Microscopia De Fluorescenta

Filimon Ana Mihaela Master BMBA, an I

Microscopia de fluorescență Microscopia de fluorescență este o ramura a microscopiei care studiază fluorescența compușilor organici și anorganici concomitent cu absorbția și reflexia. Fluorescența este proprietatea optică a unor molecule de a emite radiație electromagnetică (lumina) ca urmare a tranziției de dezexcitare de pe un nivel electronic superior pe unul inferior, în urma absorbției de radiație electromagnetică situată în domeniul UV sau vizibil. Anumite substanțe posedă proprietatea de a emite radiație vizibilă în urma expunerii la UV, proprietatea purtând numele de fluorescență. Aceste substanțe sunt caracterizate de o lungime de undă de excitație (in UV) și de o lungime de undă de emisie, (in vizibil), ceea ce face ca tehnica de punere în evidență a fenomenului de fluorescență să permită și identificarea substanțelor studiate, nu doar semnalarea prezenței acestora. Cu acest scop se utilizează filtre optice și UV pentru selecția radiaţiei de excitaţie şi de emisie a substanţei care urmează a fi observată. Printre substanțele care posedă aceste proprietăți se numară și cele de interes medical, precum acizii nucleici, proteinele, etc. Pentru a observa o serie de substanţe care nu prezintă fluorescenţă în mod direct, se utilizează ”markeri de fluorescenţă”. Markerii sunt substanţe care au următoarele proprietăţi: - fluorescenţă intrinsecă - aditivitate foarte mare - deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează. Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor. Evidentierea si studiul proprietăţii de fluorescenta are loc în prezenţa unei molecule numite fluorofor : proteina verde fluorescenta, fluoresceină (proteine fluorescente). Proba se supune unei lumini de o anumită lungime de undă, radiaţia luminoasă fiind absorbită de către fluorofor. In urma absorbtiei, acesta emite o radiaţie luminoasă de lungime de undă diferita de cea absorbita. In componenta unui astfel de microscop intra pe langa sursa de lumina, oglinda dicroica si filtre (in diferite combinatii, de excitatie - banda dubla de excitatie, banda tripla de excitatie, si de emisie). Fluorescența are multe aplicații practice, cum ar fi mineralogia, gemologia, medicina, senzorii chimici (spectroscopia fluorescentă), etichetarea fluorescentă, coloranții, detectoarele biologice, detecția razelor cosmice și, cel mai adesea, lămpile fluorescente. Fluorescența apare frecvent în natură în unele minerale și în diferite stări biologice din multe ramuri ale regnului animal. Principii fizice Fotochimie Fluorescența apare atunci când un electron orbital al unei molecule, atom sau nanostructură se relaxează la starea de bază prin emiterea unui foton dintr-o stare de excitare singlet:  Excitație: S0 + hνex → S1  Fluorescență (emisie): S1 → S0 + hνem + căldura Aici hv este un termen generic pentru energia fotonică cu h = constantă Planck și ν = frecvența luminii. Frecvențele specifice ale luminii incitante și emise depind de sistemul particular.

Filimon Ana Mihaela Master BMBA, an I

S0 se numește starea de bază a fluoroforului (moleculă fluorescentă), iar S1 este prima stare de excitare singlet excitată (electronică). O moleculă în S1 se poate relaxa prin diverse căi concurente. Aceasta poate suferi o relaxare non-radiativă în care energia de excitație este disipată sub formă de căldură (vibrații) a solventului. Moleculele organice excitate se pot relaxa, de asemenea, prin conversie într-o stare triplă, care se poate relaxa ulterior prin fosforescență sau printr-o etapă de relaxare secundară non-radiativă. Relaxarea din S1 poate apărea și prin interacțiunea cu o a doua moleculă prin stingerea fluorescenței. Oxigenul molecular (O2) stopează extrem de eficient fluorescența doar datorită stării sale triplete neobișnuite. În majoritatea cazurilor, lumina emisă are o lungime de undă mai lungă și, prin urmare, o energie mai mică decât radiația absorbită; acest fenomen este cunoscut sub numele de deplasarea Stokes. Randament cuantic Randamentul cuantic de fluorescență asigură eficiența procesului de fluorescență. Acesta este definit ca raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul de fotoni absorbiți. Φ = Numărul de fotoni emiși / Numărul de fotoni absorbiți Randamentul maxim al fluorescenței cuantice este 1,0 (100%); fiecare foton absorbit are ca rezultat un foton emis. Compușii cu randament cuantic de 0,10 sunt încă considerați destul de fluorescenți. Un alt mod de a defini randamentul cuantic al fluorescenței este prin rata dezintegrării stărilor excitate: Φ = kf/Σi ki unde kf este constanta ratei emisiei spontane de radiație și Σi ki este suma tuturor ratelor de dezintegrare a stărilor excitate. Durata de viață Durata de viață a fluorescenței se referă la timpul mediu în care molecula rămâne în starea excitată înainte de a emite un foton. Fluorescența urmează în mod obișnuit cinetica de ordinul întâi: [S1] = [S1]0e-Γt unde [S1] este concentrația moleculelor de stare excitate la momentul t, [S1]0 este concentrația inițială, și Γ este rata de dezintegrare sau inversul duratei de viață a fluorescenței. Acesta este un exemplu de dezintegrare exponențială. Diferitele procese radiative și non-radiative pot depopula starea excitată. În acest caz, rata totală de dezintegrare este suma tuturor ratelor: Γtot = Γrad + Γnrad unde Γtot este rata totală de dezintegrare, Γrad este rata de dezintegrare radiativă și Γnrad rata de decădere non-radiativă. Este similară unei reacții chimice de ordinul întâi în care constanta ratei de ordinul întâi este suma tuturor ratelor (un model cinetic paralel). Dacă rata emisiei spontane sau oricare alte rate sunt rapide, durata de viață este scurtă. Pentru compușii fluorescenți utilizați în mod obișnuit, timpii de dezintegrare tipici ai stărilor excitate pentru emisiile de fotoni cu energii de la UV până la infraroșu apropiat sunt în domeniul de la 0,5 la 20 nanosecunde. Durata de viață a fluorescenței este un parametru important pentru aplicațiile practice ale fluorescentei, cum ar fi transferul de energie prin rezonanță fluorescentă și microscopia de imagistică prin fluorescență.

Filimon Ana Mihaela Master BMBA, an I

Bibliografie 1. http://www2.phys.uaic.ro/labs/comb/facilitati%20Microscop%20de%20fluorescenta.html 2. https://www.setthings.com/ro/fluorescenta/ 3. http://www.phys.ubbcluj.ro/~dana.maniu/OS/Lab_fluorescenta.pdf