Mikrob Enumerasi.docx

LAPORAN PRAKTIKUM LABORATORIUM BIOLOGI/MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

ENUMERASI Oleh: Kelompok 1 Nama: Rifqi Gibran Ramadhan NIM: 082001700062 Asisten: 1. Annisa Nur Islami 2. Candra Dwi Anggreini

JURUSAN TEKNIK LINGKUNGAN FAKULTAS ARSITEKTUR LANSKAP DAN TEKNOLOGI LINGKUNGAN UNIVERSITAS TRISAKTI 2018

KATA PENGANTAR Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan kami kemudahan sehingga dapat menyelesaikan makalah ini. Tanpa pertolongan-Nya mungkin kami tidak akan sanggup menyelesaikannya dengan baik. Shalawat dan salam semoga terlimpah curahkan kepada baginda tercinta kita yakni Nabi Muhammad SAW. Laporan

praktikum

ini

disusun

untuk

memenuhi

tugas

praktikum

Biologi/Mikrobiologi Lingkungan. Laporan praktikum ini di susun oleh penyusun dengan berbagai rintangan. Saya juga berterimakasih kepada asisten laboratorium mikrobiologi yang telah membimbing saya selama melakukan praktikum dan dalam pembuatan laporan sehingga akhirnya makalah ini dapat terselesaikan. Dan juga tidak lupa saya ucapkan berterima kasih kepada dosen Biologi/Mikrobiologi lingkungan yang telah memaparkan materi dikelas sehingga ilmu yang saya dapatkan bertambah. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan ini masih banyak terdapat kekurangan, baik dapat dilihat dari segi penyajian data, maupun penulisannya. Kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Terima kasih.

Jakarta, November 2018

Rifqi Gibran Ramadhan

ii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ........................................................................................... ii DAFTAR ISI ......................................................................................................... iii DAFTAR TABEL ................................................................................................ iv BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1 1.1. Latar Belakang ............................................................................................. 1 1.2. Tujuan ........................................................................................................... 2 BAB II TINJAUAN PUSTAKA........................................................................... 3 2.1. Tinjauan Pustaka .......................................................................................... 3 BAB III METODE KERJA................................................................................ 13 3.1. Alat dan Bahan ........................................................................................... 13 3.2. Cara Kerja................................................................................................... 15 BAB IV HASIL PENGAMATAN ..................................................................... 23 4.1. Perhitungan ................................................................................................. 23 4.2. Pembahasan ................................................................................................ 25 BAB V SIMPULAN ............................................................................................ 30 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 31 LAMPIRAN

iii

DAFTAR TABEL Tabel 3.1

Alat dan Bahan Berat Kering………………………………................13

Tabel 3.2

Alat dan Bahan Filtrasi………………………………………….........13

Tabel 3.3

Alat dan Bahan Tes Pendugaan ………………………………...........13

Tabel 3.4

Alat dan Bahan Plate Count………………………………..................14

Tabel 3.5

Alat dan Bahan Haemositometer………………………………..........14

Tabel 3.6

Alat dan Bahan Spekfotometer……………………………….............14

Tabel 3.7

Cara Kerja Berat Kering……………………………………………...15

Tabel 3.8

Cara Kerja Filtrasi……………………………………………………16

Tabel 3.9

Cara Kerja Tes Pendugaan…………………………………………...18

Tabel 3.10

Cara Kerja Plate Count……………………………………………….19

Tabel 3.11

Cara Kerja Haemositometer………………………………………….20

Tabel 3.12

Cara Kerja Spekfotometer……………………………………………21

iv

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Mikroba dapat tinggal dimana-mana atau yang kita kenal dengan istilah kosmopolitan (tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain), serta mikroba bersifat mikroskopis, yang hanya bisa dilihat dengan menggunakan mikroskop, salah satunya adalah bakteri. Mikrobia dapat tumbuh dan berkembang dengan sangat pesat di alam. Bakteri merupakan makhluk hidup yang sering ditumbuhkan dalam medium untuk tujuan suatu penelitian. Pertumbuhan dan perkembangan mikroba berbentuk koloni-koloni yang sulit dihitung jumlah bakterinya. Setelah mempelajari bagaimana menumbuhkan suatu koloni bakteri, tentunya kita harus mengetahui kuantitas dan kualitas dari bakteri tersebut. Kualitas suatu bakteri dapat diketahui dengan melihat sifatsifat bakteri baik yang menguntungkan maupun merugikan. Sedangkan, untuk menentukan kuantitas bakteri dapat dengan berbagai cara perhitungan jumlah bakteri, antara lain dengan cara perhitungan mikroskopis langsung (direct microscopis count) dan metode hitungan tak langsung (indirect count) yang menggunakan metode hitung pada cawan (spread plate maupun pour plate). Analisis kualitatif atau enumerasi mikroorganisme dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung, dengan beberapa metode yaitu metode penghitungan dengan mikroskop (total cell count), Keruhan (turbidity), dan plate count (viable count). Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah kloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Terdapat dua macam cara atau metode perhitungan bakteri atau mikroba, yaitu dengan perhitungan secara langsung dan perhitungan secara tidak langsung.

