Neurobiology Chapter 5

第五章 神经系统的发育 第一节 神经系统的发生 1 神经系统形成的最初过程：原肠胚形成和神经胚形成 发育胚胎的外表内陷形成三个具有不同细胞类型 的 胚 胎 原 基 层 (germ layer) ： 外 层 称 为 外 胚 层 (ectoderm)，中层为中胚层 (mesoderm) 和内层称内胚 层 (endoderm)，此过程称为原肠胚形成(gastrulation)。 中胚层将演变为骨筋和肌肉，神经系统和皮肤则源于 外胚层。原肠胚形成的后期，出现由中胚层内陷形成 的细胞柱—脊索 (notochord)。在称为原凹 (primitive pit) 的表面凹陷处下方前后延伸，原凹延伸形成原纹 (prmitive streak) (图 5-1A)。脊索不仅作为胚胎的中线 标记，它对于上方紧邻的外胚层演变为神经系统和神 经分化都起着极为重要的作用。 脊索输送诱导信号到上方的外胚层，使一群外胚 层细胞分化为神经前体细胞。在称为神经胚形成 (neurolation) 的这一过程中，中线处外胚层增厚为神经 板 (neurolation) 的柱状上皮。神经板外侧缘内收变为 纵贯前后的神经沟 (neural groove)，继而为神经管 (neural tuble) (图 5-1B 和 C)。神经管将发育为整个脑和 脊髓。 神经管的细胞是神经前体细胞 (neural precursor cell)。前体细胞通过分裂产生更多的前体细胞(也称干 细胞)，由前体细胞多次分裂后产生不再分裂的细胞即 为成神经细胞 (neuroblast) 并分化为神经元。神经管 腹侧中线处细胞因紧挨脊索而分化为一条叫底板 (ploot plate) 的上皮样细胞。底板在腹侧中线的位置决 定了神经管的极性，并进而影响神经前体细胞的分化。 图 6-1 哺乳动物的神经胚形成示意图 底板的诱导信号刺激神经管腹侧细胞分化为运动细 左侧为早期发育不同阶段的背面观，右侧方框为左侧 胞。远离腹侧中线处的前体细胞最终产生感觉神经元。 相应阶段胚胎的横切面。 底板的信号分子也将影响轴突的生长方向，对轴突生 长起吸引或排斥作用致使它们交叉或不交叉到对侧。神经管的最背侧边界，即神经沟两侧壁相向会合处出 现第三个前体细胞群，称神经嵴细胞 (neural crest cell) (图 5-1C)。神经嵴细胞沿特定途径从神经管向外迁 移(图 6-2)。在不同的迁移途径受到不同诱导信号的作用，神经嵴细胞将分化为不同类型的细胞并形成不同 的结构。由神经嵴细胞迁移并分化产生的细胞包括感觉和自主神经系统的神经元和雪旺细胞，肾上腺髓质 的噬铬细胞和肠神经系统，以及许多如软骨组织和皮肤的黑色素细胞等非神经成份。这一发育阶段的中胚 层沿神经管二侧膨大为体节(somite)，发育为成年期的脊柱椎体和有关的骨骼肌。

2 神经管的发生和早期分化 人胚第 3 周初，位于原条前方的神经外胚层受诱导增厚形成细长形的神经板。以后，神经板逐渐长大

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并凹陷，形成神经沟。在相当于枕部体节的平面上，神经沟首先愈合成管。愈合过程向头、尾两端进展， 最后在头尾两端各有一开口，分别称前神经孔和后神经孔。胚胎第 25d 左右，前神经孔闭合；第 27d 左右， 后神经孔闭合，完整的神经管形成。神经管的前段膨大，衍化为脑；后段较细，衍化为脊髓。神经板由单 层柱状上皮构成，称神经上皮(neuroepithelium)，它有活跃的分化能力。当神经管形成后，管壁变为假 复层柱状上皮。 成神经细胞属分裂后细胞，不再分裂增殖。它们起初为圆形，称无极成神经细胞(apolar neuroblast)， 以后生出两个突起，成为双极成神经细胞(bipolar neuroblast)。双极成神经细胞朝向神经管腔一侧的突 起退化消失，成为单极成神经细胞(unipolarneu mblast)；伸向边缘层的一个突起迅速增长，形成原始轴 突。单极成神经细胞内侧端又形成若干短突起，成为原始树突，于是成为多极成神经细胞(multipolar neuroblast)。多极成神经细胞进一步生长分化为多极神经元。 神经沟愈合为神经管的过程中，神经沟边缘与表面外胚层相延续的一部分神经外胚层细胞游离出来。 形成左右两条与神经管平行的细胞索，位于表面外胚层的下方，神经管的背外侧，称神经嵴。神经嵴分化 为周围神经系统的神经节和神经胶质细胞、肾上腺髓质的嗜铬细胞、黑色素细胞、滤泡旁细胞以及颈动脉 体 I 型细胞等。另外，神经嵴头段的部分细胞还可变为间充质细胞，并由此分化为头颈部的部分骨、软骨、 肌肉及结缔组织。所以，这部分神经嵴组织又称中外胚层(mesoectoderm)。 当 神经褶融 合成神经管 时 ，神经 褶头部在脊索 前方发育 成较宽的两叶 状态 ，以 后发育为前 脑 (prosencephalon)。在此宽大的神经褶内面两侧各出现一浅凹，称“眼沟”(optic sulcus)。前脑区后缘 向尾端至第一对体节平面的较窄的一段神经沟，将形成中脑(mesencephalon)和菱脑(rhombencephalon)的 头部。与这一较窄的神经沟相对的表面外胚层增厚。称为“耳板”(otic placode)。脑原基的更尾段相当 于第 4 对体节的区域将形成菱脑的尾部。大约 23d 时，神经褶的闭合已达耳板平面，菱脑区已变成管状， 眼沟下陷更深，仍然开放的神经管头端增厚，出现丘脑的原基。25d 左右，前神经孔关闭。前脑两侧的眼 沟变成了两个向外突出的眼泡(optic vesicle)。此时神经管的脑部呈现 3 个扩张，依次称为前脑泡、中 脑泡与菱脑泡。中脑泡与菱脑泡之间缩窄的区域称脑峡(isthmus)(图 5-2)。 第 4 周时，前脑随脑的生长及胚体头褶的加深而向腹面突出。前脑的生长围绕口咽膜、脊索与脑的会 合处，而胚体头部也围绕此会合点弯曲，从而在中脑处产生一个明显的凸向背侧的屈曲，称中脑曲 (mesencephalic flexure)；菱脑与脊髓相连处随同胚体的头褶也出现一不太明显的凸向背侧的颈曲 (cervical flexure)。在菱脑腹外侧面上出现一些分段的隆起，称神经管节(neuromere)或菱脑节。34d 左 右，中脑曲与颈曲更加明显，眼泡已转变成眼杯。随着脑部的继续生长，在菱脑中段产生第三个凸向腹侧 的弯曲，称脑桥曲(pontine flexure)。同时，菱脑的顶壁张开，向两侧扩张并变薄。大约在 38～39d 时， 眼杯前下方的前脑两侧壁长出两个端脑泡(teleneephalic vesicle)，即为两大脑半球的原基。约 41d 时， 桥 曲 更 加 明 显 ， 菱 脑 被 此 曲 划 分 成 两 部 分 ， 即 头 端 的 后 脑 (metencephalon) 与 尾 端 的 末 脑 ( 又 称 髓 脑)(myelencephalon)。后脑经脑峡向头部与中脑相连，末脑则与脊髓相续。中脑在中脑曲上方稍扩展， 其背侧最前方以前脑顶壁尾部的小突出物为界，此突出物即松果体。前脑两侧的端脑泡更加扩大，位于两 端脑之间的前脑成为间脑(diencephalon)。眼杯形成的视神经位于间脑底的中央突出物的前方，此突出物 即神经垂体原基。此时，神经管的脑部从前向后依次由两个端(大)脑泡、间脑、中脑、后脑与末脑这五部 分组成。

3 脊髓的发育 脊髓由神经管的尾端分化发育而来。神经 管的管腔演化为脊髓中央管，套层分化为脊髓 的灰质，边缘层分化为白质。 神经管的两侧由于套层中的成神经细胞 和成胶质细胞的增生而迅速增厚，腹侧部增厚 形成左右两个基板(basal plate)，背侧部增 厚形成左右两个翼板(alar plate)。神经管的 图 5-3 脊髓的形态发生 2

顶壁和底壁均薄而窄，分别形成顶板(㈣f plate)和底板(floor plate)。 由于基板和翼板的增厚，在神经管的内表面出现了左右两条纵沟，称界 沟(sulcus limitan)。 由于成神经细胞和成胶质细胞的增多，左右两基板向腹侧突出，致 使在两者之间形成了一条纵行的深沟，位居脊髓的腹侧正中，称前正中 裂。同样，左右两翼板(及该处的室管膜层)也增大，但主要是向内侧推 移，并在中线愈合，致使神经管的背侧部分消失。左右两翼板在中线的 融合处形成一隔膜，称后正中隔。中央管的腹侧部分形成永久的中央管 (图 5-3)。 基板形成脊髓灰质的前角(或前柱)和侧角(或侧柱)，前角中间区的 成神经细胞分化为躯体运动神经元，其轴突向外生长，离开脊髓，组成 脊神经的前根，分布于骨骼肌。侧角中间区的成神经细胞分化为内脏运 动神经元。翼板形成脊髓灰质后角(或后柱)，其中间区的神经细胞分化 图 5-3 脑 泡 的 发 生 及 演 变 为后角联合神经细胞。至此，神经管的尾侧分化成脊髓，神经管周围的 (侧面观及冠状切而观) 间充质分化为脊膜。此时脊髓灰质的形态特征有后角、前角、侧角及狭 小的中央管。 白质由神经管的边缘层演化而成，主要为神经细胞突起与神经胶质细胞所组成的网状支架。其中神经 细胞突起在脊髓内上下走行，形成神经束。 胚胎第 3 个月之前，脊髓与脊柱等长，其下端可达脊柱的尾骨。此时，每条脊神经的起始部和它通过 的椎间孔都在同一高度上。第 3 个月后，由于脊柱和硬脊膜生长得比脊髓快，所以脊髓短于脊柱。由于脊 髓头端与脑相连而固定，而脊柱逐渐超越脊髓向尾端延伸，故脊髓末端的位置相对上移。第 6 个月时，其 末端位于第一骶椎水平。到出生前，脊髓下端与第三腰椎平齐，仅以终丝与尾骨相连。成人的脊髓尾端终 止于第二腰椎。由于节段分布的脊神经均在胚胎早期形成，并从相应节段的椎问孔穿出。当这种不均等生 长造成脊髓的位置相对上移后，脊髓颈段以下的脊神经根便越来越斜向尾侧，至腰、骶和尾段的脊神经根 则在椎管内垂直下行，与终丝共同组成倾斜度较大的马尾。 髓鞘由少突胶质细胞所形成。胎儿 4 月时，开始出现髓鞘，出生一年后，其形成速度逐渐减慢。运动 神经纤维髓鞘的形成一般是在具有较完备的功能之后，于出生后 1～2 年才逐渐完成。

4 脑的发育 4.1 脑外形的发育 胚胎第 5 周末，5 个脑泡已明显形成。大约 6 周时，末脑(延髓)表面已出现数对脑神经。桥曲很明显， 但脑桥尚未隆起。后脑背侧的两侧缘增厚，称菱唇(rhomben— cephalic lip)，为小脑的原基。菱脑顶板 的其余部分扩张成薄膜状。中脑扩展，略为突起于菱唇上方。端脑泡已扩大为两个大脑半球，并在间脑两 侧向后、向上并向前扩展。后两个方向上的扩展超过间脑的背侧壁和头端，致使两个半球的内面在间脑背 面上方互相贴近．接触面变扁平，两者问的间充质形成大脑镰(falx cerebri)。每一半球的前下端各出现 一小的嗅球。第 3 月时，两个半球扩大，并向后盖过间脑的侧壁，再继续向后盖过中脑的背外侧。最后， 两 个 半 球 的 尾 端 扩 展 到 与 发 育 中 的 小 脑 贴 近 ， 两 者 之 间 的 问 充 质 变 密 ， 形 成 小 脑 幕 (tentorium cerebellum)。 大脑半球主要向前、上和后三个方向不均一地扩展，致使两个半球的下外侧面相对凹陷。成为脑岛区 (insular region)。紧邻岛区后方的脑壁生长迅速，并向前下方扩展至岛区的下外侧，形成颞叶。大约 9 周时，颢叶已位于问脑底壁下方两侧，间脑底壁形成下丘脑。脑岛上前方的部分形成额叶。颞叶形成后， 大脑半球继续向后扩展，形成枕叶。上述大脑半球各部形成后，其表面仍是光滑的。大约 24 周时，半球 表层的皮质迅速增生，致使表面产生褶皱，形成脑沟与脑裂。额叶与顶叶之间的半球外侧面出现中央沟 (central fissure)，其前方的中央前回成为躯体运动的控制中枢，后方的中央后回成为躯体感觉中枢。

