoda kromatografi berdasarkan prosesnya dapat dibaca pada bagian lain dari buku kuliah. Adapun dasar metoda pemisahan secara kromatografi yang dilakukan adalah perbedaan sifat fisik dari suatu senyawa perbedaan kemampuan adsorpsi fasa diam terhadap senyawa yang dipisahkan, sehingga akan mempengaruhi perbedaan jarak perambatan dari senyawa yang terbawa oleh fasa gerak yang menyebabkan komponen senyawa dalam campuran dapat terpisah. Dengan membandingkan harga Rf terukur dari senyawa yang dipisahkan dengan harga Rf dari senyawa pembanding atau membandingkan harga Rf dalam literatur atau dengan menggunakan reaksi kimia maka akan dapat diidentifikasi senyawa hasil pemisahan. Harga Rf (Retardantion factor) dapat dihitung dengan rumus : 𝑅𝑓 =

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢𝑕 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢𝑕 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘

ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Chamber / bejana kedap udara 2. Pipa kapiler 3. Pipet tetes 4. Gelas ukur 5. Gelas beker BAHAN 1. Kertas whatman no. 1 2. Glukosa 3. Fruktosa 4. Sakarosa 5. Xilosa 6. Aseton 7. Akuades

PERCOBAAN dan CARA KERJA  Siapkan kertas whatman no.1, kemudian diaktivasi dengan cara dimasukkan ke dalam oven pada temperatur 100 °C selama 30 menit.  Siapkan eluen/fasa gerak dengan mencampur aseton dan air dengan perbandingan volume yaitu 9 : 1, lalu masukkan ke dalam chamber dengan ketinggian ±2 cm dari permukaan.  Siapkan sampel campuran glukosa, fruktosa, sakarosa, xilosa dengan volume sama banyak, kemudian larutkan dalam air dengan konsentrasi 1%.  Siapkan larutan pembanding masing-masing glukosa, fruktosa, sakarosa, dan xilosa dengan konsentrasi 1%  Kertas whatman yang telah diaktivasi diberi tanda garis dengan pensil untuk penotolan sampel dan pembanding. Setelah sampel dan pembanding ditotolkan kertas dimasukkan ke chamber yang berisi eluen. Biarkan eluen merambat sampai kira-kira 15 cm permukaan (dapat diberi tanda pensil lebih dahulu). Setelah itu ambil kertas yang ada dalam chamber, keringkan, dan lihat noda yang terbentuk.

Gambar Metode Kromatografi

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 8 KROMATOGRAFI Penetapan Rf JENIS LARUTAN SAMPEL

JARAK SPOT AWAL ke GARIS AKHIR (cm)

JARAK SPOT AKHIR ke GARIS AKHIR (cm)

PARAF

Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 9 ANALISA SPEKTROFOTOMETRI TUJUAN PERCOBAAN 1. Menetapkan kadar protein dalam biji kedelai dengan metoda Lowry 2. Menetapkan kadar glukosa dengan metoda spektrofotometer TEORI SINGKAT Dalam melakukan analisa suatu senyawa kadang-kadang kita dihadapkan suatu kesulitan karena bahan yang akan dianalisa jumlahnya sangat kecil. Hal ini disebabkan sampel akan dianalisa biasanya dalam bentuk campuran sehingga diperlukan pemisahan terlebih dahulu. Dengan demikian jumlah sampel yang sangat sedikit tidak mungkin dikerjakan analisa secara konvensional, misalnya cara volumetri atau gravimetri. Untuk mengatasi hal ini kita bisamelakukan analisa secara instrumental. Ada beberapa keuntungan metode secara instrumental diantaranya adalah jumlah sampel dan bahan kimia yang dibutuhkan sangat sedikit, waktu yang diperlukan relatif lebih singkat, serta dapat memberikan informasi yang spesifik. Namun alat-alat semacam ini masih tergolong mahal, memerlukan perwatan khusus dan tenaga yang terdidik. Salah satu alat instrumentasi yang digunakan yang dapat memberikan hasil yang representatif adalah spektrofotometri sinar ultra violet dan sinar tampak. Metode analisa spektrofotometri sinar uv dan sinar tampak berdasarkan pengukuran sinar yang diabsorpsi di daerah ʎ : 190 – 800 nm. Daerah ʎ : 190 – 380 nm adalah daerah uv dan ʎ : 380 – 800 nm masuk daerah resapan sinar tampak. Kedua daerah resapan tersebut disebut spektrum elektromagnetik. Resapan di kedua daerah tersebut sangat kuat sehingga ada beberapa senyawa yang dapat ditetapkan di keduanya sampai sejumlah ppm. Dasar Analisa Analisa spektrofotometri resapan sinar uv dan tampak berdasarkan terjadinya perpindahan energi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi. Hukum Lambert Beer Dalam analisa secara spektrofotometri dengan menggunakan resapan sinar ada 2 hukum, yang erat hubungannya dengan pengukuran. Jika suatu sinar monokromatik dilewatkan melalui media maka intensitas sinar tersebut akan berkurang karena sebagian intensitas sinar tersebut diserap, dihamburkan dan dipantulkan.