1

Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik mikroba yang sudah mati ataupun mikroba yang masih hidup, sedangkan perhitungan mikroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik mikroba yang sudah mati atau pun mikroba yang masih hidup atau hanya untuk menghitung atau pun menentukan jumlah mikroba yang masih hidup saja, ini tergantung cara yang dipakai atau digunakan. Perhitungan langsung dilakukan dengan menggunakan suatu alat yaitu haemositometer. Alat ini memiliki ruang hitung dan jumlah sel dapat dihitung langsung dengan bantuan mikroskop. Sedangkan perhitungan jumlah mikroba dengan metode tidak langsung menggunakan metode hitungan cawan, baik metode penyebaran atau pun dengan menggunakan metode penuangan.

1.2 Tujuan Berikut ini adalah tujuan dari praktikum antara lain: 1. Untuk mengetahui beberapa metode dalam perhitungan jumlah mikroba yang hidup pada medium padat dan medium cair. 2. Mempelajari metode-metode yang digunakan dalam menghitung koloni bakteri. 3. Untuk mengetahui banyaknya mikroba yang hidup maupun mati pada suatu bahan. 4. Untuk mempelajari bagaimana cara menghitung data kuantitas mikroba. 5. Untuk mengetahui kurva pertumbuhan suatu mikroba. 6. Untuk mengetahui cara menghitung waktu regenerasi bakteri.

2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tinjauan Pustaka Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Jutono, 1980). Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspense dalam larutan biak (Dwidjoseputro, 1990). Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut (Fardiaz, 1993). Menurut Jannasch dan Jones (1959), indek aktivitas dan nilai biomassa mikroorganisme

dapat

ditunjukkan

dengan

mengetahui

jumlah

mikroorganisme dalam perairan tersebut. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu perairan ada dua cara dasar yaitu: 1. Perhitungan mikroorganisme secara langsung (direct count), 2. Perhitungan bakteri secara tidak langsung (indirect count). Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah orgnisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). 3

Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu: perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Carrol, 1964). Menurut Lay (1994) cara untuk menentukan jumlah bakteri dalam suatu medium dapat dilakukan dengan: 1. Jumlah bakteri secara keseluruhan (tottal cell counts), bila menggunakan cara ini maka semua bakteri dalam medium tersebut akan terhitung baik yang hidup maupun mati. 2. Jumlah bakteri hidup (viable counts), bila menggunakan cara ini maka sel hidup saja yang di hitung sehingga lebih akurat. Perhitungan langsung merupakan perhitungan yang dilakukan secara mikroskopis dengan cara menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat

kecil.

Perhitungan

ini

menggunakan

alat

yang

di

sebut

haemocytometer (Ferdiaz, 1992). Hemocytometer adalah ruang kaca atau gelas yang meliliki sisi-sisi ditinggikan dengan penutup kecil tembus cahaya yang tepat 0,1mm diatas lantai ruang (Hansen, 2013). Cairan yang digunakan dalam perhitungan tersebut memiliki volume tertentu, hingga gelas penutup dapat terpenuhi. Pada alat ini terdapat 9 kotak besar dengan luas 1 mm3, dalam 1 kotak besar ditengah terbagi menjadi 26 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Sehingga dalam 1 kotak besar terdapat 400 kotak kecil. Tiap ruang hitung memiliki lebar 0,1 mm, tinggi sampel yag terletak antara gelas objek dan gelas penutup adalah 0,2 mm (Ferdiaz, 1992). Metode pour plate dilakukan dengan menginokulasikan biakan ke dalam tabung reaksi yang berisi media agar cair yang sudah agak dingin, lalu diaduk dengan vortex hingga tercampur rata, kemudian campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri steril, diratakan, dan dibiarkan memadat. Sel-sel mikrobia akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah dalam medium padat, sehingga pada akhirnya dapat dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Sedangkan metode spread plate, media agar cair dituangkan dalam cawan petri steril lalu dibiarkan sampai memadat. Kemudian dengan menggunakan 4

ose dilakukan penginokulasian goresan di atas permukaan agar. Setelah diinkubasi, pada akhir goresan akan tertinggal bakteri individual yang terpisah dengan yang lainnya, kemudian jumlah koloni bakteri dapat dihitung (Volk & Wheeler, 1993). Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut: Koloni /ml atau /gram = jumlah koloni per cawan

x

1 faktor pengenceran

Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991). Pada praktikum digunakan teknik penghitungan tidak langsung yaitu dengan metode plate count, pada perhitungan bakteri secara tidak langsung, suspensi susu dan tanah diambil 100 μl disetiap pengenceran 10-2, 10-4, dan 10-6, kemudian suspensi bahan yang mengandung bakteri diinokulasi pada medium NA dan diratakan dengan trigalski secara spread plate agar diperoleh koloni bakteri terpisah dan tersebar di seluruh permukaan medium tersebut sehingga dapat memudahkan perhitungan jumlah koloni bakteri. Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units 5

