Neurobiology Chapter 2-2

第三节 几种电压门控离子通道 在本节只讨论电压门控基因家族中的几个成员。

图 2-16 钠通道亚基结构 A．插入膜中的通道横断面，通道复合物由一个 α亚基和两个较小的 β1 和 β2 亚基组成。所有 3 个亚基的胞外表面都 存在大量糖基化部位，以及 α 蝎毒(ScTX)和 TTX 结合位点。α 亚基的细胞内面存在大量磷酸化位点。β1 亚基与 α 亚 基以非共价键连接，β2 与 α以二硫键连接；B．胞外平面，示 α亚基中间的离子通道。

1 电压门控 Na 通道 1.1 钠通道的结构 电压门控 Na 通道（voltage-gated sodium channel， VGSC）是首先被确定了氨基酸全序列的通道，关于 它的研究资料也多些。哺乳动物的脑和心肌的 Na 通 道分子是由 1 个大亚基（α亚基）和两个小亚基（β1 和 β2）构成（图 2-16）。但骨骼肌 Na 通道只由 α和 β1 亚基构成。还发现有些 Na 通道（电鱼电器官）无 小亚基。α亚基是一种跨膜的多肽，只将 α亚基重组 到人工膜上便可用膜片钳记录到单个 Na 通道电流， 因而被认为是 Na 通道的主体。其外表面的位点与糖 链附着，并可与神经毒结合；其细胞内表面上的位点， 可通过 cAMP 依赖性蛋白质激酶进行磷酸化。至于在 有的 Na 通道尚附带有 β亚基，则它们可能只起调控 作用。 Na 通道的 α亚基的分子量约 26 万， 是由约 1,820 个氨基酸残基构成的单肽链，含 4 个疏水重复区 图 2-16 Na(A)、Ca(B)和 K(C)通道分子结构 （MI-IV），每区中有 6 条疏水的穿膜 α螺旋（S1-S6）， 在 S5 和 S6 之间尚有 1 个 P 段（pore-forming segrnent）。它从膜外面进入膜中，但不穿透膜而中途折返，回到膜外面。露在胞膜外和内侧面的连接在二 条穿膜 α螺旋之间的亲水环共 6 条。S1 与 S2 螺旋的一侧多为带电荷残基，微孔道便被认为是由 4 个重复 区中的 S1 和 S2 螺旋围成（图 2-17、18）。

1.2 钠通道的功能 感受点和活化 关于 Na 通道的感受点（sensor）如何依膜电位的变化而调控通道闸门使之开放或关的问题，Hodgkin 和 Huxley 在提出离子通道模型时就曾设定，膜的去极化或复极化时所发生的电场变化可趋使离子通道中 的荷正电的粒子分别向膜外和内侧方向移动，从而使通道开放和关闭，他们还预言，这种正电荷在膜内的 移动应能给出小的电容电流，即闸电流（gating curient），后来，在 20 世纪 70 年代借助精密的电压钳装置， 11

记录到了这种闸电流，并发现当去极化持续时间较短(如 2～4ms 以内）时，在去极化开始和结束时分别记 到了形状相同，但方向相反的闸电流；当去极化持续时间较长足以使 Na 通道转入灭活关闭态时，则闸电 荷的归位便被推迟，只有当膜电位复极化，Na 通道从灭活态脱出，闸电荷方移动归位。

图 2-18 钠通道蛋白 4 个同源域的 氦基酸序列和域结构 A．1 820 个氨基酸的序列组成了 4 个同 源域：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 和Ⅳ。第一域的范围 从残基 111～419，第二个域从 555～ 807，第三个从 989～l 28l，第四个从 l 311～l 587：每个同源域都由 6 个跨膜 段组成，S1～S6；B. 4 个同源域的氨基 酸序列 每个域的 6 个跨膜段均被标 示．S4 被认为是电压感受器，中间存在 一些带正电荷的残基(R：精氨酸，K：赖 氨酸)。图中残基的数量往右边列出，间 断线表不具有最大同源性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 非同源区用实线表示，并用括号中的数 字表示了非同源残基的数量。框中为所 有 4 个域中的可保保守替换和相同的残 基。