Io Ir

Ia

It

Io : sinar datang It : sinar yang diteruskan Ia : sinar yang diabsorpsi Ir : sinar yang dipantulkan

Misalkan Io adalah sinar datang, Ia adalah sinar yang diserap, It adalah sinar yang diteruskan dan Ir adalah sinar yang dipantulkan maka; Io = Ia + It + Ir Jika sinar datang dibuat tegak lurus dengan media maka intensitas sinar yang dipantulkan dapat diabaikan sehingga, Io = Ia + It Hukum Lambert menyatakan : Bila suatu sinar monokromatis dilewatkan melalui media transparan, maka sinar yang diteruskan akan mengalami penurunan intensitas sebanding dengan tebal media transparan tersebut dan intensitas sinar mula-mula. Penurunan intensitas tersebut sebanding dengan pangkat penambahan media. Jika suatu sinar monokromatis dilewatkan media setebal db maka intensitas cahaya tersebut akan menurun sebesar dI berbanding langsung dengan sinar mula-mula I -dI = I db

−

𝑑𝐼

=I

𝑑𝐵

Bila dimasukkan dalam suatu tetapan spesifik k maka,

−

𝑑𝐼 𝑑𝐵

=kI

1/k dI/I = - db Bila diintegralkan maka, -∫ db =

-b =

1 𝑘

1

𝑑𝐼

𝑘

𝐼

(ln I – ln Io) + C

Bila b = 0, maka -b =

1 𝑘

(In I – In Io)

-k b = In I – In Io k b = In

𝐼𝑜 𝐼

1 𝑘

×

𝑑𝐼 𝐼

= ─ db

Bila ln diubah menjadi logaritma dengan bilangan dasar 10, maka 10 log 2,303 𝑘𝑏 2,303

= log

karena

𝐼𝑜 𝐼

𝑘 2,303

= a

a adalah absorptivitas / koefisien molekuler, sehingga persamaan di atas menjadi, a b = log

𝐼𝑜 𝐼

Kemudian Beer menerapkan rumus ini dalam larutan encer. Hukum Beer Ada hubungan antara jumlah sinar yang diabsorpsi dengan konsentrasi larutan. log

𝐼𝑜 𝐼

=aC

sehingga rumus tersebut menjadi hukum Lambert Beer : log

𝐼𝑜 𝐼

=abc

A = E = a.b.c T=

𝐼𝑡 𝐼𝑜

A = log

1 𝑇

A : Absorbance E : Extension b : tebal larutan c : konsentrasi larutan T : Transmitance a : absorpsivitas yang tidak tergantung dari konsentrasi larutan dan intensitas sinar yang melewati. Absorpsivitas tergantung dari pelarut, struktur molekul, λ yang mengenai senyawa tersebut. Jika b dalam cm, dan c dalam gram/liter. Aplikasi spektrofotometri resapan sinar ultra violet dan sinar tampak. Seperti telah dikatakan bahwa energi transisi setiap molekul yang diperlukan adalah berlainan menurut strukturnya, dengan demikian spektrum absorpsi yang terjadi juga tidak ada yang sama untuk masing-masing molekul. Pada spektrofotometri resapan sinar ultra violet dan

sinar tampak transisi yang terjadi adalah transisi elektronik sehingga transisi hanya terjadi pada gugusan spesifik pada molekul. Gugus tersebut dinamakan gugus kromofor. Atas dasar tersebut maka spektrofotometer absorpsi dapat digunakan untuk analisa kualitatif atau identifikasi. Oleh Lambert – Beer dinyatakan bahwa ada hubungan antara kadar suatu senyawa dengan besarnya resapan sinar pada panjang gelombang tertentu, sehingga spektrum absorpsi dapat digunakan untuk analisa kuantitatif.

Gugus Kromofor

karbonil

Tabel Gugus Kromofor Struktur Contoh λ maks (nm) R─CH=CH─R etilena 165 193 R C R1 aseton 188 279

Transisi π → π* π → π* n → π*

O

formil

R

C

H

asetaldehid

290

n → π*

NH2

asetamida

<208

n → π*

O

amida

R

C O

Dalam melakukan analisa dengan menggunakan resapan sinar ultra violet yang mempunyai panjang gelombang pendek dengan tenaga besar yang memindahkan energi dari sinar ultra violet ke kromofor yang ada pada setiap senyawa tidak begitu sulit. Tetapi pada suatu saat kita dihadapkan pada kesulitan alat yang tidak dapat untuk menganalisa senyawa yang menggunakan sumber radiasi ultra violet, tetapi hanya dapat menggunakan sumber radiasi sinar tampak, maka senyawa tersebut harus diubah lebih dulu menjadi senyawa yang peka terhadap sumber radiasi sinar tampak, sehingga dengan mudah dapat mengadsorpsi sumber radiasi sinar tampak tersebut. Untuk mengubah senyawa menjadi peka terhadap sumber radiasi sinar tampak ada beberapa cara antara lain : 1. Mereaksikan secara koupling antara kromofor yang ada dengan auksokrom sehingga terjadi pergeseran panjang gelombang ke arah sinar tampak. 2. Mereaksikan dengan logam yang dapat membentuk senyawa komplek yang berwarna. 3. Memberikan tenaga yang cukup dengan cara pemanasan, pemberian basa atau asam. 4. Dengan oksidasi atau reduksi dan lain sebagainya. Petunjuk pemakaian Spektrofotometer Spectronic 20 1. Putar tombol (10) tombol yang ada disebelah kiri ke kanan untuk mengaktifkan alat. Biarkan selama kurang lebih 15 menit untuk memanaskan alat. Atur tombol sampai menunjukkan angka 0 pada penunjuk abasorbance (A) dan 100 pada % transmittance (T) 2. Putar tombol (8) tombol yang ada di sebelah atas alat untuk memilih panjang gelombang yang diinginkan (maksimum)

3. Masukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 mL akuadest ke dalam tempat sampel (sebelum masukkan kuvet, pastikan bahwa dinding kuvet bagian luar dalam keadaan kering dengan menggunakan kertas tisu) tutup penutup tempat sample. 4. Putar tombol (9) tombol yang disebelah kanan sehingga % T menunjuk angka 100 atau A menunjuk angka 0 5. Angkat kuvet yang berisi akuadest dari tempat sample, ganti isinya dengan larutan blangko, baca resapannya. 6. Ganti larutan blangko dalam kuvet dengan larutan standar atau larutan uji. Baca resapannya. Pada umumnya senyawa hasil reaksi tersebut tidak mantap warnanya sehingga akan mengalami perubahan resapan maksimum selama waktu tertentu. Oleh karena itu untuk operasionalnya harus dicari periode waktu yang dapat menunjukkan resapan maksimum yang stabil dari hasil reaksi tersebut (operating time). Spekrofotometer Spectronic-20 merupakan spektrofotometer yang sangat popular dan sangat sering digunakan dalam pengukuran sampel yang menggunakan spektrofotometer. Seiring dengan pergantian tahun, penggunaan spekrofotometer Spectronic-20 mulai tergantikan dengan spektrofotometer yang lebih canggih dan umumnya merupakan spektrofotometer digital. Salah satu contoh pengganti spekrofotometer Spectronic-20 adalah spektrofotometer Genesys UV-20.

Gambar Spektrofotometer Genesys UV-20 ALAT dan BAHAN YANG DIGUNAKAN ALAT 1. Spektrofotometer 5. Pipet paseur 2. Kuvet 6. Gelas ukur 3. Pipet volume 7. Gelas beker 4. Gelas arloji 5. Pipet ukur BAHAN 1. Na2CO3 2. CuSO4 3. NaOH 4. Na-tartrat 5. Akuades 6. Pereaksi Folin ciocalteu 7. Albumin susu sapi

8. Larutan glukosa 9. Fluoroglusinol 10. HCl 11. Na2HPO4

PERCOBAAN dan CARA KERJA 1. Percobaan penetapan kadar protein dalam biji kedelai dengan metoda Lowry. Dasar : Reaksi warna terbentuk antara protein dengan Cu2+ dalam suasana alkalis kemudian direduksi dengan garam fosfomolibdat. Pereaksi : 1. Pereaksi A : Larutkan 2,0 g Na2CO3 dengan larutan NaOH 0,1 N sampai 100,0 mL. 2. Pereaksi B : Larutkan 50 mg CuSO4 dengan larutan Na tartrat 1% sampai 10,0 mL. 3. Pereaksi C : Campurkan 50 mL pereaksi A dengan 1 mL pereaksi B. Pereaksi ini harus dibuat baru.

4. Pereaksi E : Folin ciocalteu, Pereaksi ini diencerkan sampai kadarnya 0,1 N 5. Larutan Baku : 25,0 mg albumin susu sapi dilarutkan dengan air dalam labu takar 25,0 ml sampai batas. Cara Kerja :  Mencari panjang gelombang maksimum (λ max) protein. Ambil 5 mL larutan baku, lalu tambahkan air hingga volume 10 mL. Dari larutan ini diambil sebanyak 1 mL, tambahkan 5 mL pereaksi C, lalu diamkan selama 5 menit. Tambah 5 mL pereaksi E kemudian diamkan selama 30 menit. Ukur resapannya pada panjang gelombang antara 500 sampai dengan 800nm. Tentukan panjang gelombang yang mempunyai resapan maksimum. Panjang gelombang ini yang nantinya digunakan untuk pengukuran selanjutnya.  Menentukkan stabilitas larutan / operating time. Larutan yang digunakan pada tahap ini sama dengan larutan yang digunakan pada tahap sebelumnya (mencari panjang gelombang maksimum). Resapan diukur pada panjang gelombang maksimum mulai menit pertama hingga menit ke 60 dengan interval yang sama. Tentukan menit yang menunjukkan resapan larutan stabil ini digunakan untuk penetapan selanjutnya.  Pembuatan kurva baku protein Ambil larutan baku masing-masing 1,0 ; 3,0 ; 5,0 ; 7,0 ; 10,0 mL, masing-masing diencerkan dengan air hingga volume 10,0 mL. Kemudian dari larutan ini diambil 1,0 mL ditambah 5,0 mL pereaksi C, lalu digojog, dan diamkan selama 5 menit. Kemudian larutan tersebut ditambah 5,0 mL pereaksi E, lalu digojog. Diamkan selama 30 menit kemudian ukur resapannya pada panjang gelombang maksimum. Buat persamaan garis lurus y = ax + b berdasarkan data yang diperoleh pada tahap ini. Dengan menggunakan persamaan tersebut akan dapat digambarkan hubungan antara kadar larutan dengan resapan.  Penetapan kadar protein dalam kedelai. Kedelai yang telah ditumbuk halus ditimbang sebanyak 100,0 g, kemudian ditambahkan air hingga volume 10,0 mL, gojog dan disentrifuge. Ambil filtratnya sebanyak 1,0 ml, lalu ditambah 5,0 mL pereaksi C, gojog, lalu diamkan selama 5 menit. Kemudian tambah 5,0 mL pereaksi E, lalu diamkan kembali selama 30 menit. Ukur resapannya pada panjang gelombang maksimum. Hitung kadar protein dalam kedelai tersebut dengan memasukkan harga resapan ke dalam persamaan garis lurus yang diperoleh pada tahap sebelumnya. 2. Penetapan Kadar Larutan Glukosa dengan Metoda Spektrofotometer. Dasar Reaksi warna yang terbentuk dari reaksi kondensasi gugus aldehid (dari glukosa) dengan Fluoroglusinol.