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同时，脑岛周围脑区的继续扩大使岛区更为凹陷。各脑区包围并趋向覆盖脑岛的突出物称脑盖 (operculum)。共有额、顶和颞叶的 3 个岛盖，它们三者互相靠拢，逐渐将脑岛封闭起来。它们之间的深 沟称外侧裂(1ateral fissure)或斯氏裂(sylvius)。 脑回与脑沟的发育有明显的规律性。出现最早的脑沟是半球内侧面的海马沟，继之为顶枕沟、距状沟 与嗅球沟。24 周时，外侧裂与中央沟出现，此时内面的顶枕沟与距状沟连接成 Y 字形。其他第二级脑沟如 颞下沟与额上沟出现于 28 周前后。第三级脑沟直到胎儿后期才陆续形成，并延续到生后。脑回发育的状 况可用来判断胎龄。一般认为．脑回的发育程度取决于大脑皮质内外层的生长比例。在两种皮质发育异常 所造成的平滑脑与脑回过小中，均有皮质分层的异常。

4.2 脑内部构型的发育 前、中、后(菱)3 个脑泡形成时，各自内部均有相应的腔。大约 35d 时，菱脑腔扩张，顶壁变薄，两 侧壁的基板与翼板朝背外侧展开。此处扩大的腔以菱脑中段最宽，向头、尾端逐渐变细，大致呈一头尾向 的菱形，这就是以后的第四脑室。菱脑腹外侧壁的内面出现 6～7 个分节状隆起，与其外表面的神经管节 相对应，又称菱脑节。这些节以后消失，不清楚它们的功能意义。有可能是此脑区发育的机械性压力造成， 也可能与鳃弓神经的发育有关。中脑内腔稍窄，形成以后的导水管。大约 6 周时，两端脑泡变显著，随脑 泡突出的腔成为两个侧脑室，两者在间脑的前上方处通人间脑腔，后者称第三脑室。第三脑室向后与中脑 腔相连续，向两侧与侧脑室的沟通口较大，即为原始室间孔(primitive interventricular foramen)。第 三脑室前端的间脑壁很薄，此处称终板(Iamina terminalis)。两侧界沟从脊髓延伸入菱脑内的菱脑节背 侧，向前进入中脑，再向前与下丘脑沟相连续，此沟将丘脑与下丘脑的原基分开。 大约 7 周初，菱脑底壁增厚，菱脑节消失，第四脑室外侧部更向两侧扩张。后脑顶壁的前外侧缘增厚 形成的菱唇随着桥曲的发育突入脑室，成为小脑原基。随着大脑两个半球的发育，其底壁增厚突入侧脑室， 形成纹状体原基。两侧室间孔则相对变小。此时下丘脑下方有通向眼柄的管腔开口，眼柄下方的终板内有 一增厚区，标志着视交叉的出现。 3 月初，第三脑室已接近成人形态，室间孔更缩小，丘脑占据了间脑侧壁的绝大部分，其背侧借一不 很明显的上丘脑沟与缩小的上丘脑分开；其腹侧面借下丘脑沟与较大的下丘脑分开。在终板的中段内出现 一增厚的前连合。两半球暴露的内侧面更扩大。此时中脑腔仍较大，但中脑底壁因纤维束增加而变厚，形 成被盖与大脑脚。后脑基板的边缘带内出现纵行和横行纤维，致使脑桥和延髓的腹侧壁增厚突出。小脑进 一步增大而形成室内与室外部分。第四脑室的两侧角称为侧隐窝，它们从两侧向腹侧扩展到延髓上端的外 侧面(图 5-4)。

(1) 约 9 周

图 6-3 人胚胎脑室内部构型的发育(左侧单内面观)

(1) 约 40d

(2) 约 9 周

图 5-4 人胚胎脑室内部构型的发育(左侧单内面观) 4

的下丘脑分开。在终板的中段内出现一增厚的前连合。两半球暴露的内侧面更扩大。此时中脑腔仍较大， 但中脑底壁因纤维束增加而变厚，形成被盖与大脑脚。后脑基板的边缘带内出现纵行和横行纤维，致使脑 桥和延髓的腹侧壁增厚突出。小脑进一步增大而形成室内与室外部分。第四脑室的两侧角称为侧隐窝，它 们从两侧向腹侧扩展到延髓上端的外侧面(图 5-4)。

第二节 神经诱导及其分子基础 什么因素控制神经板的形成和区域特性? 1924 年 Spermann 和 Mangold 发现未分化的外胚层由相邻的中 胚层细胞诱导出神经板。他们把预期发育为中胚层部 分的细胞移植到正常情况下形成皮肤的胚胎腹区，证 实移植细胞仍然分化为中胚层组织，如脊索和体节。 移植细胞周围的外胚层细胞却形成胚胎的第二个神经 管，移植早期胚胎的其他区域则不能诱导出第二个神 经系统。这一发现表明在正常发育期间，神经系统是 由一个特定部位的细胞诱导而来的，Spemann 把这一 区域称为“组织者”(organizer)。蛙胚神经诱导的最新 研究肯定了 Spemann 的发现，并且认识到这一诱导过 程是由来自脊索细胞的信号启动的图 5-5。 自从 Spemann 和 Mangold 发现“组织者”诱导外 图 5-5 神经管阶段的横切面示意图 沿 l、2 线路迁移的神经嵴细胞分别分化为感觉神经节 胚层为神经成分以后的几十年，人们一直认为外胚层发 和交感神经节，沿 3 线路迁移的为肾上腺神经分泌细 育为神经板是由于组织者与预定为神经板的外胚层区 胞的前体细胞，沿 4 线路迁移的则变为非神经成 域间信号传导的结果，外胚层细胞在没有这种信号传导 的情况下则发育为表皮。但是，发育生物学家经过巨大 努力却没有能确认神经诱导的基因表达因子。进入九十 年代后，“组织者”的信号传导诱导神经板形成的观点 受到了极大的挑战，因为新的证据证明外胚层成为表皮 这一过程恰恰需要特定的信号传导，而神经胚形成则无 需信号传导，表皮诱导或神经抑制比神经诱导的提法更 确切。BMP (骨髓形态发生蛋白，bone morphogenetic protein) 是外胚层的表皮诱导因子，它是一类外胚层自 分泌的生长因子，为 TGFβ生长因子超家属的成员。当 原肠胚的外胚层小块培养于没有“组织者”的条件下， 自身的 BMP4 将使之分化为表皮 (细胞)，但是当这一外 胚层小块打散为细胞培养时，尽管也不存在“组织者”， 它们都分化为神经型细胞、因为 BMP 被稀释而无效， 图 5-6 肠胚表皮诱导和神经抑制示意图 因此 BMP 是表皮的诱导因子。在没有这一因子的情况 下， “神经”的面目就暴露(图 5-6A)。Activins 是 TGFβ生长因子超家属的另一个成员。缺末端 II 型 Activin 受体 (tAR) 和缺末端 I 型 BMP4/2 受体处理将干扰外胚层细胞接受 BMP4 信号的能力，因此原本分化为表 皮的外胚层细胞却分化为神经型细胞(图 5-6B)。Noggin，Chordin 和 Follistatin 是在“组织者”新发现的神 经诱导因子，但是至今末找到它们在应该分化为神经板的胚胎背部外胚层细胞上有相对应的受体，因此它 们并不直接作用于被诱导的外胚层细胞。生物化学研究证明这些神经诱导因子能直接结合 BMP4，以致 BMP4 不再能激活其外胚层细胞上的受体，因而干扰了 BMP4 的信号传导，背部胚胎的外胚层细胞则不再 被诱导为表皮，却显现出神经型细胞的本来面目(图 5-6C)。这表明“组织者”的神经诱导因子实为表皮诱 导因子 BMP4 的抑制因子。BMP4 在原肠胚有其特定的时空分布。原位杂交显示 BMP4 RNA 存在于原肠 胚形成初期的胚胎背部以及腹、侧边缘区，在原肠胚后期，转录物从将要变为神经板的外胚层中消失。

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有关神经胚形成分子机制的知识有助于搞清楚许多先天性疾病的病因并进而考虑其预防。胚胎可能接 触到的许多可能干扰正常信号传导的物质，如酒精和酞胺哌啶酮 (thalidomide，镇静药)，可能引起胚胎神 经系统的病理分化。像脊柱裂(spina bifida)、无脑畸形 (anencephaly) 和其他脑畸形(常伴有智力迟钝)。接 触到外源性视黄素及其衍生物的实验动物常发生胚胎神经管尾部不完全闭合。至少二种少见的遗传病— Weardenburg’ s 综合症 (耳聋症状和神经管异常) 和 aniridia (虹膜畸形和嗅觉缺失) 是因为单个转录因子基 因的突变。因为后果是如此严重，孕妇必需尽可能免用所有药物，特别在怀孕头三个月。

第三节 主要脑区的形成 神经管形成后不久，因其弯曲、折叠和收缩等形态改变，主要脑区的原基变得明显(图 6-4A，C)。神 经管前部的弯曲称头曲 (cephalic flexure)，其头端膨大为前脑 (forebrain，prosencephalon) 泡。在头曲处外 凸为中脑 (midbrain，mesencephalon) 泡。在神经管的稍后部有一颈曲 (cervical flexure)。在头曲和颈曲间 的长而相对平直部分形成菱脑 (rhombencephalon) 泡，颈曲之后的神经管为脊髓的原基。发育神经管之内 腔因弯曲和折叠，成为成年脑的脑室。原始脑泡一旦形成，它们又继续经历至少二次分部，出现二级脑泡 (图 5-4)。前脑泡的二侧各有一个视泡 (optic vesicle) 和端脑泡(telencephalic vesicle )，不成对的中间部分则 为间脑 (diencephalon) 泡。此时的前脑则包括二个 视泡，二个端脑泡和一个间脑泡。视泡生长并内陷 成视柄和视杯，最终成为成年期的视神经和视网膜， 它们均属脑而不属于周边神经系统。端脑泡向后生 长成为位于间脑上方和外侧的大脑半球。端脑泡还 长出位于大脑半球前部腹面的嗅球 (olfactory bulbs) 和嗅觉的有关结构。中脑泡不如前脑泡变化大。菱 脑泡中间部出现一弯曲称桥曲，其前部的菱脑泡部 分则称后脑 (metencephalon) 泡，后部的菱脑泡成 为末脑 (myelencephaldon) 泡。 端脑壁细胞分裂和分化为二个灰质结构：大脑 皮 层 (cerebral cortex) 和 基 底 端 脑 (basal telencephalon)。发育的前脑神经元轴突组成三个主 要的白质系统：①大脑皮层白质，包含进出大脑皮 层的轴突；②胼胝体，为大脑皮层白质的延伸部分， 形成连接二侧大脑半球皮层的轴突桥；③内囊，连 接大脑皮层和丘脑以及其他脑干部位。大脑半球内 部充满液体的空间为侧脑室，间脑中心的空间称第 三脑室。间脑发育为丘脑和下丘脑 (图 5-4)。 中脑泡背面发育为顶盖 (tectum)，底部成为被 盖 (tegmentum)，其间缩小为一狭长通道称大脑导水 管 (cerebrdal apueduct) 与前部的间脑第三脑室相 通 (图 5-7 D1，D2)。 菱脑泡分化为三个重要结构：小脑，脑桥和延 脑。小脑和脑桥源于后脑泡 (图 5-7 E1，E2)，延脑 始于末脑泡 (图 5-7 F1，F2)。管腔即后来的第四脑 室，与中脑导水管相连。脊髓原基发育为脊髓，其 内腔成为中央管 (图 5-7 G1，G2)。 神经前体细胞组成的一个简单的管子如何发育为 图 5-7 发育脑的结构特化 如此众多的脑结构? 二十世纪初曾观察到神经管是由 D1、E1、F1 和 G1 分别为 A 的 dl、el、n 和 gl 水平的横 称为神经节 (neuromer) 的重复单位构成，进而认为所 切面；C、D2、E2、F2 和 G2 分别为 B 的 c、d2、e2、f2 有动物的胚胎在发育最早期的节段形成过程 和 g2 水平的横切面。 6