(CFU’s) per ml. Perhitungan ini menggunakan teknik spread plate, jadi nilai CFU yang terhitung adalah per 0,1 ml atau 0,1 gram sampel. Jadi konversi dari CFU/0,1 ml sampel menjadi CFU/ml sampel yaitu dengan nilai jumlah bakteri dikali 10 lagi untuk hasil per ml atau per gram. TPC merupakan pemeriksaan kuantitatif terhadap bakteri dalam sampel. TPC adalah Total Plate Count, yaitu suatu hitungan jumlah bakteri yang terkandung didalam 1 ml sampel. Untuk menghitung Total Plate Count (TPC) dilakukan pemeriksaan terhadap sampel air dengan spread plate method. Setiap satu sampel dilakukan pengulangan tiga kali. Pertumbuhan koloni yang terjadi setelah 24 jam inkubasi, dihitung dengan bantuan qubec colony counter karena setiap sampel dilakukan pemeriksaan 3 kali (pengulangan 3 kali), maka hasil perhitungan TPC pada 3 petridisk dijumlahkan dan dibuat angka rata-ratanya (Rahayu, 2000). Metode viable count atau disebut dengan metode TPC (Total Plate Count) merupakan kultur yang diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi satu koloni, biasanya 4-12 jam. Namun, cara ini memiliki keterbatasan yaitu jumlah sel terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Faktor yang mempengaruhi perhitungan bakteri dengan metode ini adalah jumlah sel bakteri hatus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak, maka perhitungan dianggap gagal (Purwoko, 2007). Metode MPN (Most Probable Number) adalah metode yang digunakan untuk menghitung koliform di dalam air dengan menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung. Tiga pengujian itu diantaranya adalah uji penduga (Presumtive Test), uji konfirmasi (Confirmed Test), dan uji pelengkap (Completed Test). Hasil dari metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni dalam sampel (Dwidjoseputro, 1994). Standar Plate Count (SPC) merupakan suatu standar yang digunakan untuk melaporkan hasil analisis mikrobiologi. SPC menjelaskan cara 6

menghitung koloni yang tumbuh pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menentukan jumlah koloni. Selain itu ada beberapa cara untuk menghitung bakteri, antara lain: 1. Spektrofotometer Beer dan lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan kimia dengan gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam hukum Beer-Lambert menyebabkan berkembangnya analisis

kimia

dengan

menggunakan

alat

instrumentasi

yakni

spektrofotometer. Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromati, penggabungan bersama dinamakan sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan elektronika sifat kimia dan fisiknya dan detektor yang digunakan secara langsung mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan dan secara tidak langsung cahaya yang diabsorbsi. Kemampuan ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda. Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur transmitans atau absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Hukum Beer menyatakan absorbansi cahaya berbanding lurus dengan dengan konsentrasi dan ketebalan bahan atau mediumnya.

7

2. Haemocytometer Haemocytometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles Malassez. Bentuknya terdiri dari dua counting chamber dan tiap chamber-nya memiliki garis-garis mikroskopis pada permukaan kaca. Luas total dari chamber adalah 9 mm². Chamber tersebut nantinya akan ditutup dengan cover slip dengan ketinggian 0.1 mm di atas chamber floor. Haemocytometer berupa slide kaca tebal berbentuk empat persegi panjang. Pada bagian tengahnya terdapat kotak sebanyak 400 buah. Yakni terdiri dari 25 kotak besar. 1 kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil sehingga berjumlah 400 kotak. Alat ini sangat akurat untuk menghitung kepadatan plankton yang ada dengan meletakkan gelas penutup diatasnya, maka dapat diketahui kedalaman kotak yakni 0,1 mm, panjang 1 mm dan lebar 1 mm. Alat ini juga sering dipakai dalam ilmu kedokteran yaitu untuk menghitung jumlah eritrosit pada sel darah merah. Haemocytometer diciptakan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari tebal kaca mikroskop slide dengan lekukan persegi panjang yang menciptakan ruang. Ruangan ini diukir dengan menggunakan laser-tergores grid dari garis tegak lurus. Perangkat ini disusun dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis yang diketahui, dan kedalaman ruang juga dikenal. Oleh karena itu mungkin untuk menghitung jumlah sel-sel atau partikel dalam volume tertentu cairan, dan dengan demikian menghitung konsentrasi dalam cairan sel-sel secara keseluruhan. 3. Plate Count Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan

8

merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut: 1. Satu koloni dihitung 1 koloni. 2. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. 3. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. 4. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. 5. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. 6. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni. Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistik untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. 1

