Metode Kromatografi Ion Untuk Penentuan Asam Orotic Dalam Urin.docx

Metode kromatografi ion untuk penentuan asam orotic dalam urin 1. Pendahuluan Orotic acid (OA) adalah perantara ke empat di jalur sintetis pirimidin de novo. Jalur dimulai dengan pembentukan karbamoil fosfat dari glutamin, karbon dioksida dan dua molekul ATP, oleh enzim sitosol carbamoyl fosfat sintetase II (CPS II) dan berlanjut dengan aspartat transcarbamylase dan enzim dihydroorotase. Dihydroorotic acid dehydrogenase mengkatalisis oksidasi asam dihidroorotik menjadi asam orotic pada permukaan luar mitokondria . Asam orotic intraselular diubah menjadi uridine monophosphate (UMP) oleh UMP synthase. CPS I, di sisi lain, adalah bagian dari siklus urea, diaktifkan oleh N-acetylglutamate (NAG) dan memanfaatkan amonia di sintesis karbamoil fosfat . Kuantifikasi OA dalam sampel biologis sulit dan umumnya membutuhkan instrumentasi canggih. Secara singkat, metode analitik untuk penentuan OA dalam literatur adalah sebagai berikut: Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan UV dan dengan Deteksi Array Dioda (DAD) , Kromatografi Cair - Electrospray Tandem Mass Spectrometry (LC-ESI-MS / MS) , Kromatografi Cair Hidrofilik Interaksi - Spektroskopi Massa Tandem (HILIC-MS / MS), Kromatografi Gas - Spektroskopi Massa (GC - MS), Zona Capilari Elektroforesis (CZE) dengan UV dan dengan metode DAD , Spektrofotometri dan Spektrofluorometrik bersiklus serat. Meskipun instrumen analitis ini adalah produk teknologi maju, mereka memiliki beberapa kekurangan seperti mahal dan memakan waktu, menerapkan prosedur pembersihan dan derivatisasi, dan penggunaan / limbah pelarut organik beracun. Salah satu metode kuat untuk analisis anion anorganik dan asam organik kecil adalah Ion Chromatography (IC). Dalam literatur, IC dengan metode deteksi pulsed amperometric diaktifkan (APAD) digunakan untuk penentuan OA dalam sampel urin yang sehat. Operasi detektor elektrokimia (ED) sedikit lebih menantang dibandingkan dengan detektor konduktivitas (CD) karena pengkondisian ED membutuhkan lebih banyak waktu dan lebih banyak bagian yang ada di ED. Namun, diketahui bahwa ED tidak serumit MS. Sistem LC-MS / MS mampu secara selektif dan sensitif menganalisa ion yang ditargetkan, tetapi kelemahan utama dari sistem ini adalah biaya operasi yang tinggi. Selanjutnya, setiap hari kalkulasi dan sifatnya yang rumit membuatnya merugikan IC dalam analisis rutin. Di sinilah keuntungan dari IC bebas reagen (RFIC). Kartrid Eluent generation (EG) elektrolisis menghasilkan hidroksida dengan kemurnian tinggi dalam sistem RFIC. Oleh karena itu, baik risiko kontaminasi maupun kesalahan buatan manusia dihilangkan dengan menggunakan sistem RFIC. Terlebih lagi, sistem RFIC menjaga stabilitas selama periode panjang bahkan jika sistem dimatikan. Ini adalah metode pertama menggunakan RFIC dengan deteksi konduktivitas ditekan untuk mengukur konsentrasi asam orotic di kedua sampel urin patologis dan subyek sehat. Sebagai hasilnya, makalah ini menjelaskan metode IC baru dengan keuntungan dalam banyak hal yaitu persiapan sampel yang sederhana dan cepat (pengaliran-pengaliran-encer), tidak ada penggunaan pelarut organik beracun, tidak ada langkah derivatisasi, dan juga berkat presisi sistem RFIC yang sangat baik , sensitivitas tinggi, dan stabilitas jangka panjang diperoleh. Disarankan bahwa metode yang diusulkan harus dilakukan oleh laboratorium klinis terutama untuk diagnosis cepat dari aciduria orotic pada pasien dan jadi mulailah pengobatan jika diperlukan.