图 3-9 钠通道 S4 滑动螺旋电压敏感器 A．钠通道 S4 域的“球和柄”模式图，黑色环表 示每个氨基酸残基的 α 碳原子，带有字母的环表 示氨基酸单个字母密码并显示出侧链的投射方 向：B． ，C．α螺旋对电压变化(△V)产生的跨膜移 动。在静息态(B)，跨膜通道蛋白侧链中所有正电 荷与负电荷稳定配对，通过静息电位(Vm)负的固 有电位使螺旋稳定在这个状态。当去极化时，螺 旋以 60°角向外旋转 5 Å，这使得未配对的负电 荷留在膜的内侧面(C)，而未配对的正电荷留存膜 的外侧面(引自 Smith，1996)

在 S4 区，间隔两个残基的带正电荷的碱性氨基酸在 α螺旋的外侧形成了螺旋状排列，S4 跨膜段中每 个正电荷都与邻近螺旋的负电荷配对排列。于是 S4 被认为是 Na 通道的电压感受点，接着 Gatterall （1988） 又提出了有趣的滑动模型。认为在静息电位时，细胞外侧的正电位维持了 S4 螺旋稳定的构型。当细胞外 的正电荷减少时，维持膜内螺旋的力减小，螺旋发生旋转其结果是每个电荷向外移动至其邻近的电荷位置， 重新处于稳定态。这种旋转的净效应是将 S4 螺旋在膜内侧的一个电荷移至膜外侧，因此，一个电荷可从 膜的一侧移至另一侧，而不需要蛋白质的跨膜移动(图 2-19、20)：大约有 6 个电荷伴随钠和钾通道的门控 而发生移动。通道衬里的 4 个亚基或 4 个域中的每一个都有 S4 段，并且打开通道需要 4 个域全部移动。 当然，实际上蛋白质的运动可能并非如此简单。 灭活化 灭活化是离子通道的另一种关闭态，当给轴突施加去极化脉冲，以电压钳方法测定动作电流时发现的 12

Na 电流灭活可分为以数毫秒衰减（快灭活）和数百毫秒 衰减（慢灭活）两个过程。快灭活的机制应与 K 通道的 相同，由联接重复区 III 和 IV 的胞内环形成的“球”堵住 通道内口而实现的（见图 2-15）。至于慢灭活机制目前 尚不清楚。 实验还表明，Na 通道的开放概率不只与膜去极化 持续时间，也与其幅度大小密切相关，即 Na 通道开放 概率是去极化持续时间和水平依赖的。一般说来，在一 定范围内去极化幅度越大，开放概率也越高，并且以去 极化持续 2ms 时的机率为最高。 离子滤过器 每个重复区中夹在 S5 和 S6 之间的 P 段构成微孔道 的离子滤过器，实验表明，在 I，II，III 和 IV 重复区中 的 P 段中各有一个残基对通道离子选择性最为重要，它 们依次是门冬氨酸/谷氨酸（D/E）、谷氨酸（E）、赖氨 酸（K）和丙氨酸（A）。在 Ca 通道分子的 P 段中的 4 个相应残基都是 E。不难看出，两者的区别仅在于重复 区 III 和 IV 中的相应残基，在突变实验中如只将 Na 通 道重复区 III 的 K 换成 E, 则该通道便出现了一定程度的 Ca2+ 和 Ba2+ 的通透性。当将重复区 III 和 IV 的 P 段的 K 和 A 换变成 E 即和 Ca 通道的一样时，则其离子通透 性也成为和 Ca 通道的一样，即对二价正离子的通透性 大于对一价正离子的，看来，重复区 III 的 K 在鉴别 Na+ 在其中可能起协调作用。

图 2-20 门控电流 a．在电压改变以后离子通道蛋白中由电荷所致的 门控电流的产生。B.电压跃变以后。门电流先于离子 电流。C.轴突中门控电荷运动的电压依赖性与钠通道 电导的电压依赖性的比较。