Jumlah koloni / ml = Jumlah koloni per cawan x 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 4. Filtrasi Filtrasi adalah metode pemisahan yang digunakan untuk memisahkan cairan dan padatan yang tidak larut dengan menggunakan penyaring (filter) berdasarkan perbedaan ukuran partikel. Proses filtrasi yang sederhana adalah proses penyaringan dengan dengan media filter kertas saring . Kertas saring kita potong melingkar jika masih bentuk lembaran empat persegi panjang atau kubus, jika telah berbentuk lingkaran lipat dua, sebanyak tiga atau empat kali. Selanjutnya buka dan letakkan dalam corong pisah 9

sehingga tepat melekat dengan corong pisah. Tuangkan campuran heterogen yang akan dipisahkan, sedikit demi sedikit, kira-kira banyaknya campuran tersebut adalah sepertiga dari tinggi kertas. Lakukan berulang-ulang, sehingga kita dapat memisahkan partikel padat dengan cairannya. Hasil filtrasi adalah zat padat yang disebut residen dan zat cairnya disebut dengan filtrat. Proses filtrasi dilakukan dengan dua cara, yang pertama dilakukan dengan tanpa tekanan atau hanya dilakukan menggunakan corong dan kertas saring saja dimana cairan mengalir karena adanya gaya grafitasi. Pemisahan ini sangat cocok untuk campuran heterogen dimana jumlah cairannya lebih besar dibandingkan partikel zat padatnya. Yang kedua adalah filtrasi (penyaringan) dengan menggunakan tekanan atau dengan cara divakumkan (disedot dengan pompa vakum). Proses pemisahan dengan teknik ini sangat tepat dilakukan, jika jumlah partikel padatnya lebih besar dibandingkan dengan cairannya. Filtrasi banyak dimanfaatkan untuk membersihkan air dari sampah pada pengolahan

air,

menjernihkan

preparat

kimia

di

laboratorium,

menghilangkan pirogen dan pengotor pada air suntik injeksi dan obat‐obat injeksi, dan membersihkan sirup dari kotoran yang ada pada gula dan untuk memurnikan bahan-bahan obat dari partikel dan bahan yang tidak diinginkan sehingga dapat menjamin hasil akhir dari suatu produk obat yang berkualitas dan sesuia syarat yang ditentukan. 5. Berat Kering Metode ini digunakan untuk mengukur pertumbuhan fungi berfilamen. Miselium fungi dipisahkan dari media dan dihitung sebagai berat kotor. Selanjutnya, miselium tersebut dicuci dan dikeringkan dengan alat pengering (desikator) dan ditimbang beberapa kali hingga mencapai berat konstan. Berat konstan yang diperoleh ini disebut dengan berat sel kering. Pemilihan metode pengukuran ini dapat dipengaruhi oleh ketersedian alat pada suatu laboratorium dan dan peneliti. Oleh sebab itu, sebagai peneliti, kita jangan terpaku oleh satu metode saja. Kita perlu mempertimbangkan metode-metode lain yang sesuai dengan ketersedian 10

alat dan dana dengan tidak mengesampingkan kualitas dari tujuan akhir penelitian itu sendiri. 6. Waktu Generasi Pada fase eksponensial, populasi mikrobia mengalami pembelahan paling tinggi dan konstan dalam waktu generasi yang pendek. Waktu generasi mikrobia merupakan waktu yang dibutuhkan sel mikrobia untuk membelah menjadi 2 sel. Setiap sel mikrobia akan membelah 2x lipat sehingga peningkatan jumlah populasi selalu 2n, n adalah jumlah generasi. Pertambahan jumlah sel dalam populasi disebut sebagai pertumbuhan mikrobia. Pada fase eksponensial, awalnya sel mikrobia membelah secara pelan kemudian penambahannya semakin meningkat cepat. Secara matematis memiliki rumus: Nt = N0 × 2n Nt : jumlah sel setelah tumbuh selama waktu t t : waktu pertumbuhan selama fase eksponensial N0: jumlah sel mula-mula selama fase eksponensial 2 : bilangan tetap (pembelahan biner) n : jumlah generasi (pembelahan)

Skala logaritmik menunjukkan jumlah sel dan skala aritmetik menunjukkan waktu inkubasi. Titik perpotongan antara skala logaritmik dengan skala aritmetik menunjukkan adanya pertumbuhan eksponensial dan populasi mengalami penggandaan dalam interval waktu konstan. Waktu generasi berbanding terbalik dengan kecepatan pertumbuhan rerata. (Prescott, 1999). Rata-rata kecepatan pertumbuhan pada fase eksponensial sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan (seperti nutrisi, kondisi inkubasi), seperti halnya karakteristik genetik suatu mikrobia. Pada umumnya, prokariot lebih cepat tumbuh daripada eukariot dan eukariot yang berukuran kecil lebih cepat tumbuh daripada yang ukurannya lebih besar. Hal ini 11

karena sel yang berukuran kecil memiliki kapasitas penyerapan nutrisi dan pembuangan sisa metabolisme lebih besar daripada sel yang berukuran besar. Kondisi tersebut mempercepat proses metabolisme yang akan mempengaruhi kecepatan pertumbuhan mikrobia. Pertumbuhan yang lebih cepat pada prokariot (bakteri) menyebabkan waktu generasinya lebih pendek dibandingkan eukariot (Brock, 2012).

12

BAB III METODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan 3.1.1 Alat dan Bahan Berat Kering Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum Berat Kering. Tabel 3.1 Alat dan Bahan Berat Kering No. 1. 2. 3.

Nama Alat Centrifugal Timbangan Tabung reaksi

Ukuran -

Jumlah 1 5 1

Nama Bahan Alga Hijau -

Konsentrasi -

3.1.2 Alat dan Bahan Filtrasi Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum Filtrasi. Tabel 3.2 Alat dan Bahan Filtrasi No. 1.