(segnentation) 也可能使发育脑具有区域特性。随着一类叫同源盒基因 (homeobox gene) 的早期表达，果蝇 胚胎分化为将形成头、胸和腹的不同节段。在哺乳动物也已发现类似的同源盒基因 (hox gene)，它们在发 育神经管的弯曲，折叠和收缩等形态改变的同时或更早表达于将成为未来不同脑结构的相应区域。

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细胞增殖

成年人脑大约有 1000 亿 (1011) 个神经元和比这多得多的胶质细胞。除少数特例，成年脑的神经元都 是在生前仅仅几个月的时间窗里由一小群前体细胞产生的。此后，前体细胞消失，不再有新的神经元补充 以代替因老年或损伤失去的神经元。 脑泡壁是细胞分裂极为活跃的神经上皮。早期脑泡壁由外层的边缘区（marginal zone）和内层的脑室 区 (ventricular zone) 构成。在人胚细胞增殖的高峰期，每分钟产生大约 25 万个新的神经元。分裂期前体 细胞紧挨脑泡壁脑膜 (外表) 面和脑室 (官腔) 面，在两个界面间按以下不变的模式不断来回移动 (图 6-6)。复制前期 (G1) 的细胞核靠近脑室，合成 RNA 和胞浆；复制期 (S) 细胞核及其周围的胞浆向脑膜面 移动，复制 DNA；复制后期 (G2) 细胞核再次移向脑室面，细胞生长；分裂期(M) 为有丝分裂期，细胞失 去与脑膜面的连接。分裂的子细胞可能为新的干细胞，向脑膜面伸出新的突起并进入下一轮分裂周期，或 者是不再分裂的成神经细胞。从脑室区迁移至目的地并分化为神经元。神经元前体细胞脱离分裂周期成为 不再分裂的成神经细胞的时间常称为细胞的“出生期”(birthdate)。一个前体细胞在分裂前，首先从细胞外 空间摄入核苷酸以复制 DNA，因此通过母体内注射 3H 标记的胸腺嘧啶或者注射胸腺嘧啶的类似物——溴 代去氧尿嘧啶，在生后或成年期用放射自显影术或免疫组织化学方法可以确定细胞的出生期。标记物为所 有处于分裂期的干细胞结合入复制的 DNA 并带入其子细胞。如果一个细胞继续分裂，其 DNA 的标记将很 快被稀释，如果一个细胞在释入标记物后只经最后一次分裂，其分裂后成神经细胞将有高的标记物含量并 长期保存于神经元。那些带有标记的细胞的出生期即是母体接受标记物注射的时间。神经元出生期的研究 证明，具有特定细胞类型和神经联系模式的每个脑结构是由 一个特定发育时间内出生的许多细胞群集而成的。

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细胞迁移和分化

细胞迁移是具有特定空间关系的细胞群普遍存在的发 育特征。分裂后的成神经细胞最终的准确定位特别重要，因 为发育中的突触前和突触后成分必须在准确的时间并在准 确的位置才能建立起具有信息传递功能的神经 元间的准确联系。绝大部分源于神经管脑室区或 神经嵴的发育期神经元都经过相当路径的迁移。 这点在灵长类这样的大动物尤为明显。在大脑皮 层的形成过程中，神经元往往必须从脑室区迁移 图 6-6 脊椎动物神经上皮(神经板和神经 到 数 毫 米 之 外 靠 近 脑 膜面 的 皮 层 板 (coitical 管)前体细胞的分裂周期 plate)。神经元迁移缺陷将导致人类和实验动物 主要的神经功能障碍。 目前对于神经元从出生地至目的地如何迁 移的机理了解甚少， 但是已经知道微环境对于一 个细胞能否迁移，甚至对于其表型的决定都是至 关重要的。 微环境的细胞粘连分子和细胞外基质 分子以及靶细胞分泌的特异多肽生长因子可能 在驱动神经嵴细胞的迁移中发挥非常重要的作 用。在呈层状结构的大脑皮层、海马和小脑的发 图 5-8 发育中枢神经系统的成神经细胞沿放射状胶质 育过程中，微环境的放射状胶质细胞 (radial glia) 细胞的迁移

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是成神经细胞迁移的骨架 (图 5-8)。成神经细胞沿放射状胶质细胞的突起由脑室区爬行抵达皮层板后分化 为具有轴突和树突的神经元。脑室区最早 (出生) 的成神经细胞爬行穿越中间区并抵达皮层板后即分化为 皮层的第 VI 层神经细胞，随后的成神经细胞则穿越第 VI 层细胞并抵达皮层板后分化为第 V 层神经细胞， 相继到达皮层板的成神经细胞依次分化为 IV、III 和 II 层神经细胞，因此皮层的形成经历一个由内至外的 细胞组装过程(图 5-9)。

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神经元表型的多样性及其形成的分子基础

胚胎脑室区的所有神经前体细胞看上去 都一样，但是它们最终产生的神经细胞，其形 态和功能都相当不同。例如，根据神经细胞的 形态，神经递质类型，细胞表面分子和它们参 与形成的突触类型的不同，成年大脑皮层神经 元的细胞类型至少有几十种。况且脑室区的干 细胞既产生神经元，也产生具有不同特性和功 能的胶质细胞。这些不同类型的细胞是如何和 何时被决定的呢? 一种可能是，不同类型的神经元以及胶质 细胞在发育的极早阶段，或许在神经板形成时 期就被决定。不同类型的前体细胞可能存在于 脑室区，每一种前体细胞产生成年期特定类型 的细胞。根据这一意见，一种细胞的命运是其 家系决定的，即不同类型的神经元和胶质细胞都 图 5-9 皮层由内至外的发育过程 有其不同的“祖先” 。另一种完全对立的看法是： 前体细胞可能并不提供其最终细胞类型的任何信 息，与特定脑区微环境中其他细胞的相互作用才是确定细胞类型的决定因素。至今还没有多少证据证明前 体细胞很早就注定只能产生特殊类型的干细胞，倒是有实验表明前体细胞能连续产生具有不同表型的多种 干细胞。例如在视网膜利用谱系标记技术 (在单个前体细胞的基因组里插入报告基因，如β-半乳糖苷酶基 因) 证明一个前体细胞能够产生视网膜的任何一种细胞，包括双极细胞，神经节细胞，无长突细胞和胶质 细胞。因此，家系在细胞命运的决定方面只起很小的作用。在鸡视顶盖 (相应于哺乳动物的上丘) 和小鼠 大脑皮层的类似实验也得到了相同的结论。 大量证据有利于细胞-细胞间的相互作用启动神经元分化的观点。对于这一问题的探索，多数依靠移 植手段进行：移植胚胎的小块脑区到宿主动物并观察移植的细胞在以后的发育中是否获得宿主的表型特 性。结果表明非常早期的前体细 胞在移植后常常具有宿主的表 型，然而，较晚期的前体细胞移 植后则保留其原有的类型。 细胞间相互作用而不是其 家系决定神经元表型的观点还 可以从无脊椎动物果蝇眼睛的 发育和脊椎动物神经嵴细胞以 及胶质细胞的分化得到证实。果 蝇眼睛是由几百个称为小眼 （ommatidia） 的重复细胞群组 图 5-10 相邻细胞的信号决定果蝇感光细胞的分化 成的一个特殊结构，每个小眼有 A．单眼感光细胞的分化顺序；B．基因突变影响耵感光细胞的命运；C．Sevenless 20 个细胞，其中 8 个为特殊的 蛋白的免疫细胞化学定位。

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感觉神经元 (Rl～R8)，依其不同轴突投射和产生的视蛋白 (opsin) 分为三组感觉细胞。感觉神经元的发育有其严格的时间顺序 (图 5-10)，第一个表达神经元性质的感觉细胞是 R8 细胞，其后为 R2 和 R5 的分化，随后为 R3 和 R4，R1 和 R6 相继分化，最后一个 出现的是 R7 细胞。 R7 细胞的正常发育决定于至少有二个基因控制的细胞间相互 作用：R7 细胞的 sevenless 基因和 R8 细胞的 Boss 基因。sevenless 基因编码一个具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白 Sevenless。R8 细胞的 boss 基因产物 Boss 蛋白可能是 R7 细胞表达的 Sevenless 蛋白受体的配体，R8 细胞的 boss 蛋白激活 R7 细胞上的 Sevenless 蛋白受体即启动 R7 胞内一连串的蛋白激酶活性，包括 GTP 结合 蛋白 Ras，丝氨酸／苏氨酸激酶 Raf 和几个其他的激酶。boss 基 因突变将引发 Boss 蛋白的缺失，即 R7 细胞 sevenless 受体的配体 缺失，因此原本发育为 R7 的感觉细胞成为胶质细胞样细胞。 Sevenless 基因突变的后果是 sevenless 蛋白受体的缺失，导致原本 发育为 R7 感觉细胞的细胞失去了对于 R8 细胞的 Boos 信号的反 应能力，最终也只成为胶质细胞样细胞。 图 5-l1 微环境因子对交感肾上腺家 R7 细胞的发育为细跑一细胞相互作用决定神经元的特性提 系前体细胞分化的决定作用 供了一个极好的例子，也证明了作为信号的细胞表面分子在决定 细胞表型的过程中的介导作用。果蝇 Sevenless 蛋白以及它激活的细胞内蛋白非常类似于脊椎动物的蛋白， 表明神经发育中的信号转导机制在无脊推动物和脊椎动物是相当保守的。这种保守性也见于无脊椎动物和 脊椎动物其他受体酪氨酸激酶激活启动的细胞内信号转导。由 Sevenless 和其他受体酪氨酸激酶启动的胞 内信号包括 Ras 胍核苷结合蛋白，Raf 丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白激酶 Mek 和 MAP 等。 发育为交感神经系统和肾上腺髓质的神经嵴细胞属于交感肾上腺家系，其后代细胞是儿茶酚胺能细 胞，它们包括交感神经元，嗜铬细胞和称为强荧光小 (small intensely fluorescent, SIF) 细胞的交感神经节细 胞。从胚胎肾上腺髓质或交感神经节分出这些细胞的始祖细胞 (progenitor) 在不同培养条件下将变为不同 表型的细胞 (图 5-11)。当培养液含有糖皮质激素时，始祖细胞就发育为嗜铬细胞。成纤维细胞生长因子和 神经生长因子则诱发培养的始祖细胞分化为合成去甲肾上腺素的交感神经元。培养液如含白血病抑制因 子，交感细胞却分化为合成乙酰胆碱的胆碱能细胞。神经嵴前体细胞向肾上腺部位迁移时可能接触到由肾 上腺皮质合成的大量糖皮质素。糖皮质激素能激活具有转录因子功能的核受体，最终使前体细胞分化为嗜 铬细胞。正如嗜铬细胞一样，血液中糖皮质素可能决定前体细胞变为 SIF 细胞，因为低浓度糖皮质素可以 促进离体培养的始祖细胞发育为 SIF 细胞。 大鼠视神经的胶质细胞发育是脊椎动物通过细胞—细胞间相互作用决定细胞类型的又一个例子。离体 培养的大鼠视神经有三种胶质细胞：少突胶质细胞和二类星形胶质细胞。每类细胞都有特异表达的细胞内 和细胞表面蛋白。少突胶质细胞 (0) 和 II 型星形胶质细胞 (2A) 都是从一种叫做 0—2A 细胞的前体细胞 分化而来，I 型星形胶质细胞则从不同的前体细胞分化。生长因子在 0—2A 细胞分化为 H 型星形胶质细胞 还是少突胶质细胞方面似乎起关键作用。在无生长因子条件下，培养的 0—2A 细胞迅速分化为少突胶质细 胞。血小板生长因子 (PDGF) 能促进 0—2A 细胞增殖，睫状体神经营养性因子 (CNTF) 能诱发 0—2A 细 胞分化为 II 型星形胶质细胞。I 型星形胶质细胞能释放诱导 0—2A 前体细胞增殖并促进其分化为 II 型星形 胶质细胞的生长因子。可见，0—2A 细胞在 I 型星形胶质细胞的影响下能分化为 II 型星形胶质细胞。