和 Ca2+ 中起着最为重要的作用，重复区 IV 的 A

2 电压门控 Ca 通道 依钱（Tsien）等（1988）建议，将电压门控 Ca 通道（voltage-gated calcium channel，VGCC）分为 T（Transient），L（long lasting）和 N（Neither T，nor L）三种类型，后来又加上 P 型，共 4 型。它们存在 于肌细胞、其他类型的细胞和神经元中。在神经元中，它们对于突触前终末神经递质的释放发挥着重要作 用。如我们所知道的，在轴突膜的始段它们能够发挥部分适应性作用。此外，它们还少量存在于树突、生 长锥和神经元胞体中。 细胞膜的内外侧分布的 Ca2+浓度是相当不同的。细胞外的浓度通常为 3mmol/L，而细胞内游离的 Ca2+ 的浓度很小，通常小于 10-4mmol／L。跨膜通道的开放能够引起 Ca2+迅速内流，使胞内 Ca2+的浓度发生显 著的变化。 钙通道对于膜电压的变化极为敏感。使用膜片钳技术的研究表明，尽管钙通道和其他上述所讨论的那 些通道一样，也存在快速开放和关闭状态，然而其机制却远比简单通道的开、关两种状态要复杂的多，它 似乎还具有一种中间的状态。每个通道的开、关循环都需大约 0.6ms 的时程。在一小片膜上进入这个循环 的通道的数量依赖于跨膜电压。随着跨膜电压的降落，越来越多的通道被激活，导致 Ca2+流动增加。 在生理情况下，当外部 Ca2+的浓度大约达到 3 mmol／L 时，每个通道允许通过的电流大约为 0.06 ppA。 很容易算出，在这种情况下每秒钟通过一个通道的离子的数量为 180 000 个。尽管每单位面积钙通道的数 量是相当少的，例如在蜗牛心肌神经元上的 Ca2+的密度为 4～60 个／μm2，然而对于迅速提高细胞质内游 离钙的浓度来说是足够大的。 钙通道是具有高度选择性的通道，这点具有至关重要的意义，它仅允许 Ca2+在通道中的流动，而不像 Na+和 K+那样是混合通过通道。众所周知，细胞外液中存大量的 Na+和 K+。细胞外 Na+的浓度为 3mmol／ L，Na+的浓度为 145 mmol／L，两者相差极为悬殊。钙通道的这种高度选择性的机制现在尚不清楚。 13

钙通道除了对膜电压的变化极为敏感外，它们还易受许多递质和药物的影响。迄争为止所检测的所有 成分都对该通道有降低其活性的作用(下调)。这些成分包括 γ 氨基丁酸、5-HT、生长激素释放抑制因子 (somatostafin)、NE、脑啡肽和 DHP(1，4-dihydrop~a-idine)。最后一种成分曾被用于从兔的骨骼肌中分离钙 通道， 应用提纯的 DHP 受体片段作为寡聚核苷酸探针克隆了受体 cDNA，得到了一个由 1 873 个氨基酸组成 的蛋白。我们应该想到，从骨骼肌中得到的和在神经元中得到的钙通道在细节上应该存在一定的差异。经 检查发现这个多肽与钠通道极为相似，与钠通道一样，它由 4 个同源域组成，每个域含有约 300 个氨基酸， N 端和 C 端都位于膜的胞质-而。与大鼠钠通道蛋白相比，氨基酸序列的同源性主要表现在以下方面： 同源域 1：32％残基相同；加上保守替换，则有 62％相同。 同源域 2：35％残基相同；加上保守替换，则有 59％相同。 同源域 3：37％残基相同；加上保守替换，则有 60％相同。 同源域 4：32％残基相同；加上保守替换，则有 6l％相同。 全部序列的同源性为 35％，如果加上保守替换部分则为 55％。对多肽的亲水性分析还显示它与钠通 道有很大的相似性。每个同源域都南 6 个疏水跨膜节段组成，命名为 Sl，S2，S3，S4，S5 和 S6。每个同 源域的 S4 段都有一个带正电荷的 Arg 或 Lys 残基组成的有规律序列(Arg/Lys-X-X-Arg／Lys)。X 为非极性 残基，这种形式在钠通道和钾通道蛋白的 S4 段同样存在(表 2-2)。一般认为，与其他的离子通道相类似， 这种由正电荷断面组成的调节序列可能是电压敏感器。最后，与其他的电压依赖性通道相似的是 s5 和 s6 之问的多肽链可能是一种反式 B 折叠结构，它以“发夹”(hairpin)形式插入膜中。它对于通道孔的形成和决 定离子的选择性具有重要作用。通道孔本身的有效直径大约为 6Å。进一步的研究还揭示了通道蛋白细胞内、 外域的作用。 表 2-2 TM4 中的氨基酸残基