Nama Alat Membran filtrate

Ukuran Jumlah -

1

2.

-

-

5

3.

-

-

1

Nama Bahan

Konsentrasi

EMB

-

Sampel bakteri dalam medium cair Air suling

-

3.1.3 Alat dan Bahan Tes Pendugaan Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan pada Tes Pendugaan. Tabel 3.3 Alat dan Bahan Tes Pendugaan No. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Alat Tabung reaksi Tabung durham Pipet mikron Bunsen Korek Api Inkubator

Ukuran Jumlah 9 buah 9 buah 0,1 ml 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah

Bahan Sampel air 4 Media lactose broth -

Jumlah secukupnya 9 buah -

13

3.1.4 Alat dan Bahan Plate Count Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum Plate Count. Tabel 3.4 Alat dan Bahan Plate Count No. 1.

Nama Alat Tabung reaksi

Ukuran -

Jumlah 5

2.

Cawan petri

-

5

3.

Plate count

-

1

Nama Bahan Medium NA cair Sampel bakteri dalam medium cair Air suling

Konsentrasi -

3.1.5 Alat dan Bahan Haemositometer Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum Haemositometer. Tabel 3.5 Alat dan Bahan Haemositometer No. 1.

Nama Alat Haemocytometer

Ukuran -

Jumlah 1

2.

Cover glass

-

1

3. 4.

Slide Mikroskop

-

1 1

Nama Bahan Trypon blue Sampel bakteri dalam medium cair

Konsentrasi -

3.1.6 Alat dan Bahan Spektrofotometer Berikut ini adalah alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum Spekfotometer. Tabel 3.6 Alat dan Bahan Spektrofotometer No. 1. 2. 3.

Nama Alat Spektofotometer Kuvet Tisu

Ukuran -

Jumlah 1 5 1

Nama Bahan Alga Hijau -

Konsentrasi -

14

3.2 Cara Kerja 3.2.1 Cara Kerja Berat Kering Berikut adalah cara kerja dalam praktikum Berat Kering. Tabel 3.7 Cara Kerja Berat Kering No.

Cara kerja

1.

Memasukkan tabung reaksi sampel uji ke dalam sentrifuga.

2.

Menyalakan sentrifuga, lalu atur kecepatan putaran dan atur waktunya.

3.

Mengambil tabung uji yang sudah terpisah antara endapan dan larutan.

4.

Memindahkan ke cawan porselen.

5.

Meletakkan di Oven selama 24 jam.

Gambar

15

No.

Cara kerja

6.

Menggerus sampel uji yang sudah mengering.

7.

Menimbang sampel uji menggunakan neraca analitik.

Gambar

3.2.2 Filtrasi Berikut adalah cara kerja dalam praktikum Filtrasi. Tabel 3.8 Cara Kerja Filtrasi No.

Cara kerja

1.

Memasang pompa vakum ke erlenmeyer.

2.

Meletakkan kertas saring ke dalam corong buncher.

Gambar

16

No.

Cara kerja

3.

Meletakkan corong buncher di atas kertas saring.

4.

Menjepit corong dengan klep penjepit.

5.

Menyalakan pompa vakum.

6.

Memasukkan cairan uji ke dalam corong buncher.

7.

Mengambil kertas saring yang terdapat filtrat uji. Lalu masukkan kertas saring ke dalam EMB.

Gambar

17

3.2.3 Tabel MPN (Tes Pendugaan) Berikut adalah cara kerja dalam praktikum Tes Pendugaan. Tabel 3.9 Cara Kerja Tes Pendugaan No.

Cara kerja

1.

Menyiapkan 9 tabung reaksi berisi kaldu laktosa dan tabung durham. Lalu membagi menjadi 3 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari: - Kelompok 1 Pengenceran 10-1 - Kelompok 2 Pengenceran 10-2 - Kelompok 3 Pengenceran 10-3

2.

Memasukan 1 ml air sampel kedalam masing-masing tabung kelompok 1 (Pengenceran 10-1) dengan menggunakan pipet mikron.

3.

Mengambil 1 ml dari masing-masing tabung pengenceran pertama dengan menggunakan pipet mikron untuk diteteskan ke tabung kelompok 2 (Pengenceran 10-2).

4.

Mengambil 1 ml dari masing-masing tabung pengenceran kedua dengan menggunakan pipet mikron untuk diteteskan ke tabung kelompok 3 (Pengenceran 10-3).

Gambar

18

No.

5.

Cara kerja

Gambar

Inkubasikan semua tabung selama 48 jam.

3.2.4 Plate Count Berikut adalah cara kerja dalam praktikum Plate Count. Tabel 3.10 Cara Kerja Plate Count No.

Cara kerja

1.

Menyiapkan 9 cawan petri yang telah berisi medium agar dan 9 tabung reaksi.

2.

Melakukan pengenceran biakkan murni bakteri dengan air suling (1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; dan seterusnya sampai tidak melebihi 300 koloni), masing – masing dibuat triplo dan masukkan ke dalam tabung reaksi.

3.