Pereaksi : 1. Larutan Fluoroglusinol Timbang saksama 500,0 mg fluoroglusinol, masukkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 15,0 mL akuades, lalu panaskan sambil digojog hingga larut. Pindahkan larutan ke dalam labu takar 50 mL, dan tambahkan HCl pekat secukupnya hingga batas. 2. Larutan Dapar Fosfat (LDP) pH 12,5 Timbang saksama 100,0 mg Na2HPO4 2H2O lalu masukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL, kemudian ditambah NaOH 0,1 N hingga batas. Cara Kerja :  Mencari panjang gelombang maksimum (λ max). Glukosa Timbang saksama 50,0 mg glukosa baku, lalu masukkan ke dalam labu bakar 100 mL dan tambahkan air hingga tanda batas sambil digojog sampai larut. Dari larutan ini diambil sebanyak 5,0 mL kemudian ditambah air hingga 50,0 mL, dan jadilah larutan A. Ambil sebanyak 2,0 mL larutan A, kemudian ditambah 3,0 mL larutan LDP dan 5,0 mL larutan Fluoroglusinol, dan panaskan dalam water bath selama 60 menit hingga terbentuk warna kuning. Ukur resapannya dari panjang gelombang 400 – 520 nm dengan interval yang sama. Tentukan panjang gelombang yang mempunyai resapan maksimum. Panjang gelombang ini dipakai untuk penetapan selanjutnya.  Penentuan Stabilitas larutan / Operating time. Larutan yang digunakan pada tahap ini sama dengan larutan yang digunakan pada tahap sebelumnya (mencari panjang gelombang maksimum). Resapan diukur pada panjang gelombang maksimum mulai menit pertama hingga menit ke 60 dengan interval yang sama. Tentukan menit yang menunjukkan resapan larutan stabil ini digunakan untuk penetapan selanjutnya.  Pembuatan kurva baku glukosa. Timbang saksama 50,0 mg glukosa baku, masukkan ke dalam labu takar 100 mL dan larutkan dengan air hingga batas. Dari larutan ini ambil 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 mL, masingmasing encerkan dengan air hingga volumenya 50,0 mL. Ambil masing-masing dari larutan tersebut sebanyak 2,0 mL dan ditambahkan 3,0 mL larutan dapar fosfat dan 5,0 mL larutan fluoroglusinol, panaskan dalam water bath selama 60 menit hingga warna kuning. Baca masing-masing resapannya pada panjang gelombang maksimum (λ max). Tentukan persamaan garis lurus y = ax + b. Gambar kurva dalam laporan.  Penetapan kadar glukosa Sampel glukosa ditambahkan air hingga volume 10,0 mL, gojog dan disentrifuge. Ambil filtratnya sebanyak 2,0 ml, lalu ditambahkan 3,0 mL larutan dapar fosfat dan 5,0 mL larutan fluoroglusinol, panaskan dalam water bath selama 60 menit hingga warna kuning. Ukur resapannya pada panjang gelombang maksimum. Hitung kadar glukosa dalam sampel tersebut dengan memasukkan harga resapan ke dalam persamaan garis lurus yang diperoleh pada tahap sebelumnya.

DATA PENGAMATAN PERCOBAAN 9 ANALISA SPEKTROFOTOMETRI PENETAPAN KADAR PROTEIN 1. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Larutan ke : ________ Panjang Gelombang (nm)

2. Pengukuran Operating Time Larutan ke : ______________ Waktu (menit)

Absorbansi

PARAF

Panjang Gelombang Maksimum : __________ Absorbansi PARAF

3. Pembuatan Kurva Baku Operating time : ___________ Larutan

Panjang Gelombang Maksimum : ___________ Absorbansi PARAF

Perhitungan :

4. Penentuan Kadar Sampel Operating time : ___________ Sampel

Perhitungan :

Panjang Gelombang Maksimum : ___________ Absorbansi PARAF

PENETAPAN KADAR GLUKOSA 1. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Larutan ke : ________ Panjang Gelombang (nm)

Absorbansi

PARAF

2. Pengukuran Operating Time Larutan ke : ______________ Waktu (menit)

Panjang Gelombang Maksimum : __________ Absorbansi PARAF

3. Pembuatan Kurva Baku Operating time : ___________ Larutan

Panjang Gelombang Maksimum : ___________ Absorbansi PARAF

Perhitungan :

4. Penentuan Kadar Sampel Operating time : ___________ Sampel

Panjang Gelombang Maksimum : ___________ Absorbansi PARAF

Perhitungan :

Catatan :

Paraf Akhir,

……………………

Praktikan,

……………………

PERCOBAAN 10 KADAR PROTEIN (METODE BRADFORD)

A. TUJUAN Penetapan kadar protein dengan metode Bradford. B. DASAR TEORI Protein merupakan komponen utama dalam semua sel hidup, baik tumbuhan maupun hewan. Protein adalah senyawa organik makromolekul yang susunannya sangat komplek terdiri dari beberapa asam amino yang satu dengan yang lain terikat melalui ikatan peptida. Unsur penyusun dari protein sama seperti unsur penyusun dari asam amino, karena protein tersusun oleh polimer asam amino, yaitu Karbon (C), Hidrogen (H), Oksigen (O), dan Nitrogen (N) disamping juga sering ditemukan Belerang (S), Fosfor (P), dan logam lainnya. Pengukuran kadar protein dapat dilakukan secara kolorimetri, salah satunya adalah dengan metode Bradford. Metode Bradford merupakan metode pengukuran konsentrasi protein total yang melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB). CBB akan berikatan dengan protein pada sampel larutan dalam suasana asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Dengan demikian, absorbansinya dapat diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 465-595 nm. C. ALAT 1. Spektrofotometer