一个字母代表个氨基酸：带正电荷的侧链氨基酸用黑体表示。H：组氨酸；K：赖氨酸；R：精氨酸

现已证明钙通道由相对分子质量大于 2.12 ×105 的蛋白组 成，这个通道蛋白被认为是 α1 亚基。它与另外 3 个其他的蛋 白有关：一个是细胞内的 β亚基(5.7×104)；另一个相对分子质 量是 2.5×104 的跨膜 γ亚基；第三个蛋白是由一部分位于细胞 外，一部分跨膜的由二硫键连接的二聚体 α2／δ亚基(1.25×105) 组成。图 2-21 示钙通道结构模式图，它的 4 个亚基共组成了| 一个共同的功能整体，表现出具有生物药理和生理的通道特 性。 T 型在多种细胞发现，参与神经元的重复发放。N 和 P 型 只见于神经系统，参与递质释放。L 型参与神经肽类的释放和 海马神经元的 LTP 现象。在电压门控 Ca 通道分子结构的研究 中 L 型的资料最多，它由 α1、α2、β、γ亚基构成，其 α1 为通 图 2-21 骨骼肌中的钙通道 道实体，分子量约 21 万，微孔道由此亚基围成，它与 Na 通 α1，β 及 α2／δ 亚基构成了钙通道，α2/δ 道 α亚基的结构基本相同，但 Na 通道的每个重复区中民的碱 聚合体体通过二硫键（S）连接在一起 性氨基酸残基数为 4、5、5 和 8 个，Ca 通道的为 5、5、5 和 4 个，这可能是导致两个活化阈不同的原因。民也被认为是电 压感受器的所在地，至于灭活化机制可能与重复区 I 的 S6 和其他胞内外连接环有关。现已发现的 α1 亚基 14

至少有 5 种，这可能是 Ca 通道多样化的原因。

3 电压门控 K+通道 已发现的 K 通道的种类最多，其中电压门控 K 通道有： （1）延搁整流 K 通道（delayed rectifier）Hodgkin 等在乌贼巨轴突发现的 K 通道属此类型。由去极化 激活，与电压门控 Na 通道相比活化速度较慢，并且不易灭活，其时间常数由数百 ms 至数十 s 不等。它的 功能为限制 Na+ 的内流，以缩短动作电位持续时间。 （2）异常整流 K 通道（anomalous recttifier）整流方向与前者相反，即由超极化激活，去极化时灭活。 故又称内向整流 K 通道（inward rectifier）。由此通道形成的电流即使在胞外[K+]较胞内的低 2 个数量级时 也很大。看上去这点也属“异常”。 （3）A 型 K 通道 最初由 Conner 和 Steverls 在海兔神经元记录到而命名的 K 通道。去极化至-65mV 时 即被激活，灭活很快，至-45mV 时便完全灭活。由于活化后约 1ms 其灭活闸便启动，故又称快瞬时 K 通 道（fast，transient K channel）。在测定此通道时最好先超极化至约-80mV，再去极化激活。如前所述有的 神经元的动作电位有一超极化时相，当再次去极化而兴奋时，此通道被激活，以延迟去极化的达阈电位时 间。很显然，依此机制可控制神经元的发放频率。 （4）Ca2+ 激活 K 通道（Ca-activated K channel）由去极化激活，但还受到胞内[Ca2+]的调控，即在胞 内 Ca2+达 umol/L 数量级也可被激活，并且随胞内[Ca2+]的上升。其激活电压向超极化方向移动，往往见不 到灭活过程，它的功能也是调控冲动的发放频率，此通道的另一个特点是电导大，一般在 200pS，因此又 与肌浆网中的 K 通道共称最大 K 通道（maxi K channels）。此通道的阻遏剂为 TEA 和由蝎毒纯化的蝎神经 毒素（charybdotoxin）等。