2. Bahan-bahan dan metode-metode 2.1. Bahan kimia dan aparatus Semua reagen adalah kelas reagen analitis. Asam orotic (6- Carboxy-2,4 dihydroxypyrimidine) ≥98%, Air murni ultra (min. 18,2MΩ / cm resistivitas), Filter PES (polyether sulfone) (ukuran pori 0,2 μm, 17 mm). 2.2. Instrumentasi Pemisahan dan analisis kromatografi dilakukan dengan menggunakan sistem kromatografi ion Dionex ICS-3000. Pemisahan OA dilakukan dengan memanfaatkan kolom analitis Dionex IonPac® AS20 (2 × 250 mm) dengan kolom penjaga Dionex IonPac® AG20 (2 × 50 mm) sebagai fase diam dan NaOH sebagai fase gerak yang dihasilkan dari kartrid Dionex EGC-NaOH EluGen II hanya menggunakan air murni ultra. Akuisisi data dan kontrol instrumen dilakukan melalui Dionex Chromeleon® Client Perangkat lunak (Ver. 6.80). 2.3. Pengumpulan dan penyimpanan sampel urin Tiga puluh sampel urin normal dan Sampel urin dari dua pasien sukarelawan yang terkena aciduria orotic. Semua sampel urin langsung dibekukan hingga −20 ° C dan disimpan pada suhu ini sampai analisis. 2.4. Pengukuran kreatinin sampel urin Konsentrasi OA dinyatakan sebagai rasio dengan konsentrasi kreatinin urin (μmol mmol − 1 dari kreatinin) untuk memperhitungkan variasi volume urin di antara subjek, prosedur ini biasanya digunakan dalam biokimia klinis. 2.5. Persiapan sampel urin Sampel urin beku disimpan dalam air pada 50 ° C selama 20 menit. Ketika suhu sampel telah mencapai suhu kamar, sampel urin normal dan sampel urin pasien diencerkan 10 kali lipat dan 200 kali lipat dengan air murni ultra. Semua solusi disaring melalui filter syringe PES sebelum dimasukkan ke dalam 10 mL sampel botol dari IC auto sampler. 3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Optimalisasi kondisi IC Untuk menunjukkan kondisi pemisahan optimum, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, dan konsentrasi eluen NaOH 80mM diperiksa dengan menyuntikkan larutan berduri ini. Akibatnya, konsentrasi eluen yang paling nyaman ditemukan sebagai 50mMat 0,25 mL laju aliran min‾1. Dengan menerapkan konsentrasi eluen NaOH 60 mM, 70 mM, dan 80mM, puncak OA tetap dalam ekor puncak besar yang dibentuk oleh komponen lain dalam urin. Baseline drifts serius mempengaruhi pengulangan area puncak OA. Oleh karena itu, nilainilai ini tidak dilaksanakan lagi. Konsekuensinya, kondisi kromatografi yang dioptimalkan adalah sebagai berikut: 50mM NaOH sebagai eluen selama 20 menit; arus penekan adalah

31 mA; laju aliran fase gerak adalah 0,25 mL menit − 1; suhu kompartemen kolom dan detektor adalah 30 ° C; sampel volume loop adalah 10 μL. 3.2. Validasi metode Untuk mengevaluasi sensitivitas, linearitas, dan pengulangan, beberapa karakteristik kinerja diselidiki. Rentang linier, persamaan regresi, batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), dan waktu retensi (tR) diberikan pada Tabel 1. 3.2.1. Linearitas Untuk menunjukkan rentang kalibrasi linier, larutan OA standar berair dengan konsentrasi 0,43, 1,6, 3,2, 6,4, 16, 32, 48, 64, 80, 96, dan 128 μmol L − 1 disiapkan dan diukur pada kondisi IC yang optimal. Diamati bahwa konsentrasi lebih besar dari 32 μmol L − 1 menyebabkan tailing puncak dan menyebabkan respons positif terhadap CD yang berada di atas batas atas garis kalibrasi pada tingkat kepercayaan 95% (r2 = 0,999) dihitung dan digambar oleh perangkat lunak. Oleh karena itu, 30 μmol L − 1 OA ditugaskan sebagai batas atas dalam rentang linier.