12. Gelasukur 100 ml

2. Kuvet

13. Erlenmeyer 100 ml

3. Mikrotube dan rak mikrotube

14. Kertas saring

4. Mikropipet 20-200 µl 5. Mikropipet 100-1000 µl 6. Tip birudankuning 7. Beaker glass 8. Neracaanalitik 9. Vortex 10. Centrifuge 11. Gelas ukur 10 ml

D. BAHAN 1. Reagen Bradford a. CBB b. Etanol 95% c. Asam fosfat 85% d. Aquades 2. Bovine Serum Albumin (BSA) 3. Acetone 10% E. CARA KERJA 1. PembuatanReagen Bradford a. Timbang 10 mg CBB. b. Larutkandalam 5 ml etanol 95%. c. Tambah 10 ml asam fosfat 85%. d. Larutan diencerkan dengan aquades sampai 100 ml. e. Larutan disaring menggunakan kertas saring. 2. Pembuatan Kurva Standar a. Siapkan 6 mikrotube bersih dan kering.

50 %

50 µl BSA + 50 µl Aquades

40 %

40 µl BSA + 60 µl Aquades

30 %

20 %

10 %

0 %

30 µl BSA + 70 µl Aquades

20 µl BSA + 80 µl Aquades

10 µl BSA + 90 µl Aquades

100 µl Aquades

b. Larutan di masing-masing mikrotube tersebut di aduk menggunakan vortex sampai tercampur. c. Siapkan 6 mikrotube yang bersih dan kering kembali. d. Ambil 20 µl darilarutan di masing-masing mikrotube, lalu pindahkan ke mikrotube yang telah disiapkan kembali. e. Tambah 1000 µl reagen Bradford, aduk menggunakan vortex.

f. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang. g. Baca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ = 595 nm). h. Catat hasilnya dan buat kurva regresi (X adalah konsentrasi BSA dan Y adalah absorbansi) 3. Pengujian Sampel 3.1. Blanko Standar a. Ambil 20 µl pelarut yang digunakan. b. Tambah 1000 µl reagen Bradford, aduk menggunakan vortex. c. Inkubasi selama 1 jam padasuhuruang. d. Baca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ = 595 nm). e. Catat hasilnya. 3.2. Sampel Padat a. Timbang 0,0001 mg sampel padat. b. Tambah1000 µl acetone 10%. c. Aduk menggunakan vortex sampai tercampur. d. Putar menggunakan centrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. e. Ambil supernatannya sebanyak 20 µl. f. Tambah 1000 µl reagen Bradford, aduk menggunakan vortex. g. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang. h. Baca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ = 595 nm). i. Catat hasilnya. 3.3. Sampel Cair a. Ambil 20 µl sampel cair. b. Tambah 1000 µl reagen Bradford, aduk menggunakan vortex. c. Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang. d. Baca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ = 595 nm). e. Catat hasilnya.

PERCOBAAN 11 ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) BAKTERI

A. TUJUAN Mengetahui jumlah bakteri total pada sampel dengan metode tuang (pour plate). B. DASAR TEORI Pengujian ALT adalah pengujian yang dilakukan untuk menghitung banyaknya bakteri yang tumbuh dan berkembang pada sampel, juga sebagai acuan yang dapat menentukan kualitas dan keamanan simplisia. Prinsip ALT adalah jika sel bakteri yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, maka sel bakteri tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode pengujian ALT pada makanan dapat dibagi menjadi dua, yaitu metode tuang (pour plate) dan permukaan (surface/spread plate). Media agar yang digunakan pada uji ALT harus disesuaikan dengan jenis bakteri yang akan ditumbuhkan dan dihitung. Inkubasi juga dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akandihitung. Laporan dari hasil menghitung dengan metode ALT menggunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Counts (SPC) sebagai berikut: 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dan dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. Satu deret rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. 4. Jika dari semua seri pengenceran yang dibuat jumlah koloninya kurang dari 30 maka yang dipakai sebagai perhitungan adalah pengenceran yang paling kecil. 5. Jika semua seri pengenceran yang dibuat jumlah koloninya lebih dari 300 maka yang dipakai sebagai perhitungan adalah pengenceran yang paling tinggi. 6. Jika ada 2 tingkat pengenceran yang jumlah koloninya antara 30 dan 300 , maka perlu ditentukan pengenceran mana yang dipakai sebagai perhitungan dengan cara sebagai berikut :

a. Jika hasil bagi antara pengenceran tinggi dan pengenceran rendah kurang atau sama dengan 2 maka kedua pengenceran tersebut dipakai sebagai perhitungan kemudian dirata-rata. b. Jika hasil baginya lebih dari 2 maka yang dipakai sebagai perhitungan adalah pengenceran kecil. 7. Penulisan hasil laporan hanya terdiri dari 2 angka (satu angka satuan dan satu angka desimal), jika angka ketiga sama dengan lima atau lebih maka dibulatkan menjadi satu angka lebih tinggi ke angka kedua. C. ALAT 1. Tabung reaksi

6. Tip biru

2. Rak tabung reaksi

7. Autoclave

3. Cawan petri

8. Inkubator

4. Lampu spirtus

9. Stomacher atau blender

5. Mikropipet 100 - 1000 µl D. BAHAN 1. Sampel bahan padat atau cair 2. Plate Count Agar (PCA) / Nutrient Agar (NA) 3. NaCl 0,85%steril 4. Polybag steril 5. Kapas 6. Plastic wrap E. CARA KERJA 1. Sterilisasi Semua alat gelas dan beberapa bahan yang akan digunakan perlu disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menitdengantekanan 1 atm. 2. Homogenisasi Sampel (Sampel Bahan Padat) a. Timbang 10 gram sampel, masukkan ke dalam polybag steril. b. Tambah 90 ml NaCl 0.85% steril. c. Haluskan sampel tersebut dengan stomacher atau blender dengan kecepatan sedang sampai halus dan homogen. d. Maka didapatlah suspensi sampel dengan pengenceran 10-1 (10 kali).