3.1 Ca2+ 激活 K 通道 在大多数细胞，如已广泛用于膜电流的电压钳制研究的许多软体动物神经元的大细胞体中，由钾所携 带的总外向电流呈现出一种与在枪乌贼轴突(squid axon)中所见的非常不同的稳态；I-V 关系(我们在此使用 的“稳态”这个术语是指在去极化脉冲发生之后数十或数百毫秒所测量的持续的非失活电流)。此电流-电压 曲线在去极化的电压范围内有一个特征性的“N”形态(图 3-12a)，因为它是若干性质不同的电流成分的总合 (图 2-22b，c)。当用一种与钙紧密结合的药剂；如 EGTA 注入细胞内或通过钙通道的药理学阻断以阻止去 极化期间的钙进入时，则 I-V 曲线(图 2-22b)看上去和枪乌贼轴突中延迟整流型钾电流的 I-V 曲线相同。 对正电压时稳 I-V 曲线的形态起重要作用的另一外向电流成分，是一种通过阻止钙进入或结合细胞内 钙而被阻断的成分。 它是一种钙依赖性钾电流(calcium-dependent potasmum currents)。它的 I-V 曲线(图 2-25b) 是由总外向电流减去延迟整流成分而获得的。这种电流部分地是被去极化作用本身所激活，但也可被去极 化电压脉冲期间进入的钙激活(图 2-22c)。钙激活的钾电流的电压依赖性反映了钙电流的电压嵌赖性，这自 然是由于需要钙进入而产生的，钙通过电压依赖性钙通道进入，而这对钾电流的激活起重要作用。当电压 接近于 ECa 时，钙进入的驱动力减小，因此钙依赖性钾电流的激活也减少(其他的钙依赖性细胞内过程可能 表现为类似的电压依赖性)。对细胞内钙的这种需求也解释了为什么通过去极化期间阻断钙进入可消除此电

图 2-22 外向电流的不同成分 a.在大多数神经元的胞体中，当内向电流被阻断时．对外向电流的波峰而言．电流一电压关系具有持征性的 N 形 态。b.外向电流的两种成分。c. 图示说明两类钾通道的激活。

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流。然而，通过钙的细胞内注入或用生理性处理引起细 胞内贮存钙释放，仍可诱发这种电流和其他钙依赖性细 胞内事件。 电压钳制电流的动力学和药理学研究提示，可能存 在着钙依赖性钾电流的一些异源性(hetergemty)，但这种 异源性的程度只是从单通道实验以及最近从我们将在 本章稍后描述的分子克隆中才变得明显起来。许多细胞 类型含有大电导的钙依赖性钾通道(所谓的巨大通道， maxi channel)，但是也存在着较小的通道，甚至在大钾 通道中也存在异源性。例如，在大鼠大脑胞浆膜标本中， 军少存在两种可根据它们的门控动力学(图 2-23)和药理 学加以分辨的独立的大通道。单一细胞中可能存在一种 以上类型的钙依赖性钾通道是显而易见的。但这种异源 性的功能意义仍待确定。由于钙依赖性钾电流(以及延迟 型整流器)有助于动作电位的复极化，并且对控制重复放 电频率的峰电位间电流也起重要作用，因此不同的钙依 赖性钾通遭的不同动力学特性可能使得它们担负着性质 不同的功能作用。

3.2 突变的苍蝇和对钾通道的探索

图 2-23 不同类别的钙依赖性钾通道 哺乳类动物大脑的胞浆膜片断中至少可以看到 4 种 性质不同韵钙依赖性钾通道。在此显示其中的两种。它 们具有非常相似的单通道电导(240 pS)，但在门控动力 学方面是不同的(注意 TO 和 TC 的差异)。过些记录来源于 重组入人工磷脂双层膜中的钙依赖性钾通道.