3.2.2. LOD dan LOQ LOD dan LOQ dihitung dengan standar deviasi (s0,), diperoleh dari sepuluh pengukuran replikasi, dikalikan dengan faktor kQ yang 3 dan 10 (nilai default IUPAC). Selain itu, untuk memperkirakan LOQ metode dalam urin relatif terhadap kreatinin, perhitungan yang sama diterapkan pada nilai konsentrasi rendah di antara hasil (μmol mmol − 1 kreatinin) dan nilai rata-rata dihitung. 3.2.3. Selektivitas Telah diketahui bahwa anion anorganik, yaitu klorida, nitrat, nitrit, sulfat, iodida, fosfat, dan tiosianat, tidak mengganggu analisis OA karena mereka dapat dielusi lebih awal dari kolom analitis.Kelompok amonium kuarter, yang merupakan gugus fungsional dari kolom analitis, memiliki muatan (+) dan molekul asam orotis memiliki muatan (-) dan oleh karena itu interaksi ionik terjadi antara dua muatan. Selain pemisahan pada kolom, beberapa senyawa interferensi mungkin dalam urin yang memiliki matriks kompleks dihilangkan dengan menekan CD. Yakni, tidak ada puncak yang diamati dalam kromatogram dari senyawa yang bentuk-H tidak dapat dipisahkan (sebaliknya). Dengan mempertimbangkan semua sifat ini, OA kuat dipertahankan berhasil dielusi pada kolom dalam 9 menit tanpa gangguan, dan cukup selektif metode dikembangkan. 3.2.4. Presisi Ketepatan metode yang diusulkan dievaluasi dengan melakukan studi pengulangan inter-hari dan intra-hari. Repeatability diekspresikan dengan nilai RSD. Untuk tujuan ini, untuk mengevaluasi presisi intra-hari, enam 10-dilipat-dilarutkan larutan dari sampel urin normal yang sama disiapkan dan kemudian dianalisis pada hari yang sama. Selanjutnya, untuk mengontrol presisi antar-hari, prosedur yang sama persis diulangi pada tiga hari yang berbeda. Setelah studi pengulangan selesai, nilai% RSD dari konsentrasi, area puncak, ketinggian puncak, dan tR OA dihitung. Nilai RSD% yang diberikan pada Tabel 2 cukup baik dan dapat diterima berdasarkan pedoman AOAC . 3.2.5. Kebenaran Selain tes pengulangan, trueness adalah kriteria mutlak lainnya untuk keakuratan suatu metode. Salah satu metode statistik untuk menerima akurasi adalah tes signifikansi (ttest). Pertama, sampel urin patologis diencerkan 100 kali lipat. Meskipun nilai konsentrasi OA pada tingkat spiking pertama dan kedua ditemukan dalam rentang kalibrasi, hasil spiking ketiga adalah 44 μmol L − 1 yang keluar dari jangkauan linier dan menyebabkan kesalahan positif. Untuk membuat semua konsentrasi dalam rentang linier, sampel urin patologis dan semua larutan berduri lainnya diencerkan 200 kali lipat. Hasil pemulihan diberikan pada Tabel 3.

3.3. Efek akumulasi Setidaknya dua pengukuran air deionisasi segera diterapkan ke IC setelah setiap analisis larutan urin untuk mengontrol akumulasi. Area puncak minimum ditetapkan sebagai 0,001 (μS × min) pada kromatogram tergantung pada baseline noise dengan memanfaatkan perangkat lunak. Setiap hasil konsentrasi untuk OA diamati tidak setelah semua sampel sampel urin atau setelah 30 μmol L − 1 standar OA yang merupakan konsentrasi maksimum dalam rentang kalibrasi linier.

3.4. Analisis sampel urin Metode IC diterapkan pada dua sampel urin pasien yang didiagnosis dengan aciduria argininosuccinic dan tiga puluh sampel urin normal juga. Dalam penelitian kami, untuk mengukur OA dalam rentang kalibrasi linear, sampel urin patologis diencerkan 200 kali sedangkan 10 kali pengenceran cukup untuk sampel urin normal. Kisaran konsentrasi OA adalah 0,41–1,66 μmol mmol − 1 kreatinin dalam sampel urin yang sehat. Nilai konsentrasi rata-rata dan nilai median OA dalam sampel ini dihitung dan nilai-nilai ini adalah 0,88 μmol mmol − 1 kreatinin dan 0,81 umol mmol − 1 kreatinin, masing-masing. Sudah jelas bahwa urin OA patologis kira-kira min 50 kali lebih tinggi daripada yang normal.

4. Kesimpulan Tidak diragukan bahwa analisis asam orotis yang cepat dan andal dalam urin merupakan masalah penting bagi anak-anak terutama yang menderita aciduria orotic. Makalah ini menjelaskan metode baru untuk penentuan asam orotic di kedua sampel urin normal dan sampel urin patologis oleh IC dengan deteksi konduktivitas ditekan. Dalam penelitian kami, kami melihat bahwa asam orotic saluran kemih yang tinggi ditemukan pada urin pasien seperti yang diharapkan. Yang perlu diperhatikan adalah bahwa metode yang diusulkan menawarkan beberapa keuntungan luar biasa seperti memiliki prosedur persiapan sampel yang mudah, cepat dan murah, waktu berjalan singkat, tidak menuntut derivatisasi, presisi yang sangat baik dan kepekaan memanfaatkan sistem RFIC dan tidak menggunakan pelarut karsinogenik. Kesimpulannya, metode yang diusulkan mungkin menjadi kandidat untuk penentuan OA di laboratorium klinis di antara analisis rutin.