e. Untuk membuat pengenceran 10-2 dan seterusnya, lihat cara kerja pengenceran sampel. 3. Pengenceran Sampel (Sampel Bahan Cair dan Padat) a. Siapkan sejumlah tabung reaksi steril yang sudah berisi 9 ml NaCl 0,85% steril sebanyak seri pengenceran yang ingin dibuat berjajar pada rak tabung reaksi dantulislah tingkat pengenceran mulai 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan seterusnya sampai yang dikehendaki. b. Isilah tabung pertama dengan sampel (bahan cair) sebanyak 1 ml (sebelumnya sampel diaduk

dahulu),

homogenkan,

maka

didapatlah

suspensi

sampel

dengan

-1

pengenceran10 . (untuk bahan padat lihat homogenisasi sampel padat). c. Dari tabung pengenceran 10-1, pipet 1 ml suspensi sampel, masukkan ketabung dua, homogenkan, maka didapatlah suspensi sampel dengan pengenceran 10-2. d. Dari pengenceran 10-2, pipet 1 ml suspensi sampel, masukkan ketabung tiga, homogenkan, maka didapatlah suspensi sampel dengan pengenceran 10-3. e. Lakukan hasil yang sama sampai didapat pengenceran10-4,10-5, 10-6, dan seterusnya. 4. Penanaman a. Siapkan secara berurutan cawan petri kosong yang telah disterilisasi. b. Berilah tanda pada masing-masing cawan petri dengan tingkat pengenceran yang dimulai dari kontrol, 10-1 sampai pengenceran yang terakhir. c. Untuk cawan petri kontrol, tambahkan 1 ml NaCl 0,85%. d. Untuk cawan petri 10-1, tambahkan 1 ml dari suspensi sampel pengenceran10-1. e. Untuk cawan petri 10-2, tambahkan 1 ml dari suspensi sampel pengenceran 10-2, dan seterusnya hingga pengenceran terakhir) f. Tuang media PCA / NA (±500C) sebanyak 15-20 ml ke dalam masing-masing cawan petri (kontrol hingga pengenceran terakhir) yang telah berisi suspensi sampel. g. Segera goyang atau putar cawan petri sedemikian rupa hingga suspensi sampel tersebar merata. h. Tunggu hingga media memadat. i. Jika media sudah memadat, rekatkan cawan petri dengan plastic wrap. j. Inkubasi dalam posisi terbalik pada suhu 35-370C selama 24-48 jam. k. Jika masa inkubasi telah selesai, amati dan hitung pertumbuhan koloni yang ada.

F. PERHITUNGAN Perhitungan jumlah koloni menganut perhitungan SPC (lihat dasar teori). 1. Hitung jumlah koloni pada kontrol dan tingkat pengenceran yang dibuat. 2. Tentukan tingkat pengenceran yang dipakai dalam perhitungan jumlah bakteri. 3. Masukan angka tersebut ke dalam rumus hitung bakteri sebagai berikut:

Hitung bakteri = A – B x

A = Jumlah koloni sampel B = Jumlah koloni kontrol C = Volume sampel yang ditanam (ml) P = Tingkat pengenceran sampel

1 C

xP

PERCOBAAN 12 UJI DAYA HAMBAT ANTIBAKTERI

A. TUJUAN Mengetahui kemampuan daya hambat antibakteri terhadap suatu bakteri menggunakan metode difusi Kirby Bauer. B. DASAR TEORI Antibakteri merupakan substansi yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme atau senyawa yang mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroorganisme lain. Prinsip pengujian antibakteri adalah penentuan terhadap bakteri penyebab penyakit yang kemungkinan menunjukkan resistensi terhadap suatu antibakteri atau kemampuan suatu antibakteri untuk menghambat pertumbuhan bakteri yang tumbuh in vitro, sehingga dapat dipilih sebagai antibakteri yang berpotensi untuk pengobatan. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk uji daya hambat antibakteri adalah metode difusi Kirby Bauer. Pada metode difusi, disc antibiotik atau blank disc yang telah dibubuhkan sejumlah tertentu antibakteri, ditempatkan pada media yang telah ditanami bakteri yang akan di uji. Tingginya konsentrasi dari antibakteri ditentukan oleh difusi dari disc dan pertumbuhan bakteri uji dihambat penyebarannya sepanjang difusi antibakteri (terbentuk zona jernih disekitar disc). C. ALAT a. Autoclave b. Inkubator c. Lampu spiritus d. Lidi kapas steril e. Cawan petri f. Pinset steril g. Ose jarum steril h. Tabung reaksi steril i. Rak tabung reaksi j. Jangka sorong atau penggaris k. Vortex