在早期由于没有合适的特异结合的阻断剂，关于 K 通道分子结构的研究较为落后。在成功地克隆了颤 抖型(shaker)突变型果蝇的 K 通道基因后方有转机。以 shaker 基因作为探针，从果蝇 DNA 库中钓出了多种 K 通道，它们可分为 shab，shaw 和 shal 三个 K 通道基因族，其中 shal 所表达的通道的电流与 A 型 K 通道 的相似，shab 和 shaw 的电流即是延搁整流 K+ 电流（图 2-24）。后来又用 shaker 基因作为探针从哺乳动物 钩出很多 K 通道关连基因。

图 2-24 颤动子突变。在正常和颤动子苍蝇(a)中的动作电位(b)和钾电流(c)。 电压门控 K 通道分子只由上述电压门控 Na 和 Ca 通道分子中的一个重复区构成。同样经 6 次（S1-S6） 穿膜和在 S5 与 S6 之间夹一个相当于 Na 通道 P 段的 H5 段。至于整个通道，则被认为是由 4 种相似分子围成。 通道的活化闸门也是由 4 个 S4 构成。经鉴定，如将通 道分子的 N 未端除去，则灭活过程消失，如将切下的 N 图 2-25 K 通道灭活化的闸门机制的“球与链” 未端段注到胞内，则被切除了 N 未端而失去灭活过程的 K 通道可再获得灭活过程。这提示灭活闸门在 N 未端， 模型球带正电荷。通道内口带负电荷。 16

可用由 Armstrong 提出的“球与链”模型说明（见图 2-25）。

图 2-26 钾通道是功能性四聚体 a：如同钠和钙通道的各个结构域一样，电压门控性钾通道的每一单体，据认为具有 6 个跨膜区(S1-S6)(见图 2-26)。四 个单体(I-IV)集合在一起形成功能性通道。修改自 Ranganathan(1994)。b：用电子显微镜观察的纯化颤动子蛋白。注意明显的 四边对称性。

内向整流 K 通道的分子结构直到 1993 年方被阐明，它由两次穿膜螺旋和夹于其间的 H 段构成，即只 相当于电压门控 K 通道分子的后半部，它没有闸门和电压感受器（H5）结构。

第三节 转运体 神经元膜是由脂质双层构成，在其中分散地镶嵌着多种蛋白分子，在跨膜物质交换中那些脂溶性和非 极性物质便可简单地通过脂质双层，称单纯扩散。但对水溶性和极性物质说来就必须在膜中有特殊道路方 可跨膜移动。事实上，为它们提供道路者为跨膜大蛋白分子，大致可分为两类，即如前所述的离子通道蛋 白分子和被称为转运体（transporter）的蛋白分子。两种分子中都有容许物质通过的微孔道，但前者开放时 其微孔道是贯通的，后者活动时其微孔道的内口与外口轮流开放，即总有一侧处于关闭状态。在转运体中 顺浓度差转运物质者称载体，逆浓度差转运物质者称为泵（图 2-27）。