Mengosekkan hasil pengenceran dari tabung reaksi ke dalam cawan petri berisi medium agar.

Gambar

19

No.

Cara kerja

4.

Menginkubasikan dengan temperatur 370C dalam waktu 24 jam.

5.

Mengamati dan memilih dari ke 15 cawan petri dengan koloni bakteri yang tumbuh paling banyak (30-300 koloni bakteri).

6.

Menghitung banyak koloni bakteri dengan Coloni Counter.

Gambar

3.2.5 Haemositometer Berikut adalah cara kerja dalam praktikum Haemositometer. Tabel 3.11 Cara Kerja Haemositometer No.

Cara kerja

1.

Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2.

Mensterilisasi kaca preparat haemositometer beserta cover glass kemudian Letakkan cover glass pada bagian tengah kaca preparat hemositometer (pada ruang hitung).

Gambar

20

No.

Cara kerja

3.

Memasukkan biakkan bakteri dengan menggunakan pipet tetes (lakukukan sterilisasi sebelum dan setelah) ke bagian tepi cover glass (dengan sendirinya tetesan tersebut akan mengalir ke bawah cover glass dan mengisi ruang hitung.

4.

Meneteskan larutan Trypan blue ke bagian tepi cover glass hingga menyebar ke ruang hitung.

5.

Mengamati di bawah mikroskop dan hitung jumlah bakteri yang viable dan available (bedakan antara activate (kotoran) dengan bakteri) pada kotak kotak dalam ruang hitung, kemudian lakukan perhitungan dan buat kurva pertumbuhannya.

Gambar

3.2.6 Spektrofotometer Berikut adalah cara kerja dalam praktikum Spektrofotometer. Tabel 3.12 Cara Kerja Spektrofotometer No.

Cara kerja

1.

Membersihkan kuvet dengan aquades.

2.

Menuangkan mikroalga hingga penuh, lalu bersihkan/keringkan bagian luar kuvet.

Gambar

21

No.

Cara kerja

Gambar

3.

Meletakkan kuvet spektrofotometer.

di

dalam

4.

Menutup spektrofotometer dan amati hasil yang muncul di monitor.

22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Perhitungan 4.1.1 Nilai MPN Soal No. 1 Pada percobaan pemeriksaan air dengan 3 seri pengenceran yaitu 10-1 , 102

dan 10-3 diperoleh hasil tabung positif yaitu sebesar 2;2;1. Hitunglah

banyaknya jumlah sel dengan menggunakan tabel MPN dan tanpa menggunakan tabel! Jawab: a. Dengan tabel Volume tes: 33, 3 sel/100ml 10

Jumlah sel = Nilai MPN (dari tabel) x Volume tes 10

Jumlah sel = 28 x 33,3 = 8,408 sel/100ml b. Tanpa Tabel Volume tes: 33,3 sel/100ml Jumlah tabung hasil positif x 100

Jumlah sel = Total volume negatif x total volume 22,1 x 100

Jumlah sel = 11,1 x 33,3

= 5,93 sel/100ml

Soal No. 2 Pada percobaan pemeriksaan air dengan 3 seri pengenceran yaitu 10-1 , 102

dan 10-3 diperoleh hasil tabung positif yaitu sebesar 3;1;0 Hitunglah

banyaknya jumlah sel dengan menggunakan tabel MPN dan tanpa menggunakan tabel!

23

Jawab: a. Dengan tabel Volume tes: 33, 3 sel/100ml 10

Jumlah sel = Nilai MPN (dari tabel) x Volume tes 10

Jumlah sel = 43 x 33,3 = 12,912 sel/100ml b. Tanpa tabel Volume tes: 33,3 sel/100ml Jumlah tabung hasil positif x 100

Jumlah sel = Total volume negatif x total volume 31 x 100

Jumlah sel = 2,3 x 33,3 = 40,475 sel/100ml

4.1.2 Plate Count Diketahui pengenceran 10-3 dengan banyaknya koloni sebanyak 150 CFU/ml Jawab: Colony Count = 150 CFU/ml x

1 10−𝟑

= 150.000 sel/ml

4.1.3 Haemocytometer Diketahui total sel hidup: 54, Total sel mati: 3, Total seluruhnya 57 sel Jawab: 1. % sel hidup =

54 57

x 100

= 94,7 % 24

2. Rata-rata =

54 sel hidup 5 Kotak

= 10,8 3. Dilution Factor =

200µl 100 µ𝑙

=2 4. Konsentrasi = rata-rata x dilution x 104 = 10,8 x 2 x 104 = 216000 sel/ml

4.1.4 Waktu Regenerasi Diketahui jika 100 sel telah ditumbuhkan selama 5 jam menghasilkan 106 sel. Hitunglah waktu regenerasi! Jawab : 𝐍𝐭 = 𝐍𝐨 𝐱 𝟐𝐧 G= G=