第四节

神经回路的构建

1 轴突生长及其路径选择 神经系统发育的很多特性中，最为神奇的或许是生长轴突穿过复杂的细胞领地找到几个毫米或几个厘 9

米之外与之匹配的突触后靶细胞。Harrison 于 1910 年首先 观察了离体生长的轴突。他有如下的一段记录：生长中的 神经纤维有相当大的能力穿过神经管固态或半固态原生 质，但是我们目前对于把它们引向特定位置的条件尚一无 所知。 现在已经知道轴突的生长能力是生长锥(growth cone) ——生长轴突顶端的一个特殊结构所具有的特性。生长锥 是运动活跃的结构，不停地探测细胞外环境并对局部信号 作出反应。表现为生长速度和方向的改变。生长锥由扁平 图 6-12 培养感觉神经节细胞轴突顶端的 的板层形伪足 (lamellapodia) 及其丝状伪足 (filopodia) 生长锥 组成(图 5-12)。丝状伪足一会儿伸出，一会儿缩回消失， 如同伸出的手指触摸环境以获取“感觉”并决定其何去何从。 生长轴突在旅途中会作出很多生长方向的选择，在“交叉路口”的选 择尤为重要。例如人和其他哺乳动物的额侧视网膜神经节细胞的轴突在视 交叉处仍然在脑的同侧延伸，而鼻侧视网膜神经节细胞的轴突则交叉到对 侧(图 5-13)。因此，视网膜上不同位置的节细胞轴突在抵达视交叉前必须 作出是否越过中线的决定。当节细胞轴突抵达视交叉时，生长锥呈流线型， 延伸变慢。然而当它越过中线时，形状变得更为复杂。生长锥功能和结构 的改变可能反映出重要信号的局部改变。

2 轴突生长与细胞外基质和细胞表面粘连分子 生长锥行进于发育胚胎组织中时，它们不仅接触到其他神经元和非神 经元细胞，也会遇到许多细胞外基质(extracellullar matrix)的分子。细胞外 基质是由细胞产生却并不直接位于细胞表面的许多分子的混合物。细胞外 基质特别富有几类能粘着生长锥的大分子，最为明确的是层粘蛋白(lamilin) 和纤连蛋白(fibronectin)。生长锥浆膜含有结合那些分子的特异受体，总称 整合素(integrin)。被激活的整合素受体将启动生长锥内 部一连串导致促进和引导轴突延伸的信号转导过程(包 括钙和三磷酸肌醇等细胞内信使含量的改变)。 细胞表面的粘连分子(adhesion molecule)也影响轴 突的延伸。例如钙粘素(cadherin)，它同时见于生长锥以 及与之发生相互作用的其他细胞的表面，它是一类至少 有 10 种亚型的蛋白，每一种都由不同的基因编码。生 长锥上的钙粘连蛋白分子以钙依赖方式识别并结合到 其他细胞表面的相同分子。这是一种多种细胞的细胞间 相 互 作 用 共 有 的 同 源 性 结 合 。 细 胞 粘 连 分 子 (cell adhesion molecule，CAM)是另一类重要的细胞表面粘连 分子，其同源结合并不依赖钙的存在，它们在结构上类 似于免疫球蛋白分子。神经系统有二类细胞粘连分子： 为神经元—胶质细胞粘连分子 (Ng-CAM) 和神经细胞 粘连分子 (N-CAM)。前者见于神经细胞 (轴突) 和中枢神 经系统的星形胶质细胞以及周边神经系统的雪旺细胞，后 者见于许多生长过程中的轴突。生长锥上的细胞粘连分子 与星形胶质细胞或雪旺细胞的同源分子结合，从而沿着这

图 5-13 小鼠视神经发育

图 4-14 发育神经系统轴突生长锥与其微环 境成分间的分子作用

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些细胞延伸，或者与其他神经细胞的同源分子结合，促使轴突形成束，使后到的轴突顺着先行轴突形成的 通路生长。示意图 (图 5-14) 表明生长锥通过其受体整合素结合细胞外基质的层粘蛋白和纤连蛋白，其钙 粘蛋白和细胞粘连分子与非神经元细胞 (如胶质细胞) 和其他神经细胞轴突上的相应分子同源结合。 某些细胞外基质分子和细胞表面分子，如层粘蛋白，N-钙粘蛋白和 N-CAM 是神经系统的许多发育通 路所共有的，它们可能是轴突的一般性促生长分子。那些分子的多个变异体可能由一个多基因家属的个别 成员编码，通过 mRNA 的不同剪切或蛋白的翻译后改变产生，它们在发育中具有更为专一的表达模式，并 且可能引导特定的轴突抵达相应的靶区。 现在已知 Ng-CAM 的编码基因突变导致轴突生长信号传导机制的失常，因此将造成 X 染色体连锁的 脑积水和大脑麻痹性截瘫等先天性疾病的发生以及胼胝体和皮层脊髓束的缺失。

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轴突生长与化学导向因子

伟大的西班牙神经解剖学家 (Ramon y Cajal) 曾认为由靶组织产生的“吸引因子”引导生长轴突到达 其靶区。Cajal 依这一非凡的先见之明推断，从不同靶区来的信号能选择性影响轴突生长锥的运动，因而吸 引它们到达合适的目的地。许多在体和离体的实验均肯定了这一基本理论。然而，鉴别这些信号非常困难， 一是因为这些因子在发育胚胎的含量极小，二是如何区分引导轴突向其目的地的化学导向因子 (chemotropic factors) 和支持神经元及其突起存活和生长的神经营养分子(neurotrophic molecules) 的问题。 确实符合化学导向因子全部标准的第一个分子家属是 netrins (梵文为“引导”之意)。这一类蛋白的分 离和其编码基因的克隆晚于 Cajal 预言其存在的时间长达一个多世纪。netrins 由发育脊髓腹侧边缘的底板 分泌，吸引称为连合纤维的轴突群从脊髓背区长向腹部并交叉至对侧。图 5-15 表明脊髓底板能吸引与之联 合培养的脊髓长出轴突，况且，当非神经细胞转染 netrin 基因以后也能分泌 netrins，并吸引连合轴突生长。 对于连合轴突具有正向吸引作用外，netrins 对于其他生长轴突还具有负向的抑制生长的效应。因此，同一 种信号能指令一种生长轴突 (这里为连合纤维)“过来”，同时会命令另一种纤维 (非交叉纤维) “走开” 。 此后意想不到的发现是 netrin 基因非常类似于先前在线虫 C．elegans 鉴别的基因 unc-6，其编码蛋白 Unc-6 引导线虫的神经元轴突生长。这一发现提示，至少是某些轴突生长导向因子在进化的早期就已经出 现。 多数轴突生长导向研究的对象是那些增强轴突生长或吸引生长轴突的导向分子，但是，构建神经系统 也有让某些轴突不向某处生长的必要，因此，最近关于抑制或排斥生长轴突的导向分子，也称抑制因子 (inhibitor) 和化学排斥因子 (chemorepellent) 已越来越受到注意。神经科学的某些最为棘手的问题，如中 枢神经系统的纤维束因外伤或疾病招致损伤后不能再生，可能因为存在这样的抑制因子而并非缺乏促进生 长的因子。

图 5-15 发育脊 髓的化学导向因 子(netins)对于 轴突生长的影响

有一类结合 于细胞表面或细胞外基质的抑制分子、对临近处轴突的生长起阻止作用，如中枢神经系统的少突胶质细胞 (形成中枢髓鞘的胶质细胞) 分泌并整合到中枢髓鞘的抑制性蛋白 IN-1 (inhibtor-1)。离体和在体实验均证明 这一蛋白抑制轴突的生长。另一类分子是弥散性化学排斥因子。Raper 在鸡脑提取液发现一种能使培养中 的轴突生长锥塌陷和回缩的因子，最后纯化出这一效应分子为 collapsin (源于 collapse 一词，意为“坍塌”) 并克隆出它的编码基因。几乎在同一时期，Coodman 及其合作者发现蝗虫的一个细胞表面糖蛋白-IV 型纤 11

维成束蛋白 (fasciclin IV) 的单克隆抗 体能结合到引导果蝇轴突生长的一种蛋 白上。他们利用 PCR 技术和序列分析鉴 定出四种结构上相关的蛋白 semaphorin (源于 semaphore 一词，意为“信号”) 的 基因。其中之一为 simaphorin Ⅲ (Sema Ⅲ) 与 鸡 的 collapsin 同 源 。 semaphorin 既可能以分泌形式，也有以 图 5-16 在 NGF 存 在 条 件 下 鸡 胚 背 根 神 经 节 与 细胞表面结合的形式存在，它们的基因 SemaⅢ/collapsing 基因非转染(A)和转染(B)的非神经细胞团块联 以特定模式表达于发育的脊椎和无脊椎 动物胚胎。细胞培养研究表明分泌的 semaphorin 排斥鸡背根神经节的轴突生长（图 5-16），对其他轴突却 无此效应。

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轴突在脑内靶区的拓扑分布与识别分子

周边感觉在中枢神经系统都 可以找到其对应点，周边的相邻点 在中枢神经系统的对应点也相互 靠近，那么生长轴突如何使其呈现 严格的拓扑模式分布于脑内的相 应靶区? 图 6-17 蛙和其他低等脊椎动物发育视网膜神经节细胞轴突到视顶 早在 20 世纪 60 年代，Sperry 盖的投射(A)和再生节细胞轴突保持到顶盖准确投射的行为证据(B) 主要根据青蛙和金鱼视觉系统的 研究提出了化学亲和假说 (chemodaffinity hypothesis)。那些动物的视网膜神经节细胞 的轴突末梢在视顶盖 (对应于哺乳动物的上丘) 形成一个 明确的拓扑图，后部视网膜的节细胞轴突投射到前部顶 盖，前部视网膜轴突投射到后部顶盖。当挤压损伤视神经 并任其再生 (与哺乳动物不同，鱼和两栖类动物的中枢神 经能再生)。Sperry 发现再生视神经纤维在顶盖重建起一个 正常的联系模式，仍然表现出后部到前部和前部到后部的 投射特异性。即使将眼睛旋转 180°，再生轴突也常常长 回到它们原来的顶盖位置 (图 5-17)。再生视神经在顶盖的 拓扑投射仍然保持不变可以从蛙的行为得到验证：当一只 苍蝇在蛙的上方飞过，蛙总是扑向下方捕捉，反之亦然。 图 5-18 视网膜一顶盖化学亲和性的体外 因此，Sperry 建议每一顶盖细胞都带有一个独特的“识别 分析 A 和 P 分别为顶盖前、后部的细胞膜条带 标记”，视网膜神经节细胞的生长轴突末梢有互补的标记 得以在顶盖找到特定的位置。照现在的说法，那些顶盖的识别标记就是识别分子 (recognition molecule)， 与神经节细胞互补分子的亲和性 (affinity) 使二种神经细胞建立选择性联系。 低等脊椎动物视觉系统的进一步研究动摇了刻板的化学亲和学说——每个顶盖位置由不同的识别分 子标记。Bonhoeffer 及其合作者的一系列体外实验令人信服地证明，在顶盖存在节细胞的生长轴突对之起 反应的细胞表面分子，它们在顶盖呈梯度分布。正常情况下，鸡视网膜颞区节细胞轴突只支配顶盖的前部， 鼻区节细胞轴突却只投射到后部。如果将鸡顶盖前部和后部分别分离的细胞膜制成相间的条带，颞侧或鼻 侧视网膜的外植块则置于细胞膜条带的一端，发现颞侧视网膜轴突倾向于长入前部顶盖细胞膜条带却避开 后部顶盖细胞膜条带，相反，鼻侧视网膜轴突既长入前顶盖细胞膜带也长人后顶盖细胞膜带 (图 5-18)。