1 离子泵 在静息状态下 Na+、K+和 Cl- 的跨神经元膜浓 度梯度差都稳定地维持在约 1 个数量级水平，但 Ca2+ 的膜内外浓度差则通常高达约 4 个数量级； 另一方面在胞膜每发生 1 个动作电位便有一定数 量的 Na+和 K+（在有些细胞还有 Ca2+）顺各自的 浓度梯度经各自的通道流过胞膜，据计算在无髓 鞘神经纤维轴突膜的每个动作电位平均约 2 万个 图 2-27 离子通道和转运体分子的模式图 2 离子/μm 流过胞膜。因此随神经活动的进行，势 必有相当数量的离子顺流越过胞膜，从而降低它们的跨膜浓度梯度。于是，在建立动作电位的双离子通道 模型的同时，Hodgkin 和 Keynes（1955）又提出了耗能做功，逆依度梯度跨膜转运 Na+ 与 K+ 的 Na+-K+泵 模型。此模型的活动被认为是维持跨膜离子浓度梯度的机制。1957 年 Skou 便发现，此泵即是胞膜中的 17

Na+-K+ATP 酶，而 Kawakamii 等（1985）又用基因克隆技术确定了此酶的一级结构。

1.1 Na+-K+ATP 酶 虽然在静息状态时膜对 Na+ 的通透性比 K+ 低，但驱动力是高的，因此 Na+ 的内流近似等于 K+ 的外 流。K+的通透性虽然高，但它的驱动力低，因此有一个稳定的 Na+内流和 K+外流，这种流动在短期内不会 对膜电位产生影响，但如果没有 Na+-K+ 泵的作用，一段时间后，膜内外的离子浓度梯度会发生变化，电 位将趋于零。因而静息电位的梯度是由 Na+-K+泵(Na+-K+ ATPase，又称 Na+-K+ ATP 酶)来维持的。 泵对 Na+和 K+的转运是不平衡的，每水解一分子的 ATP，通常转运 3 个 Na+出细胞，转运 2 个 K+入细 胞。这种不平衡的转运产生了一些重要的后果。首先产生了净电荷的跨膜转运。因而说 Na+-K+ 泵是生电 的，由泵产生的电流将使膜超极化。泵对膜电位的贡献依赖于膜的电阻，一般细胞约为 5～10 mV。其次， 由于 Na+和 K+的跨膜被动移动是不等的，为了维持浓度梯度，Na+通过离子通道的内流必须等于泵产生的 外流。同样 K+的外流必须等于由泵引起的 K+的内流。所以，在静息状态下，被动的 Na+ 内流约是 K+ 外 流的 1.5 倍。第三，由于可通透离子在电化学梯度的作用下跨膜作被动转运，但细胞内的大的阴离子不能 做跨膜转运，如果没有泵的作用，离子本身的分布将造成细胞内的渗透压高于细胞外，水将逆着渗透梯度 进入细胞内。由于存在 Na+-K+ 泵的有效转运，平衡了细胞内外离子的不均衡分布，使细胞维持稳定的 渗透压。 Na+-K+ 泵是一种 Na+-K+ ATP 酶。纯化的酶由两个亚基组成。催化亚基(α亚基)相对分子质量约为 1.0×1 05，由 l 016 个氨基酸(羊肾)组成。另一个是 β亚基相对分子质量为 5.5×104，是一种糖蛋白，糖类占 20％。β亚基的功能目前尚不清楚，由于它紧密耦联在 α 亚基上表明它对 α 亚基发挥 ATPase 功能是至关 重要的。 应用 α亚基片段制成寡聚核苷酸探针，对羊肾和电鱼电器宫中获得的 cDNA 文库分析表明，两种动物 组织中获得的 α多肽链中有 85％的氨基酸是同源的，这种显著的保守性表明羊和电鱼的共同祖先存在于 4 亿年前。 目前 α亚基的氨基酸序列已通过基因克隆确定，它存在 8 个具有三级结构的跨膜区，在跨膜第 4 和第 5 区间有一个大的胞液区，其间含有 ATP 结合位点和 ATPase 的水解部位(图 2-28)。推测离子通道就位于 α 亚基跨膜螺旋第 3 和第 4 区之间。Na+ 和 K+ 在胞液区的结合部位已经确定，但在细胞外区域的结合部位 尚未得到确定。