𝐭 𝐱 𝐥𝐨𝐠 𝟐 𝐥𝐨𝐠 𝐍𝐭−𝐥𝐨𝐠 𝐍𝐨 𝟓 𝐣𝐚𝐦 𝐱 𝐥𝐨𝐠 𝟐 𝐥𝐨𝐠 106 − log 100

= 0,3762 jam

4.2. Pembahasan Dalam praktikum Enumerisasi untuk menghitung jumlah sel bakteri per ml yang selanjutnya digunakan untuk membuat kurva pertumbuhan bakteri. Dalam percobaa kali ini menggunakan tujuh metode, yaitu MPN (most probable number),

waktu

regenerasi,

berat

kering,

filtrasi,

Spektrofotometer,

Haemocytometer, dan Plate Count. Pada metode pertama yaitu metode MPN, MPN merupakan perhitungan jumlah bakteri yang hidup dalam sampel uji. Metode ini digunakan untuk menghitung mikroba yang hidup di dalam sampel uji. Kekurangan pada metode ini adalah dalam suatu percobaan hanya dapat menggunakan sedikit sampel, 25

lalu untuk mendapatakan kultur yang baik butuh waktu lama, dalam menghitung bakteri hanya didapatkan hasil yaitu perkiraannya saja, membutuhkan banyak perlengkapan dan tidak dapat dilakukan di lapangan, pengerjaannya harus dilakukan di laboratorium. Pada metode plate count dilakukan beberapa kali pengenceran sample yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5. Pengenceran yang paling tepat terdapat pada pengenceran 10-3 karena sampel tersebut tidak terlalu encer dan juga tidak terlalu kental karena dalam pengeceran ini dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu faktor kekentalan yang dapat bakteri tersebut sulit untuk dilihat oleh plate count dan faktor keenceran yaitu bakteri yang tersebar sangatlah sedikit sehingga koloni yang dihasilkan juga sangat sedikit. Jumlah koloni bakteri yang dapat dihitung jumlahnya antara 30-300 koloni. Misalnya dari contoh soal diketahui pengenceran 10-3 dengan banyaknya koloni sebanyak 150 CFU/ml, dengan rumus yang ada didapatkan bahwa jumlah sel yang terdapat pada cawan petri tersebut adalah sebanyak 150.000 sel/ml. Metode plate count terdapat beberapa keuntungan dan kekurangan dibanding dengan metode-metode lainnya. Kentungannya dari metode ini adalah hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung, beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus dan metode ini dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba. Untuk kekurangan metode ini adalah hasil perhitungan tidak menunjukan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan membentuk koloni, serta medium dari kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda, mikroba yang ditumbuhkan juga harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas, menyebar, dan memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama. Metode

yang

ketiga

yaitu

melakukan

Petroff-Hauser

Chamber

menggunakan alat Haemocytometer. Alat ini yang memiliki 25 kotak dengan kedalaman kotaknya sebesar 0,02 mm dan mempunyai luas per kotaknya 1 mm2. Haemocytometer bertujuan untuk menghitung jumlah sel dalam satuan volume (sel sangat kecil). Dalam percobaan menggunakan media cair Trypan 26

Blue. Trypan Blue bergunanya untuk pengenceran dan memberi warna yang berbeda pada bakteri yang hidup maupun bakteri yang tidak hidup sehingga bakteri yang hidup dapat dibedakan dengan yang tidak hidup. Bakteri yang hidup pada haemocytometer yaitu jika terdapat bakteri berwarna putih kekuningan, jika terdapat bakteri berwarna biru maka bakteri tersebut adalah bakteri yang mati. Haemocytometer memiliki kekurangan dan kelebihan penggunaannya dalam proses perhitungan bakteri secara langsung. Kelebihannya dari metode ini antara lain metode ini cepat dalam menghasilkan data dan tidak perlu menunggu lama, serta datanya atau jumlah selnya langsung didapat pada saat itu juga setelah menghitung menggunakan rumusnya dan menghemat biaya. Sedangkan kelemahannya ialah tidak dapat membedakan sel yang hidup dan yang mati karena perhitungan secara keseluruhan dan data yang dihasilkan tidak akurat karena setiap pengamat memiliki mata yang berbeda-beda dan terdapat keterbatasan dalam melihat serta menghitung sel yang ada dalam kamar Haemocytometer. Pada metode spekfotometer biasanya menggunakan alat Turbidimeter, tetapi dapat juga menggunakan alat spektoftometri dan menggunakan media alga yang berbeda suhu dan kekeruhan. Prinsip umum dari alat tersebut adalah pengukuran intensitas cahaya, cahaya yang di absorbsi akan bergantung kepada Jumlah dan Ukuran Partikel. Pada percobaan kali ini menggunakan alat spektofotometri yang menggunakan panjang logam 600 nm. Dengan alat tersebut maka akan didapati nilai absorbansi. Prinsip dari absorbansi adalah Semakin besar konsentrasi larutan maka semakin besar absorbansinya, Semakin besar dan banyak jumlah partikel maka jumlah cahaya yang diabsorbsikan semakin besar. Setelah diketahui nilai konsentrasi dan nilai absorbansi dapat dibuat kurva kalibrasinya. Pembuatan kurva kalibrasi atau kurva standar bertujuan untuk mengetahui linieritas hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan absorbansinya. Pada metode berat kering, alat yang digunakan adalah alat centrifuge, centrifuge merupakan alat untuk memutar sampel pada kecepatan tinggi, 27