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正向相互作用可能是因为生长锥与顶盖细胞间有较高的粘合性，不能长入不合适的区域可能由于导致 生长锥坍塌的负向相互作用 。对轴突起负向引导信号作用的鸡顶盖分子 ——排斥性轴突导向信号 (repulsive axon guidance signal，RAGS) 和人的同源分子 AL1 以及在小鼠起 类似功能的 ELF1 已经被纯化，其编码基因亦已克隆。RAGS 是分子量为 25kDa，它们是以糖基磷脂酰肌醇(glycoylphosphatidyl inositol，GPI) 锚于顶 盖细胞膜的蛋白，为轴突 Eph 酪氨酸激酶受体家属的特异配体。RAGS／ AL1／ELF—1 在发育顶盖的梯度分布有助于解释视网膜节细胞轴突末梢在 顶盖的拓扑分布。

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选择性突触形成

在抵达准确的靶区以后，轴突必须在许多可能成为其突触后细胞中挑选 它将支配的特定靶细胞。这一问题最为详尽的研究大多在周边神经系统，特 别是自主神经节细胞的神经支配。十九世纪末，英国生理学家 Langley 首先 探索了这一课题。位于脊髓不同节段的节前神经元以固定不变的选择性方式 支配交感链神经节细胞 (图 5-19)。例如脊髓 T1 水平的节前细胞支配那些投 射到眼部的颈上神经节细胞，而 T4 脊髓节前细胞却支配引起耳部血管收缩 的颈上神经节细胞。 因为所有那些神经元的轴突都途径颈交感链抵达颈上神 经节，所以，导致神经节细胞不同神经支配的机制必定是在突触形成这一环 节而不在于轴突生长的引导。先于 Sperry 半个多世纪，Lanley 在一个完 图 5-19 突触前和突触后细 全不同的研究系统推断选择性突触形成是因为突触前、后成分的特异化学 胞间的特异亲和性决 亲和性。 然而，突触前、后神经元之间的选择性亲和性在地域上并不是绝对的， 定哺乳动物神经元间专一 性突触联系 颈上交感神经节细胞优先与特定脊髓节段的节前神经元建立突触联系，但 不排除与脊髓其他节段的节前细胞有突触连接。如果手术切断特定脊髓节 段对颈上神经节的支配，几周后的细胞内记录表明去神经的交感神经节细胞与来自通常并非合适的脊髓节 段的轴突建立了新的突触联系。新联系也呈现出节段优势模式，表明这一系统在新的情况下也想要得到最 好的细胞间匹配。轴突在何处与靶细胞形成突触是由一套现在开始被认识的分子所严格控制的。过去 20 多年，许多研究者试图寻找控制突触形成的分子，他们的努力在神经肌肉接头获得了巨大的成功，现在已 经知道由运动神经末梢释放的 Agrin 分子参与功能性突触的建立过程。 Agrin 作为突触分化决定因子的有力支持来自 Sanes 及其合作者最近的发现：agrin 基因缺失的遗传工 程小鼠在胎儿期很少有神经肌肉接头。缺失 agrin 受体的动物，神经肌肉接头发育受阻，出生时即死亡。 因此，agrin 是决定靶细胞特定位置形成突触的分子。 因为突触的形成是突触前、后对应成分间的进行性应答过程，所以很可能有许多信号系统参与这一过 程，s-laminin 可能是除 agirin 以外的又一个分子，它是突触所特有的一种细胞外基质分子。然而，agrin 及 其受体仍然被认为是控制突触形成的第一个分子范例。Agrin 在中枢神经系统的突触发育过程中的作用尚 待进一步研究。

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神经元的存活及其与靶细胞间的联系保持：神经营养因子

生长轴突与其对应的靶细胞之间形成突触联系意味着一个新的发育阶段的开始。突触一旦形成，神经 元的继续存活和分化在某种程度上将依赖于靶细胞的存在，如没有突触后靶细胞，发育神经元的轴突和树 突将萎缩，神经细胞终究有可能死去。神经元和其靶细胞间的这种长时间的依存关系称为神经营养性 (相 互) 作用 (neurotrophic interaction)，这种作用由神经营养因子 (neurotrophic factor)介导。神经营养因子不 同于葡萄糖或 ATP 这类代谢性营养成分，而是类似于其他的细胞间信号分子 (如促分裂因子和细胞因子)。 它们由靶组织合成，起着调节投射神经元的存活和其后的生长与分化的作用。 许多脊椎动物的发育早期有过量的神经细胞产生 (最后存活数的 2～3 倍)。确立投射神经细胞群落的 13

最后规模是通过使那些不能很好地与相应靶细胞发生相互作用的神经元的死亡来实现的，这一过程已被证 明由神经营养性因子介导。 20 世纪初就开始的长期研究提供了这样一个事实：靶细胞在决定支配它们的投射神经元群落的大小方 面起着主要作用。具有重要意义的观察是，去除鸡胚的一个枝芽将明显减少晚期胚胎脊髓相应部位的运动 神经细胞数量(图 5-20 A、B)。作为这一实验结果的解释，推测脊髓神经元的存活依赖于从靶区 (发育肢体) 获取有限的营养性因子。相反，增加可用的靶区将提供额外的营养性支持以拯救正常情况下死去的那些神 经元(图 5-20 C、D)。因此，成年期神经元群落的大小并非预先就完全决定，在某种程度上是由神经元与靶 之间的营养性作用所控制的。 失去靶营养支持的神经元死亡不同 于因损伤或疾病的细胞死亡。失去营养 支持的神经元通过叫凋亡 (apoptosis) 这一过程而死亡，是一群“打开”即引 起神经元和其他细胞死亡的特异基因活 跃转录的结果。神经元凋亡的组织病理 学明显不同于因机械损伤，中风或神经 变性疾病的神经细胞死亡。凋亡的细胞 图 5-20 靶区支持神经元的存活作用 A．2．5 天鸡胚枝芽切除； 和分子过程似乎包含许多控制细胞分裂 B．枝芽切除后一周的脊髓切片；C．移植附加枝芽到 2．5 天鸡胚；D．移 和细胞分化的相同机制，因此凋亡是细 植后一周的脊髓切片。 胞分化的一个程序性过程。 一旦通过对靶营养的竞争而选择性形成了神经元群落以后，营养性作用继续调节突触联系的形成。突 触联系形成是一个开始于胚胎期，延伸至生后相当久远的过程。在建立神经支配期间，必须确保每个靶细 胞为恰当数量的轴突所支配和每一轴突支配恰当数量的靶细胞，这一目标的实现是发育神经细胞和靶细胞 间神经营养性作用的又一重要功绩。 依据神经营养因子的假设条件，我们将能理解神经营养作用的二个主要功能：使相当大的神经元群落 中的某些神经元存活和形成恰当数量的神经联系。神经营养因子的假设条件包括：①神经元的存活并保持 其靶联系需要有少量的营养因子供应；②靶组织 (可能是其他神经元、肌肉或其他周边结构) 合成可满足 发育神经元需要的合适的营养因子；③靶组织只产生数量有限的营养因子，因此，发育神经元的存活和此 后神经元联系的保持取决于神经元对营养因子的竞争。一个经过大量研究的多肽分子，神经生长因子 (nerve growth factor，NGF) 完全符合上述那几个假设标准。有关 NGF 的研究结果虽然不能解释营养性作 用的所有方面，但是它确实是认识靶组织 (细胞) 如何影响支配神经细胞的存活和联系的一个典型例子。 NGF 于 20 世纪 50 年代初为华盛顿大学的 Levi-Montalcini 和 Hamburger 所发现。根据去除发育枝芽 后运动神经元存活情况的观察，他们作出了颇有兴趣的猜测：靶细胞提供某种信号给有关神经元，含量有 限的信号因子迫使那些竞争失败的神经元死亡。为此，他们进行了一系列的实验以探索假定信号的性质和 来源。Hamburger 生前的一个学生切除鸡胚的一个枝芽并代之以一片小鼠肿瘤组织，惊异地发现瘤组织具 有比肢体更强的刺激，以致正常支配肢体的感觉和交感神经节变大。Montalcini 和 Hamburger 证明肿瘤 (小 鼠肉瘤) 能分泌一种刺激感觉和交感神经节细胞存活和生长的可溶性因子。Levi-Montalcini 发明了这种因 子的生物测定方法，并且与 Cohen 合作分离和鉴定了能诱发培养神经节长出大量神经突起而已经被命名为 神经生长因子的分子。此后，从雄性小鼠的唾液腺纯化得到作为—种蛋白的 NGF，并测定了它的氨基酸序 列和克隆出其编码 cDNAs，于 1991 年得知其活性部分的晶体结构为β亚单位的二聚体。 许多进二步的观察证明了 NGF 在生理条件下对神经元存活的重要性。施以 NGF 抗血清以耗尽发育小 鼠可用的 NGF 将导致成年小鼠多数交感神经元的丧失。相反，注射外源性 NGF 到新生啮齿动物将使交感 神经节变大，这是一个与失去 NGF 完全相反的效应。在外源性 NGF 处理的交感神经节内，细胞的数量和 大小均比对照有显著增加，胞体间有更密的突起网，表明轴突、树突和其他细胞成分的过度生长。NGF 对 于细胞存活的神奇效应使入们认识到，它确实是一个靶产生的信号，使神经细胞和其靶细胞在数量上相称。 最近十几年，特别是进入 90 年代以来，大量神经营养性因子被相继发现，NGF 只是神经营养性因子 中神经营养素 (neurotrophin) 家族的一员。归纳起来，有以下几类神经营养性因子：

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(1) 神经营养素家族。其成员包括 NGF(神经生长因子， 也称神经营养素-1，NT-1)、BDNF (脑源性神经营养性因子， brain-drived neurotrophic fator，也称神经营养素-2，NT-2)、NT-3 (神经营养素-3)、NT-4/5 (神经营养素-4/5) 和 NT-6 (神经营养 素-6)。神经营养素家属各成员在氨基酸序列和结构上具有高 度同源性，但它们表现出既有不同的，也有重叠的功能特异性 (图 5-21)。例如 NGF 支持交感神经细胞的存活及其突起生长， 另一家属成员 BDNF 却无 NGF 这一功能。相反，BDNF 而不 是 NGF，支持节状神经节 (nodose ganglion) 神经元的存活。 NT-3 则促进所有交感神经节，节状神经节和脊神经节的神经 元存活和生长。 神经营养素的选择性作用由一个受体蛋白家属——具有 酪氨酸激酶活性的 Trk (读为“Track”) 受体的介导。不同的 受体成员一般由不同的神经营养素激活。TrkA，TrkB 和 TrkC 分别为 NGF，BDNF、和 NT-3 的受体，TrkB 也可为 NT-4/5 激活 (图 5-22)。一种特定的 Trk 受体亚型表达将赋予神经元 对于相应神经营养素作出反应的能力。因为神经营养素和 Trk 受体仅仅存在于神经系统中一定类型的神经元，配体与受 体间的特异结合也就表现为神经营养性作用的特异性。除 Trks，神经营养素各成员还有一个共有的低亲和性受体， 其分子量为 75kDa，因此称为 p75NTr (neurotrophic factor receptor)，它并非直接介导神经营养素的功能，而是通过 低亲和性结合并“储存”神经营养素，最后将神经营养素 逞送给高亲和性受体 Trks。 (2) 白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6) 细胞因子家 属。此家属的成员有 IL-6、IL-11、LIF (白血病抑制因子， leukemia inhibitoryfactor)，CNTF (睫状体神经营养因子， ciliary neurotrophic factor) 和 CT-1 ( 心 营 养 素 ， cadiotrophin-1)。gp130 蛋白为各成员的共用受体。就神经 营养性功能来说，CNTF 和 LIF 比较重要。CNTF 对睫状 神经节细胞及其他某些周边和中枢神经元具有促存活和 生长的效应。 (3) 转 化 生 长 因 子 β (transforming growth factors β,TGFβ) 家属。主要成员有 TGFβ-1 至 5，GDNF (胶质 细 胞 株 产 生 的 神 经 营 养 性 因 子 ， glial ceel line-drived neurotrophic factor)。已发现的相应受体均属于丝氨酸／苏 氨酸激酶受体家属的成员。已知 TGFβ-2，TGFβ-3 和 GDNF 支持中脑多巴胺能神经元的存活。 (4) 成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor， FGF) 家属，有 aFGF (酸性 FGF，FGF1)，bFGF (碱性 FGF， FGF2) 和 FGF3-9。有低亲和性和高亲和性二类 FGF 受体， 高亲和性受体均属于受体酪氨酸激酶 RTKs 家属的成员。 bFGF 具有对多种神经元的存活促进作用。 随着多种神经营养性因子及其功能的发现，关于神经 营养性因子的来源、功能及其专一性等经典概念受到了挑