D. BAHAN a. Sampel antibakteri b. NaCl 0,85% steril c. Mueller Hinton Agar (MHA) atau Nutrient Agar (NA) d. Strain murni bakteri e. Larutan Standar McFarland 0,5 atau larutan standar yang dibuat dari 0,05 ml BaCl2 1,175% dengan 9,95 ml H2SO4 0,36 N f. Blank disc g. Kapas E. CARA KERJA 1. Sterilisasi Semua alat gelas dan beberapa bahan yang akan digunakan perlu disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. 2. Pembuatan Suspensi Bakteri a. Ambil strain murni bakteri menggunakan jarum ose steril secukupnya. b. Masukkan ke dalam tabung reaksi steril yang telah berisi 3 ml NaCl 0,85% steril. c. Campur menggunakan vortex. d. Sesuaikan kekeruhannya dengan larutan standar. 3. Uji Daya Hambat Antibakteri a. Siapkan media MHA / NA yang sudah ada di cawan petri. b. Celupkan lidi kapas steril ke dalam suspensi bakteri yang sudah distandarisasi kekeruhannya hingga meresap ke dalam kapas, tiriskan lewat dinding tabung. c. Ratakan pada permukaan media MHA / NA hingga merata menutupi seluruh permukaan media. d. Diamkan beberapa saat supaya suspensi bakteri meresap ke dalam agar. e. Ambil satu per satu blank disc menggunakan pinset steril. f. Celupkan dalam sampel antibakteri beberapa saat. g. Letakkan pada permukaan media dengan sedikit ditekan. h. Satu cawan petri dapat diisi beberapa blank disc dengan jarak masing-masing disc kira-kira 15 mm. i. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37oC.

j. Lakukan pengamatan zona hambat dengan mengukur diameter zona blank menggunakan jangka sorong atau penggaris, yaitu daerah terang yang timbul sekitar blank disc dan dinyatakan dalam satuan millimeter (mm). Ukur diameter zona hambat dari tepi yang satu ke tepi yang lain melewati titik pusat cakram difusi.

PERCOBAAN 13 EVALUASI NILAI GIZI PROTEIN DENGAN TIKUS PERCOBAAN (In Vivo) Hewan percobaan harus mamalia, karena hasilnya dapat diterapkan pada manusia Ciri-ciri :     

Menyusui anak Berambut Berdarah panas Mempunyai 4 ruang jantung Melahirkan anak

Jenis Mamalia yang sering digunakan :  Tikus putih → paling sering digunakan  Mencit  Marmot (Guinea pig)  Kelinci  Babi  Hamster  Monyet (primata)  Anjing TIKUS PERCOBAAN Lima macam “basic stock” tikus putih (Albino rat) :

Sifat Albino rat :

Long evans Osborne-Mendel Sherman Sprague Dawley Wistar 1. “Nocturnal” → aktif pada malam hari, tidur pada siang hari 2. Tidak mempunyai kantung empedu 3. Tidak muntah 4. Tidak berhenti tumbuh, setelah 100 hari pertumbuhan berkurang

Kebutuhan gizi tikus ≈ manusia 1. Karbohidrat  pati, gula, selulosa 2. Minyak/lemak : asam lemak esensial (linoleat dan linolenat, arakhidonat dapat disintesis dari asam linoleat). Kekurangan  bersisik, pertumbuhan terhambat, kematian

3. Protein, asam-asam amino esensial 10 macam. 4. Vitamin  larut air, larut lemak 5. Mineral  makro dan mikro elemen 6. Air Pemberian makanan dan minuman ad libitum (berlebih) Bentuk makanan : 1. Tepung 2. Pelet (paling menguntungkan, tidak berdebu, tidak dapat dipisah-pisahkan/dipilih) 3. Semi basah (Ka : 50-60%) tidak boleh tercecer Kondisi lingkungan :  Suhu : 22-24 ºC  RH : 50-60 %  Cahaya : 12 jam terang, 12 jam gelap  Tidak boleh ada jendela terbuka  TED’S (Transient Environmental Disturbance) Penyebab tikus “stress” : - Keluar masuk orang - Tidak terlalu lama - Suara - Polutan - Di dalam kandang (kerja cepat) Parameter untuk mengukur nilai gizi protein : 1. PER (Protein Efficiency Ratio) 2. NPR (Net Protein Ratio) 3. NPU (Net Protein Utilization) 4. TD (True Digestibility) 5. BV (Biological Value) A. PROTEIN EFFICIENCY RATIO (PER)  Umur tikus : 21-28 hari  Tikus jantan  Variasi berat antar tikus maksimal 10 g  Waktu adaptasi : 3-7 hari  Pemberian makanan “ad libitum”  Protein standar : kasein/skim atau laktalbumin  Berat badan tikus diukur 2 hari sekali  Konsumsi ransum diukur tiap hari

 

Masa percobaan : 28 hari Sampel perlu dianalisa : kadar protein, kadar lemak, kadar abu, kadar serat, kadar air Perhitungan 𝐾𝑒𝑛𝑎𝑖𝑘𝑎𝑛 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑏𝑎𝑑𝑎𝑛 (𝑔) 𝑃𝐸𝑅 = 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎𝑕 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑦𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖 (𝑔) Perhitungan PER dihitung untuk tiap ekor tikus kemudian dirata-ratakan untuk tiap grup/kelompok. Jika tidak menggunakan kasein ANRC : 𝐶𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡𝑒𝑑 𝑃𝐸𝑅 =

𝑅𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑃𝐸𝑅 =

𝑃𝐸𝑅 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 × 2,5 𝑃𝐸𝑅 𝑘𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛

𝑃𝐸𝑅 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 × 100% 𝑃𝐸𝑅 𝑘𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛

B. NET PROTEIN RATIO (NPR)  Menghitung jumlah protein yang digunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan (Kelemahan PER  asumsi seluruh protein untuk pertumbuhan)  Ransum dan persyaratan tikus = PER  Lama percobaan : 10 hari  Ada kelompok tikus non protein (diberi ransum tanpa protein) 𝑃𝑒𝑟𝑡𝑎𝑚𝑏𝑎𝑕𝑎𝑛 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑔 𝑃𝑒𝑛𝑢𝑟𝑢𝑛𝑎𝑛 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑔 + (𝑛𝑜𝑛 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛) 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑢𝑗𝑖 𝑁𝑃𝑅 = 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑢𝑗𝑖 (𝑔) Kelompok/Sampel I II III Kedelai mentah Kedelai rebus Kedelai sangrai (A) (B) BB naik BB naik BB naik