memaksa partikel yang lebih berat terkumpul ke dasar tabung centrifuge. Perhitungan massa sel secara langsung atau tidak langsung sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komposisi substrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti. Untuk menentukan massa sel mikroba dalam suatu populasi, dilakukan dengan cara menumbuhkannya dalam suspensi homogen pada medium yang sesuai dengan konsentrasi (jumlah sel/ ml) dan densitasnya (mg/ml), dihitung adanya peningkatan seiring dengan waktu. Kelemahan dari metode berat kering ini adalah metode ini hanya dapat menghitung alga dan jamur. Metode selanjutnya adalah metode waktu generasi yang dimana waktu generasi

adalah

waktu

yang

diperlukan

oleh mikroorganisme

untuk

meningkatkan jumlah sel menjadi dua kali lipat jumlah semula dalam waktu tertentu. Mayoritas bakteri memiliki waktu generasi bersekitas 1-3 jam, E.coli memiliki waktu generasi yang singkat 15-20 menit Microbacterium tuberculosis memiliki waktu generasi sekitar 20 jam, tetapi tidak semua species bakteri mempunyai waktu generasi yang sama. Pada percobaan waktu generasi, digunakan untuk menghitung waktu generasi bakteri diamana bakteri sendiri melakukan reproduksi dengan cara pembelahan biner atau sering disebut pembelahan ganda sehingga didapat pertambahan bakteri pada waktu ke-n adalah 2n. Dalam praktikum ini diberikan suatu contoh studi kasus mengenai bakteri dengan jumlah sel awal 100 namun setelah 5 jam bakteri tersebut bertambah jumlahnya menjadi 106 sel, sehingga waktu generasi bakteri dapat dihitung dengan rumus yang ada dan mendapatkan hasil 0,3762 jam atau setara dengan 22 menit 36 detik. Metode terakhir adalah metode filtrasi. Metode filtrasi ini memisahkan campuran dua atau lebih komponen tanpa menggunakan panas. Komponenkomponen akan terpisah berdasarkan ukuran dan bentuknya, dengan bantuan tekanan dan selaput semi-permeable. Hasil pemisahan berupa retentate (bagian dari campuran yang tidak melewati membran) dan permeate (bagian dari campuran yang melewati membran). Metode ini bakteri disaring menggunakan kertas saring, yang dimana kertas saring tersebut membutuhkan pompa karena 28

ukuran pori-pori kertas saring tersebut sangat kecil. Kelebihan dari metode filtrasi adalah hasil yang didapatkan lebih cepat, namun kelemahannya adalah jika praktikan kurang teliti maka hasil yang didapatkan tidak terlihatnya antara bakteri yang hidup dan bakteri yang mati. Bila tidak terlihat maka harus dilakukan tahap pengenceran.

29

BAB V SIMPULAN

Berikut ini adalah beberapa hal yang dapat disimpulkan dari praktikum ini: 1. Pada praktikum Enumerasi Mikroba dapat dilakukan tujuh metode yaitu MPN (most probable number), waktu regenerasi, berat kering, filtrasi, Spektrofotometer, Haemocytometer, dan Plate Count. 2. Pada meode plate count dilakukan dengan beberapa kali pengenceran sample yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 pengenceran yang tepat itu pada pegenceran 10-3. 3. Syarat koloni bakteri yang dapat dihitung pada metode plate count antara 30-300 koloni. 4. Larutan trypan blue pada metode haemocytometer berguna untuk membedakan bakteri yang hidup dan bakteri yang mati. 5. Pada spektrofotometer semakin tinggi nilai absorbai maka semakin tinggi pula kekeruhan sampel dan jumlah sel yang terkandung dalam sampel. 6. Metode berat kering hanya dapat menghitung alga dan jamur. 7. Hasil filtrasi adalah zat padat yang disebut residen dan zat cairnya disebut dengan filtrat. 8. Masing-masing metode mempunyai kelebihan dan kekurangan.

30

DAFTAR PUSTAKA Carol, B., Freund, M. 1964. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. The Journal of the Society for Reproduction and Fertility. Dwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Fardiaz, S. 1992. Mikirobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jannasch, H.W., dan G.E., Jones. (1959). Bacterial Population in Sea Water as Determined by Different Methods of Enumeration. Limnal. Oceanogr. 4:128139. Jutono, J., Soedarsono, S., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, D., Soesanto. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta Lay, W. B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada, Jakarta. Nugroho, Astri Rinanti dan Sintorini Moerdjoko. 2018. Penuntun Praktikum Biologi/Mikrobiologi Lingkungan. Jakarta: Trisakti. Penn, C. 1991. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikrobia. Bumi Aksara, Jakarta. Rahayu, Asih. 2000. Deteksi Adanya Bakteri Pada Air Minum dalam Kemasan Galon. Jurnal Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma. Surabaya. Richards, B. N. 1987. The Microbiology of Terrestrial Ecosystems. New York: John Willey and Sons Inc. Volk &Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar jilid 1. Erlangga. Jakarta.

31