图 2-28 Na+-K+ 泵工作原理模式图 A．图示 Na+-K+ 泵为二聚体，由两个亚基组成：一个大的催化亚基，或称 α亚基；另一个为小的糖蛋白 β亚基。催化 亚基的主要部分位于胞质，在胞质域有 ATP 脱磷酸位点和 ATP 的 γ磷酸连接位点。α 亚基的胞外域有强心甙位点(cardiac glycosides)，如哇巴因(ouabain)和洋地黄(digitalis)；β 亚基很小，它的外面附着一个短的寡糖链，它被认为对强心甙敏感。 B．Na+-K+、ATPase 的催化亚基。有 8 次跨膜螺旋结构，最大的胞质域(442～789 残基)提供了磷酸结合位(Asp369)和 ATP 水 解位(Lys501)。跨膜螺旋 3 和 4 间的膜外表面色氨酸残基(Trp310)被认为是与强心甙作用的位点。 18

目前认为 Mg2+、ATP 结合到催化亚基 501 位的赖氨酸上，通过脱磷酸化(γ磷酸)将磷酸根转移到 369 位的天冬氢酸上。脱磷酸化过程中释放的能量至少导致 80 个氨基酸残基构型的强烈改变，这种构型的变 化导致其结构从 α螺旋改变成 β折叠。新的构型有利于 2 个 K+结合到 α亚基胞外域的位点上。3 个 Na+结 合到 α亚基的胞质域的位点上，而这种结合同时又使构型出现了反转，使两个结合在天冬氨酸上的 γ磷酸 释放游离出来，并驱动 2 个 K+进入到细胞内，3 个 Na+被排出细胞。在此过程中 ATP 被水解成 ADP。最 后，催化亚基重新恢复到它最初的构型。

2 载体 还在 1952 年 Widdas 在分析葡萄糖在胎盘中跨膜输送机制的研究中提出了关于载体（carrier）的概念。 Hediger（1987）又用基因克隆技术确定了 Na+-葡萄糖同向转运体（Na+-glucose cotransporter）的一级结构， 从此开始了转运体（transporter)分子结构与功能的研究。 离子泵则从水解 ATP 获能作功，逆浓度差主动地跨膜转运离子，以维持其跨膜浓度梯度的稳定。这种 转运方式被称为一次性主动转运（primary active transport），还有，如上述的转运葡萄糖的载体等虽也主动 地，即逆浓度梯度进行转运工作，但它们是从其他离子的顺电化学梯度流动中获能而转运特定溶质的。这 种活动机制称续发性主动转运（secondary active transort)。在后一机制中势必有两种或两种以上溶质参与转 运。当两种溶质为同方向时称同向转运体（symporter），如上述的 Na+-葡萄糖系同向转运体，如两者为异 向者称异向转运体（antiporter）。通常把离子泵（ionic pump）和载体（carrier）统称为转运体(transporter)， 也有人将载体与转运体作为同义语使用。 曾认为载体的转运方式有如摆渡船那样来去跨膜转运溶质，但事实上它们和离子通道相似，也是很大 的穿膜蛋白，难以在膜中以需要的速度转动。现在认为转运体与离子通道分子中都有微孔道，但两者的活 动方式不同。前者为贯通式开放，后者则是内口与外口轮流开放，即总有一侧口处于关闭状态，由此造成 转运效率的明显差异，转运体转运特定溶质的速度慢。量小和耗能高，如电压门控 Na 通道活动时所产生 的动作电位上升相的电位变化达 500V/s，每秒通过单通道的离子数达 106～108 个。据计算电压门控 K 通 道的活化能仅约 3kCal/mol；由于转运体活动时，必须轮流开放和关闭其微孔道的内口与外口，故每秒可 转送的溶质仅为 102- 104 个，而 Na+-Ca2+ 异向转运体的活化能高达 17 kCal/mol。 在细胞膜中的离子通道和转运体虽也同时容许水分子的跨膜移动，但近年来又发现了被称为 aquaporin 的水选择性通道，主要承担水分子的跨膜移动。

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