图 5-21 神经营养素 NGF、BDNF 和 NT-3 对于 培养的背根神经节(DRG)、节状神经节(NG) 和交感神经节(SG)神经元突起生长的效应

图 5-22

神经营养素激活酪氨酸激酶受体家属相应

成员的示意图

图 5-23 神经营养因子在神经元发育和成熟过程 中的可能作用 15

战。神经营养性因子可能的来源有靶区 (逆行方式)，投射神经元 (顺行方式)，胶质细胞等非神经成分的旁 分泌 (paracrine) 和被作用神经细胞本身的自分泌 (autocrine)。一种神经营养性因子作用于多种类型的神经 元，一类神经元可对多种因子起反应。神经营养因子的作用不仅仅在于它们在发育的凋亡阶段支持神经元 的存活，而是从分裂增殖阶段乃至成年期的神经元都有重要作用(图 6-22)，但是，目前关于神经营养因子 功能的认识多数来自实验研究，它们在体内 (包括发育期) 的确切生理学意义还不完全清楚。

第五节 神经回路的修饰 1 外周神经系统突触联系的修饰 研究中枢神经系统的大脑皮层或其他区域复杂回路的 突触修饰是极为困难的，因此很多关于发育脑回路不断改变 的基本观念来自更简单，易于研究的系统，最主要的是脊推 动物神经肌肉接头和自主神经节细胞的神经支配 (图 5-24)。 成年骨骸肌纤维和某些自主神经节的神经元仅由单个神经 元支配，然而这些靶细胞的早期都接受几个神经元的支配， 即所谓多神经元支配 (polyneuronal innervation)。在生后的 早期发育阶段，支配的神经元由多个逐步减少至一个，这一 过程称为突触消除。虽然，这种消除实际上是指支配一个靶 细胞的神经细胞的数目减少，而不是靶细胞上突触总数的减 图 5-24 哺乳动物外周神经系统在生后头 少。事实上，在发育过程中的外周神经系统和脑的突触总数 几周的突触重排。A．神经节细胞；B．骨骼肌 是逐步增加的。 纤维。 许多实验表明，某些早期到达肌肉和神经节细胞的传入 的消除是不同神经元为获得同一个靶细胞的“所有权”而相 互竞争的结果。竞争的对象很可能是营养性因子，虽然至今还没有在肌肉或自主神经节明确地证明这些假 定因子的存在。其他分子，如突触后的神经递质受体也似乎具有对突触前末梢的反馈作用。实验提示这种 竞争由突触前和突触后成分的电活动模式调节。例如，神经肌肉接 头的乙酰胆碱受体被α-银环蛇毒素 (乙酰胆碱受体的一种不可逆 性拮抗剂) 阻断，多神经支配则被保留。阻断运动神经元的突触前 动作电位 (钠通道阻断剂河脉毒处理) 也将阻止多神经支配的消 除。因此，阻断神经活动将减少或阻止突触前成分的相互竞争作用 和相关的突触重排。 ① 突触需要最低水平的营养支持才能存在； ② 突触兴奋引发突触后(靶)细胞分泌有限的相关因子； ③ 只有当突触的活动和靶细胞的活动一致时，突触才能得到营养 支持。 前二点已在前一节有关周边神经系统的论述中得到证明，活动 在突触相互竞争中的作用则在视觉系统的研究中得到了充分肯定。

2 视皮层眼优势柱及其发育

图 5-25 放射自显影图(与视皮层平 行的切面)显示成年恒河猴初级视 皮层第四层的眼优势柱

绝大多数由丘脑外膝体 (LGN) 来的上行传人终止于初级视皮层，从双眼来的信息首先在此整合。在 某些哺乳动物——食肉动物，灵长类猴和人，外膝体传人纤维在视皮层第 IV 层呈现与每只眼相对应的相 间条带状分布一眼优势柱。一侧眼内注射放射性氨基酸 (如脯氨酸) 的放射自显影可显示皮层的眼优势柱。 放射性脯氨酸进入视网膜节细胞后结合到为神经元突触终末的保存和功能所需要的蛋白，标记蛋白沿轴突 正向传输至位于外膝体的视神经末梢并部分释放至细胞外，释放的标记蛋白降解为仍带同位素标记的氨基 酸和小的多肽，接着又为外膝体神经细胞吸收并重新结合到新合成的蛋白，再经过轴突的正向传输而抵达

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皮层内的轴突末梢，这一过程称为垮神经元 传输：因此，一侧眼内注射的放射性氨基酸 将标记相应的外膝体结构层 (以及其他视网 膜节细胞的靶区，如上丘)，和外膝体神经元 在视皮层的神经末梢。图 5-25 反映成年恒河 猴的优势柱是大约 0.5mm 宽度的许多条带， 明亮带是放射性氨基酸注射的眼代表区，暗 带为未经注射的另一眼代表区，二眼优势柱 占有相同大小的视皮层区域。电记录证实恒 河猴视皮层 IV 层细胞几乎无例外地对左侧或 右侧的刺激起反应，而在 IV 层上方或下方各 层的神经元整合来自左和右眼的传入，因此 对双眼视觉刺激起反应。 发育早期 (猴生前，或猫生后头二星期) 的放射自显影表明，视皮层 IV 层不显示成年 期通常所见的相间特异条纹，却显示连续的标 记带 (图 5-26)，表明两眼开始的视觉传人都

图 5-26 猫眼优势柱的发育 A．视皮层冠状切片放射自显影 图显示眼优势柱的形成过程；B．正常发育期外膝体一皮层传入改 变的示意图。

到达整个视皮层，它们并不分别限定在，视皮层的右眼 /左跟柱。相应发育期的电生理研究也表明，最终将分别 接受左眼或右眼相关传人的视皮层财层神经元，最初却 同时接受二眼的传入。在发育稍后阶段的示踪剂注射开 始显示第四层标记密度的周期性改变，提示外膝体皮层 传人逐渐分为左眼和右眼区，经历了视觉系统发育的修 饰过程。 新生猫的一侧眼脸被缝合而丧失视觉经验直至成 年(约需 6 个月)时，电生理记录表明视皮层第 4 层很少 有细胞能为原闭合眼的视觉刺激所兴奋，几乎所有的细 胞却为没有关闭的那只眼兴奋。在闭合眼的视网膜和相 关外膝体结构层内的电生理记录表明，丘脑之前的视觉 图 5-27 放射自显影图显示猴关键期单侧眼 通路功能是相当正常的，因此视皮层细胞不再对闭合眼 视觉缺失 刺激起反应并非因为视网膜变性或者视网膜到丘脑的 联系消失，而是因为闭合眼与视皮层的功能联系中断，闭合眼在行为上变瞎。这种“皮层性瞎子”或弱视 (amblyopia)是永久性的，原先的闭合眼即使再睁开数年，其视觉功能却不能或很少恢复。 生后 2 周右眼被关闭直至 18 月龄的猴，在其处死前二周左眼注射示踪物的放射自显影显示视皮层异 常的眼优势条带模式 (图 5-27)，左眼的视皮层条带 (白色) 比正常更宽，视觉缺失的右眼条带萎缩。这一 解剖学观察表明，视皮层 IV 层神经元对于原闭合眼的视觉刺激不起反应并不是由于它们失去了丘脑的神 经支配，而是改由正常左眼相对应的丘脑传人所支配。Hubel 和 Wiesel 把这些结果解释为早期发育时两眼 间的相互竞争作用。在正常动物，两眼经历几乎相同的视觉刺激，因此占有相同的皮层区。当一眼的视觉 缺失引起视觉经验的不平衡时，正常眼就有了竞争优势，并抢占了很多原来由闭合眼相关传人支配的视皮 层区域，表明生后早期的视觉缺失将引起视皮层神经联系的改变。 不均衡竞争将改变视皮层的丘脑传人分布这一思想已为动物生后同时短期关闭双眼的实验所证实。在 这一情况下，整个视皮层的神经元失去了正常的视觉刺激，几个月以后的电生理和解剖学研究表明视皮层 的眼优势柱排列相当正常，皮层细胞的反应性质虽然有点怪，但代表两眼的神经元的比例大致是正常的。 因为两眼的视觉活动并末失去平衡，所以保持两眼在皮层各自的对应区域。 成年猫的眼睛长期闭合则不影响相应视皮层细胞对视觉刺激的正常反应，即使闭合一年或数年后再开 启，视皮层的电生理学和动物的视觉行为仍然正常。Hubel 和 Wiesel 的实验证明仅在动物生后早期的眼睛

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闭合才导致弱视和眼优势柱的异常。他们把视觉缺失的敏感时期称为眼优势柱发育的关键期 (c11ticalPeriod)。在关键期的最敏感时间 (猫生后 4 周左右)，少至延续 3-4 天的眼睛闭合都将严重改变视 皮层的眼优势柱。在猴的类似实验表明灵长类动物也出现类似现象，虽然其关键期更长 (出生至 6 个月)。 通过标记的外膝体单个神经元将会更详尽地显示，在关键期即使是短至一周的视觉缺失都将引起外膝 体神经元轴突在视皮层 W 层的树状末梢迅速改变。正如已经指出的，单眼闭合引起的视觉缺失将导致该 眼视皮层野的丧失，同时发生开眼皮层野的扩大。在单个轴突水平上，那些改变反映于开眼对应的外膝体 细胞轴突树状末梢分支程度和复杂性的增加，闭眼对应的轴突树状末梢变少和不那么复杂，这就充分说明 发育皮层对环境改变作出的反应是通过突触的废弃和重建，塑造新的神经联系。 总之，动物(包括人类)的视觉系统回路在出生时尚未完全特化，成年模式的建立还需要视觉经验。皮 层(和皮层下)联系的重塑可能是多种神经系统关键期的细胞基础。

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关键期的意义

活动促使神经回路的修饰及其深刻的行为影响常发生于生命早期的关键期。关键期概念源于动物行为 研究的一些先驱者的观察。Tinbergen 和 Loreng 等发现某些奇怪的复杂行为是先天的，无需存何先期的经 验。然而其他的行为表现只出现于生后早期 (或孵化后) 的一个短时期内动物具有一定的特别经验之后。 一个有趣的例子见于鸭和鹅。新出壳的雏鸭或雏鹅将尾随它们见到的第一个大的移动物体—通常是其母 亲，也可以是其他动物(包括人)和甚至无生命的物体。 出壳后头几天内这种首先接触到的物体一旦为雏鸭或雏鹅“铭记”和趋随，此后的经验将难以改变它 们的这一行为。那些早期经验的影响并不仅仅限于鸟类。Harlow 及其同事关于灵长类动物行为发育的实验 表明，早期社会经验的残缺将深刻地、不可逆地影响猴参与成年的社交能力。，隔离饲养的猴成年后害怕 其他猴并且对异性没有多少兴趣，这些行为也不再为以后改变了的生活方式所改变。 许多行为形成的关键期开始于生后早期，结束于青春期末或稍后。关于猫和猴视觉系统发育的良期研 究以及更多的其他工作令人信服地表明，内在的发育机制并不能完全建立起成年期的脑回路，经验对脑回 路具有修饰完善作用。有理由认为，年幼动物的任何异常经验都可能导致形成此后无法矫正的异常的脑回 路模式。 实验动物关键期的那些观察对于人的视觉系统发育，对于人的行为发育都具有重要的临床意义。 白内障是妨碍正常视觉的晶体浑浊，如同猫或猴的眼睛用手术方法使之闭合一样将阻止明确的图形感觉。 成年期出现的白内障在被移去后，病人通常能恢复视力，相反婴儿期的白内障在一年内不作治疗，此后再 作摘除也永远不能恢复该眼的视力。这个不幸的结果强调了早期发现和治疗视觉缺陷的重要性，否则将导 致永久性视觉损害。为校正儿童的斜视眼常用眼罩盖住正常眼，如使用不当有可能引起原本正常的视力下 降。关键期也见于语言学习过程中。婴儿出生后的头几个月即能察觉出多种语言的语音音素 (语言的基本 成分)。但是到了一岁，即学会讲话的前夕，婴儿开始失去分辨新的语音的能力。儿童在青春期以前必须置 身于一种语言环境之中，否则他们将永远失去分辨不同语音的能力。持续性失聪也能导致语言学习的障碍。 例如儿童的中耳炎持续发作将影响听觉并影响语言学习。一个具有正常听力的儿童如果在关键期生活在没 有正常语言的环境里，此后即使给予语言强化训练也不能使之具有基本的语言交流能力。视觉系统的发育 和视觉缺失的后果可被当作神经回路并不太清楚的其他系统功能缺损影响的例子。