IV Non protein Bb turun

V Kasein (standar) bb naik

Misal data setelah 10 hari :

Protein A tikus ke-n Protein B tikus ke-n Protein standar Non Protein (rata-rata)

Pertambahan berat badan (g) 50 60 65 -10

Konsumsi protein (total) 21 22 25 0

NPR

PER

60/21 70/22 75/25

50/21 60/22 65/25

𝑁𝑃𝑅 𝐴 =

50 + (10) 60 = 21 21

C. PENGERTIAN NPU, BV, DC

N yang dikonsumsi

I

Pencernaan

Feses

Ada 2 macam N (nitrogen) pada feses yaitu : 1) Yang berasal dari metabolisme (Fm) 2) Yang berasal dari makanan

N yang diserap Urin

Ada 2 macam N (nitrogen) pada feses yaitu : 1) Yang berasal dari endogen (Ue) 2) Yang berasal dari makanan

N yang ditahan

D. Pelaksanaan Percobaan untuk TD, BV, dan NPU  Percobaan dapat dilakukan selama 10 hari  Ransum AOAC, 1984 Kelompok (minimal 3) :  Sampel  Non protein  Kontrol/kasein

Kadar N diukur pada : Feses dan Urin Feses (Fm) dan Urin (Ue) Feses dan Urin

Feses : 2 hari sekali dikumpulkan, simpan 4ºC, pada hari ke-10 timbang seluruh feses untuk tiap ekor tikus, lalu dioven 110ºC, ditepungkan 60 mesh dan ukur N dengan Kjeldahl Urin : 2 hari sekali ditampung dalam botol yang diberi H2SO4 5-10% supaya membentuk garam ammonium sulfat yang lebih stabil. Pada hari ke 10 hitung volume urin tiap tikus dan kadar N dianalisa dengan Kjeldahl.

E. Daya cerna (DC) Daya Cerna Semu (Apparent Digestibility) 𝐷𝐶 𝑆𝑒𝑚𝑢 =

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝 𝐼−𝐹 = 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖 𝐼

Daya Cerna Sejati (True Digestibility) atau TD 𝐷𝐶 𝑆𝑒𝑗𝑎𝑡𝑖 =

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝 𝐼 − (𝐹 − 𝐹𝑚) = 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖 𝐼

F. Rumus untuk Menghitung TD, BV, dan NPU 𝐵𝑉 =

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑕𝑎𝑛 𝐼 − 𝐹 − 𝐹𝑚 − (𝑈 − 𝑈𝑒) = × 100% 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝 𝐼 − (𝐹 − 𝐹𝑚)

𝑇𝐷 =

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝 𝐼 − (𝐹 − 𝐹𝑚) = × 100% 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖 𝐼

𝑁𝑃𝑈 = I F U Fm Ue

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑕𝑎𝑛 = 𝑇𝐷 × 𝐵𝑉 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖

= Jumlah N yang dikonsumsi dari ransum = Jumlah N feses pada tikus dengan ransum berprotein = Jumlah N urin pada tikus dengan ransum berprotein = Jumlah rata-rata N Feses pada tikus dengan ransum non protein = Jumlah rata-rata N urin pada tikus dengan ransum non protein

G. Nilai Biologis (BV), TD, dan NPU

𝐵𝑉 =

𝑁𝑃𝑈 =

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑕𝑎𝑛 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑕𝑎𝑛 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖

𝑇𝐷 =

𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑒𝑟𝑎𝑝 𝑁 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑘𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑠𝑖

Atau NPU = TD x BV H. Pencatatan Data jika Menggunakan Ransum Semisolid dengan Kadar Air Awal ±60% Kelompok Tikus : ……………………. Hari Tikus I Tikus II Dst. keMA MS Kas KM BB MA MS Kas KM BB 1 30 10 15 50 2 3 Keterangan : MA MS Kas KM BB

= berat makanan awal = berat makanan sisa = Ka Sisa = Konsumsi makanan/ransum = Berat badan

I. Perhitungan Konsumsi Protein Jumlah ransum yang dimakan harus dihitung berdasarkan berat kering (jika ransum diberikan semi solid) Ransum semi solid (kadar air 60 %) Wadah (W)  ditimbang A gram W= bahan makanan (60%)  B gram (besoknya)  W + sisa (ka↓ mis. 30%)  C gram

Daftar Pustaka

1. Anom, 1979, Farmakope Indonesia, edisi III, Departement Kesehatan RI, Jakarta. 2. Anom, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departement Kesehatan RI, Jakarta. 3. Anom, SII (Standar Industri Indonesia), Departement Perindustrian RI, Jakarta. 4. Beelitz HD et al., 2004, Food Chemistry, 3 th edition, Springer, Berlin. 5. Bettlkeheim F and Landesbeng J, 1991, Laboratory Manual for General Organic and Biochemistry, Han Cowet Brace Jovanovich College Publishers. 6. Schirmem RE, 1982, Modern Methods of Pharmaceutical Analysis, Volume I, II, CRC Press., Inc., Florida. 7. Silverstein RM, et al., 1991, Spectrometric Identification of Organic Compounds, 5th edition, John Wiley and Sons. Inc., Singapura. 8. Sudarmaji, Slamet dkk, 1984, Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian, edisi III, Liberty, Yogyakarta. 9. Gunardi, Sumardjo Damin, Buku Petunjuk Praktikum Kimia Kedokteran, Bagian Kimia Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang. 10. Faridah, DN, et al., 2012. Penuntun Praktikum Analisis Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, FATETA, IPB.