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第六节 神经系统的修复 胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES 细胞) 是来自内细胞团( inner cell mass, ICM ) 的一种多潜能细胞, 具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力。1981 年, Evans 等首次从小鼠延迟着床的胚泡中获得了 ES 细 胞, 随后, 人们相继得到了不同动物的 ES 细胞。在体外, 分化抑制培养可使 ES 细胞保持未分化状态而无 限增殖, 一旦撤除分化抑制因素，又可分化为包括内胚层、中胚层和外胚层的多种类型的细胞, 培养基条 件适宜时, ES 细胞则可发生定向分化。1998 年, 人类 ES 细胞系的建立, 引起了世界范围内的广泛关注和 巨大反响, 1999 年, Scisence 将 ES 细胞研究列为世界十大科学进展之首。

1 体外定向诱导分化为神经细胞的方法 在体胚胎分化过程中, 组织的发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。体外诱导分化的 原理, 就是选择适当的诱导剂和诱导模式, 通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤 等, 使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。目前, 在 ES 细胞体外定向诱导分化时, 多先将 ES 细胞悬 浮培养形成类胚体(embryoid bodies, EBs) , 再将 EBs 消化成单细胞贴壁培养, 并于不同的培养阶段添加不 同种类和不同浓度的条件培养液、化学物质或细胞因子, 直接促进 ES 细胞定向分化为某种特殊类型的细 胞, 或培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用, 从而高效诱导目的细胞的分化。对被诱导分化的细胞 还可作进一步的筛选培养, 以获得高度纯化的分化细胞。 目前, 已报道的自 ES 细胞诱导分化的细胞主要包括造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰 岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞和黑素细胞等。

1.1 维生素甲酸(retinoic acid, RA) 诱导 1.1.1 维生素甲酸(retinoic acid, RA) 诱导方法 神经生长因子(NGF)可促进 EBs 中神经元样细胞的形成。在 EBs 悬浮培养过程中添加 0.5Lmol/L RA, 可使贴壁培养的 EBs 在 48 h 内出现神经元样细胞, 4～6 d 时达到最多, 细胞间形成丰富的网络样结构, 这些细胞都能特异地与神经微丝蛋白(NF) 抗体反应, 神经突起中抗体反应最为明显；8～10 d 后, 神经元 样细胞逐渐减少, 神经突起逐渐变细、缩短, 网络结构逐渐消失。骨形态发生蛋白 24 (BMP24) 可阻止 RA 对小鼠 ES 细胞的神经化作用而促进其向中胚层分化, 而应用血清饥饿法抑制中胚层分化, 添碱性成纤维 细胞生长因子(bFGF) 可促进神经前体细胞形成, 并进一步应用神经营养因子, 可显著提高多巴胺(DA)能 神经元的数量, 并能有效维持存活和显著促进细胞增殖。 EBs 单细胞贴壁培养, 经 0.5 μmol/L RA 诱导分化的细胞表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、γ氨基丁 酸(GABA )、酪氨酸羟化酶(TH) 和脑因子21(BF21) 等神经元相关蛋白。采用4-/4+ 诱导法，0.5 μmol/L 的 RA 可诱导 ES 细胞分化为 GFAP 抗体染色阴性和 NF 抗体染色阳性的成熟神经元细胞, 第 8 天神经 元细胞的分化比例达最大值(31.7%)。用 RA 诱导 ES 细胞不仅可获得 GABA 神经元, 也可获得 DA 神 经元, 且分化的神经祖细胞冻存后仍具有扩增和分化为功能性神经元的能力。 PA 6 基质细胞表面存在强有力的神经化活性物 SDIA , 将猕猴 ES 细胞接种于 PA 6 细胞单层上分 化培养 2 周时, 所诱导的神经元细胞 中 35% 为 TH+ 神经元, 这些神经元可产生有效量的 DA (1.0pmo l/107 细胞) , 且这种分化的发生要比胚胎中快(10 d/35 d)。小鼠 ES 细胞与 PA 6 基质细胞共培养, 可高效 诱导分化为能产生 DA 的 TH+ 神经元，这些 DA 神经元移植后可整合于小鼠纹状体并表达 TH。 单层培养的 ES-5 细胞, 添加 1 μmol/L RA 与 1mmol/L 双丁酰基环腺苷单磷酸(dBcAM P) , 可使诱 导产生的分化细胞比例高达 90%～95% , 分化早期的神经胶质细胞占分化细胞的 90%～95%。将 ES 细 胞在 ESM 培养基中培养 4 d 后, 添加 0.5μmol/L RA 再诱导培养 4 d, 使 ES 细胞形成 EBs，多数 EBs 细胞呈神经祖细胞免疫标志巢素(nestin)阳性, 离散的 EBs 细胞在神经细胞基础培养液中可形成神经元、 星形细胞和少突神经胶质细胞, 纯化培养后可使少突神经胶质细胞纯度达 92% , 并具有重新形成轴突髓 鞘的作用。

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1.1.2 用 RA 诱导存在的问题和局限性 RA 是使胚胎干细胞向神经细胞分化的有效诱导剂, 但是无法排除杂细胞的存在, 而且, 神经细胞的 出现也是神经元和胶质细胞的混杂, 并且存在得率不高的问题。在 Fraichard 的研究中只有 10% 的 ES 细胞在 RA 诱导后分化为神经元, 而 Gottlied 的研究中比率为 40%。LiMing 等发现, RA 诱导的细胞 50% 出现树突和神经元的标志, 如 MAP2、tau 蛋白及 Ⅲ 型β2 微管蛋白, 而小部分, 最高达 20% 的细 胞表达星状细胞的标志, 如 GFAP。此外, 还混有其他的非神经细胞, 尤其是上皮样细胞, 如果在基础培养 液中加入血清或 bFGF 或 FGF-2 后, 这些非神经细胞就会迅速扩增, 并逐渐成为占上峰的主导细胞。 Jonathan 等的研究中发现, RA 的神经诱导效率很高, 他们用 neuro tag green (NG) 来标记细胞，发现在 RA 诱导后有 90% 以上的细胞结合了NG，而 RA 诱导之前, ES 细胞不结合 N G。RA 诱导后细胞中不 结合 NG 的为成纤维样细胞和 GFAP 染色阳性的胶质细胞。他们同时还发现 RA 诱导后的细胞不再增殖, 而且大多数的神经元细胞在培养后 5 天就死亡。 实验结果的不同, 也许和实验中具体的 RA 诱导方法和过程有关。如 Fraichard 的研究是将 ES 细 胞在无 LIF 的 ES 培养液中形成胚体, 培养液中含有 l μM all-trans RA, 2 d 后, 将胚体移至无 LIF 和 RA 的培养液中, 并且让胚体贴壁。胚体的细胞在贴壁后向周围扩散, Fraichard 就对这些细胞作鉴定。 Jonathan 的方法是将 ES 细胞在含有 10% FBS 和 0.5μM RA 的 DMEM 培养液中形成胚体, 共 4 天，然后用胰酶消化, 打散, 再将打散的细胞用神经培养液培养, 该培养液含胰岛素等多种配方。 Bain[ 4 ]的方法现在被认为最经典。可以以“4- /4+ ”代表, 即让 ES 细胞在没有抑制分化因子(如滋 养层细胞或L IF) 的培养液中形成胚体(EB) , 4 天后在培养液中加入一定浓度的 RA , 如此再诱导 4 天后, 撤去RA , 细胞再移到含某些营养神经的成分的培养液中, 观察神经细胞的形成情况。

1.2 其他诱导方法 Okabe 等 1996 年，采用无血清培养液选择性培养神经前体细胞(neuronal precursor)。他们在 EB 形 成后, 贴壁 24 小时，换 ITSF 培养液。ITSF 为胰岛素( insulin)、转铁蛋白( transferrin )、硒( selenium ) 和 纤维连接蛋白( f ibronectin)。在此条件下, 可富集到类似神经上皮细胞的小长形细胞, 其 nesin 抗体反应阳 性。该前体细胞在 bFGF 作用下可大量增殖, 撤去 bFGF 后, 细胞分化为神经元和神经胶质细胞。 Lee 等总结了一条有效的 ES 细胞向神经细胞诱导分化的技术线路, 该路线就是基于Okabe 的 ITSF。他们认为用此方法可以由 ES 细胞产生无限量的中后脑神经元。 Hancock 等也以同样无血清培养方法获得神经祖细胞 (progenitor) , 以 bFGF 扩增后进行低温保存。 冻融复苏后, 这些细胞仍可在 bFGF 条件下扩增, 在撤去 bFGF 后, 细胞同样可以分化为神经细胞。这一 工作完善了 ES 细胞诱导分化的神经细胞的培养体系。

1.3 基因表达与神经分化 1.3.1

基因表达

在胚胎的早期发育过程中, 中枢神经系统(CNS) 会有一系列的基因表达, 在哺乳动物, Pax 6 的表达仅 局限于CNS, 在神经管中也主要在腹侧区域。在 Renoncourt 的实验中发现, RA 诱导后, ES 细胞分化的 EB 中表达的为 Pax 6 而非 erbB 3, 说明 ES 细胞分化的神经元是 CNS 型而非周围(PNS)型。他们的实 验中, 在 RA 诱导后 7 天, 至少 60% 从 ES 细胞分化来的神经细胞是 CNS 型的。以RT-PCR 测到 ChA T 的 mRNA。ES 细胞系分化的神经细胞表达主要有 CNS 的抑制(GABA) 及兴奋(谷氨酸盐) 神经递 质。同时, Trk 基因的表达也有上升。 Wnt-1 和 MA SH1 是胚胎早期发育时可表达的神经基因，Wnt-1 可以在 RA 诱导后很快表达。MA SH1 只在神经元前体细胞才表达, 在成熟神经元细胞无表达。在 RA 诱导的第 4 天 MA SH1 的 mRNA 大量表达, 但在神经元样细胞出现后其水平就很快降低。抑制性神经递质 GABA 的生物合成酶要在明显 的神经元分化后才出现。在没有 RA 的实验中, 胚体只出现很少量的神经元细胞, 而心肌细胞却相对较多。 实验证明, RA 在激活神经基因的同时强烈地抑制了中胚层的基因, 在促进神经细胞分化时阻断了中胚层

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前体细胞的分化。 由此, 一些研究设法使胚胎干细胞过度表达一些与神经发育有关的基因, 以诱导细胞向神经细胞分 化。杨靖等利用反转录 PCR (R-PCR ) 技术, 从第 12 天的 ICR 小鼠胚胎头部的 mRNA 中克隆到小鼠的 Wnt-1 的 cDNA 的编码区, 然后将该基因构件到真核表达载体上, 转染到胚胎癌细胞 P 19。在得到稳定表 达 Wnt-1 的单克隆细胞后, 发现该细胞仅经过成团过程, 就可自发分化出神经元。而且发现Wnt-1/P 19 细 胞在成团后的 6～8 天有瞬时的 MA SH21 表达, 而基因也是早期神经分化的关键原因。 P19 细胞系在 1 μM RA 和 5mM IPTG ( isopropyl B-D thiogalacto side) 的诱导下表达 Sox21、Mash21 和 Wnt-1 RNA , 而在未分化 P 19 细胞和 P 19 集落中未测到表达。 SOX 基因是脊椎动物在神经发育过程中表达的一个家族基因。爪蟾(Xenopu s) 在原肠期时, 用 chordin 诱导 SOX2 可以在神经外胚层中广泛表达。在其他动物鸡、鼠这也是早期的神经标志之一, 在早 期的神经板和神经管广泛表达。这些提示 SOX2 在这个阶段可以加强神经细胞的特性。在这之后，SOX2 的 表达仅局限在发育中的室侧神经上皮细胞层。细胞离开室侧后, SOX2 就不再表达。在分化完善和成年动物 的CN S 中也无法测到 SOX2 的表达。 SOX2 在发育的 CNS 的表达和 SOX1 和 SOX3 有很强的重叠, 而且在结构上也相似。在敲除 SOX1 后, 实验鼠的中枢使 SOX1 基因错误表达(misexpression) , 在其后的基因表达和神经细胞或前体细 胞的标志检测上均与 RA 诱导分化 P19 细胞相同。由此得出结论: 1) SOX1 基因是神经上皮细胞的一个 早期标志; 2) SOX1 基因的表达可赋予 P19 细胞神经细胞的倾向。 SOX 基因家族的成员在许多胚胎和成年组织中都有表达, 它们和某些特定的细胞系的发育和分化有 关。SOX1、SOX2、SOX3 基因在脊椎动物的胚胎表达和神经系统的发育有关。SOX2 和 SOX3 分别在 着床前和上胚层(epiblast) 时期有表达, 然后局限在神经上皮。SOX1 只在神经诱导阶段出现。

1.3.2

基因的筛选作用

为了分离出神经祖细胞, Li Ming 等将 βgeo 基因与 SOX2 基因连接, 用同源重组的方法整合到了 ES 细胞内。当 ES 细胞被 RA 诱导后, 有 50% 的细胞呈 β-半乳糖苷酶染色阳性, 而且这部分的细胞可 以表达 SOX2 蛋白。因此, 应用 G418 筛选可以去除掉 SOX2 阴性的非神经细胞。在筛选后, 绝大部分 的成活细胞呈小的、卵形体的神经上皮样细胞。这些细胞 90% 以上呈β-半乳糖苷酶染色阳性, 而且经免 疫组化确定表达 SOX1、SOX2 蛋白, 细胞巢蛋白的表达也进一步明确了这些细胞的神经上皮身份。 在没有有丝分裂素的情况下, SOX2 筛选的前体细胞在 48 h 至 96 h 可以伸展出神经元细胞样的轴 突。其神经元的标志物如 MAP2、tau 蛋白及 Ⅲ型β2 tubulin 在 48 h 后可以检测到, 与此同时，SOX2 的 表达下降。在 96 h 时，90% 以上的细胞表达神经元的标志物, 包括神经丝的重链和 synapsin 1。非神经 元的形态很少出现, 如 GFA P+ 的星形胶质细胞。在培养液加入血清或 FGF 后, 星形胶质细胞数量上升。 L i Ming 等的工作为诱导分化后的细胞分离纯化开辟了一条新路。

2 应用研究 2.1 髓鞘疾病 将 ES 细胞分化而来的定向细胞用于治疗的实验已有报道, 如将由胚胎干细胞衍化而来的少突神经 胶质细胞移植到髓鞘缺陷型(myelin-defieient, MD) 大鼠胚胎的大脑脑室中, 这些细胞会广泛分布，并形成 髓鞘环绕在宿主的神经轴突周围。髓鞘缺陷型大鼠是人类遗传性髓鞘疾病( Pelizaeus-Merzbacher disease, PMD) 的模型, 进一步的工作便将衍化胶质细胞移植至动物模型的脊髓, 发现髓鞘生长良好。由于形成髓 鞘的是胶质细胞, 在中枢神经系统主要是少突胶质细胞, 所以这些实验又涉及到胶质细胞选择性培养。 Brustle 等将 ES 细胞积聚为胚体 EB, 由 Okabe的 ITSF 富集神经前体细胞, 然后细胞在含有 FGF2 和 PDGF (血小板衍化生长因子) 的培养液中传代，后者被认为可促进胶质前体细胞增殖。细胞由圆形变 成双极细胞, 对单克隆抗体 A2B5 免疫反应阳性，而该抗体是识别胶质前体细胞在细胞膜上表达的典型抗 原决定蔟的。在生长因子撤除后, 细胞分化为少突胶质细胞和星形胶质细胸。在此后 4 天，38.5±5.8%的

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细胞对 O4 免疫反应阳性, 并且显出少突胶质细胞的多极的形态特征; 与此同时, 35.7±6.4% 的细胞表达 星形胶质细胞的标记(GFAP) , 并呈现星形胶质细胞扁平的形态特征。延长生长因子的撤除时间, 如超过 5 天, 会更促进少突胶质细胞的分化, 并有诸如 CNP 之类的髓鞘蛋白的表达。 Su Liu 等仍用以“4- /4 + ”RA 诱导方法, 8 天后 ES 细胞形成胚体(EB) , 再用 0. 25%胰酶消化打散, 然后转至 SATO 培养液, 该培养液是 DMEM 加入了神经营养因子-3、胰岛素、睫状神经营养因子、转铁 蛋白等, 有利于神经胶质生长。4 天后, 轻轻摇晃培养皿, 使黏附松散的少突胶质细胞悬浮, 而星状胶质细 胞则仍然黏附在培养皿上。悬浮的细胞被转移到另一个 SATO 培养皿里, 两天后再次转移。这样就可以得 到较纯的少突胶质细胞以供移植之用。并且在体外就将这些细胞用 lacZ 转基因、BrdU rd DNA 标记和荧 光技术标记这些细胞。 Su Liu 的脱髓鞘动物模型的制作是选用大鼠，将第 10 胸椎(T 10) 椎板切除, 将0. 1% 溴乙锭(EB) 或 0. 9% 的溶血卵磷脂在立体定位下, 显微注射至背侧脊柱0. 5mm 深。3 天后, 脱髓鞘部位就移植诱导后的 ES 细胞。9 天后组织学检查可见移植部位的脊髓有髓鞘包裹。

2.2 亨丁氏病 (Huntington’ s disease) Jonathan 等在 1996 年首次将 ES 细胞用于神经退行性疾病模型的治疗实验。他们在脑立体定向仪引 导下, 向SD 大鼠右侧新纹状体注入喹啉酸, 7 天后, 这些鼠重新麻醉, 在立体定向仪支架上以10μl Hamilton 注射针向病变部位注入 5μl RA 诱导的 ES 细胞悬液, 细胞量为 100 000～1 000 000 个。从细胞 移植的当天, 即给予环胞腺素A , 以防止免疫排斥。移植后 6 周, 取出大脑, 多聚甲醛固定。标本给予组 织化学(Nissl & AchE) 染色及免疫组化检查, 免疫标记有: 神经元特异性烯醇化酶(NSE) , 神经元特异性管 蛋白, 鼠Thy1, 2 及GABA。检验发现这些染色均为阳性, 但是神经树突是否长入周围组织却无法鉴定, 因 为唯一可以将移植树突从宿主中鉴别出来的标记是神经元特异性微管蛋白, 但是它却没有种属特异性。为 了进一步确定细胞移植后可以保持分化的表型, Jonathan 等还将未经 RA 诱导的 ES 细胞移植入大鼠的 新纺状体, 结果是这些移植细胞N SE 和AchE 染色阴性的比率要比RA 诱导过的细胞大得多。

2.3 脊髓损伤 对脊髓损伤的细胞治疗主要作用有两点: 一是替代损伤的神经元, 二是修复损伤部位的髓鞘。1999年, McDonald 等依然采用“4-/4+”法RA 诱导 ES 细胞, 胰酶将胚体消化, 将打散的细胞移植入大鼠脊髓压 迫的模型中, 发现这些细胞不但存活, 而且还分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元, 并且从损伤处 向远端迁移 8mm。进一步应用步态分析仪来分析, 发现移植胚胎干细胞组比对照组(移植成年大鼠的大脑 皮质的神经细胞) 后肢的负重有较好的恢复。

2.4 其他 由于 ES 或 EC 细胞具有分化能力, 而且还易于基因操作, 所以 Nakao 等将胶质源性生长因子(glial cell-derived neur trophic factor, GDNF ) 基因导入 EC-P 19 细胞, 并测定其分泌量和活性, 然后将基因修饰 的 EC 细胞经 RA 诱导 48 小时, 移植到帕金森病的大鼠模型的黑质纺状体中。4 周后, 免疫组织化学显 示 GDNF 细胞显示了神经细胞的标志, 而且没有过度生长。移植细胞分泌的 GDNF 阻止了多巴胺(DA) 神经元的死亡, 而且使损伤 DA 神经重新恢复表达酪氨酸羟化酶( tyrosine hydroxylase) 以及促进神经元 的树突生长。这些在体实验不但为将来神经系统疾病的攻克奠定了基础, 而且还发现了体内微环境对细胞 的影响。这种影响也起到诱导分化的作用, 即在诱导后的 ES 细胞分化为适合环境所需要的细胞。但这样 的结果的机制尚不明确, 体内体外哪方面作用为主, 或者还有其他的因素参与, 都可以进一步研究。

3 展望 神经系统的许多疾病都是严重危害人类健康和生活质量的, 这些疾病除上述的帕金森病、亨丁氏病和 髓鞘疾病外, 还有阿尔海默氏症(Alzhermer’ s disease, AD ) 和脑中风后遗症等, 这些疾病的共同特点就是 都有原发或继发的神经细胞损害; 中枢神经系统的外伤也是神经细胞损伤的重要原因。过去的观念是神经

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元由于没有再生性, 便造成病人部分中枢神经系统功能的永久丧失。虽然上个世纪 90 年代神经干细胞的 发现, 使人们转变了观念, 但是人类对神经细胞的损害仍缺乏有效的治疗方法, 一此药物可以缓解症状, 但不能阻止疾病的发展。 细胞治疗是近年来的希望所在: 有特殊功能的细胞, 如诱导分化出的神经细胞或经基因修饰、可以分 泌生长因子的载体细胞, 在脑立体定向仪的帮助下, 注射到中枢神经受损部位, 然后继续生存、衍化，发挥 功能, 达到替代治疗作用。其中神经干细胞移植研究成为热点。但是神经干细胞的应用存在局限: 1) 来源 困难；2) 取流产胎儿亦不容易, 即便取流产胎儿的神经干细胞来移植, 依然存在免疫排斥的问题。 而从既往的研究资料和成果来看, 胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化以及体外扩增都是可以解决的。 ES 细胞的来源亦不成问题, 在免疫排斥方面, 体细胞核转移(SCNT) 是解决这一难题的关键技术。在 SCNT 的动物研究中, 研究者将一个正常的动物卵细胞去除细胞核(含染色体的细胞结构) , 存留在卵细胞 内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质。而后, 在非常精细调控的实验室条件下, 将单个 体细胞(除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞) 与除去核卵细胞放在一起, 使两者相融合。融合细胞以及 其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能, 因此是全能性的。这些全能性细胞不久将形成胚囊, 从理论上 来说, 可利用胚囊的内细胞群来建立多能性干细胞系。 用以上方法获得的人胚胎干细胞, 由于与病人的基因型完全相同(即病人体细胞的基因型) , 所以不会 产生通常器官移植中的免疫排斥反应, 修复的组织或器官将良好地履行职责, 无需使用免疫抑制剂, 但是 仍存在以下问题: (1) 分化条件尚不完善。因为由胚胎干细胞形成的胚体包含了三个胚层的细胞, 如何从这些细胞中获 取特定的神经细胞还非常困难。这一步主要是要明确使细胞向特定细胞分化的基因和环境信号。 (2) 如果上一步的难题没有解决, 将面临分离纯化所需要的细胞问题。如果将分化细胞中的杂细胞， 如成纤维细胞也移植到中枢神经, 一定不会有好作用。 (3) 小鼠胚胎干细胞注入在成年鼠皮下可以形成畸胎瘤, 是否分化后的种子细胞在宿主体内不具有致 瘤性还不得而知。Liu 等在移植实验中没有发现肿瘤形成, 他们认为 RA 是强烈神经诱导信号, 可限定细 胞向神经细胞分化, 而阻止其他不正常组织的形成。但是能否形成肿瘤需要长期观察, 短期实验的结果尚 需进一步验证。 总之, 将ES 细胞应用于临床, 还需要大量的工作。但是, 我们相信终有一天随着关键性问题的解决, 它 在神经系统治疗方面乃至整个生命上的价值将得到体现。

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