Metabolites

Metabolites, primary and secondary. Primer metabolitleri, hücrelerin en küçük molekkülleridir. Primer metabolitleri, hücrelerde ara ürün veya son ürün olabilir, esensiyal makromoleküller için yapıtaşları olarak görev alabilir veya koenzimlere dönüşebilirler. Endüstri bakımından en çok önemli olanlar: amino asitler, nukleotidler, vitaminler, çözgenler, ve organik asitler. Primer metabolitleri, boyut açısından Hidrojen (2Da) ve Metan (16Da) gazlarından vitamin B12 (1,355)’ sine kadar değişmekedir. Amino asitler ve vitaminler insan ve hayvan gıdalarda; etanol, aseton, butanol yakıtlarda ve çözgenlerde; sitrik asit ile asetik asit ise asidülantlarda kullanılmaktadır. Buna rağmen metabolitlerin büyük bir kısmı yeni ve farklı metabolik yollarda kullanılmaktadır. Örneğin, glutaminin sodium tuzu, 5’- inosinic, ve 5’- guanilik asitler gıdalarda lezzet artırıcıları; sodium glükonat temiz yüzeylerde sabunun kir tabakasının birikmesini engellemektedir ve bir ayırma aracısı olarak görev yapmaktadır. Bu metabolitleri ürün olarak üreten organizmalar aşırı üretim derecelerinde gerçekten müthişler. Mikrobial ürünler, yıllarca gıda ve içkinin kalitesini artırmada, kullanılabilirliğinde ve daha cazib yapılmasında gerekliydi. Gıda ve yem endüstrilerde geçmişte ve derhal kullanılan primer metabolitlerin listesi Tablo 1’ de gösterilmektedir. SINIF alkol amino asitler nukleotidler organik asitler polyols polisakkaritler şeker vitaminler

ÖRNEK etanol glutamik asit( monosodium glutamat), lizin, threonin, triptofan, fenilalanin 5'-guanilik asit, 5'-inosinik asit asetik asit, propionik asit, suksinik asit, fumarik asit, laktik asit, malik asit,tartarik asit, sitrik asit, glukonik asit gliserol, mannitol, erythritol, xylitol xanthan, gellan, fruktoz, sorboz, riboflavin (B2), siyanokobalamin (B12), biotin. Tablo 1. Gıda ve yem endüstrilerde kullanılan primer metabolitler.

Yıllık yaklaşık 1 millyon ton amino asit üretilmektedir. İkinci bir yöntem, feedback regülasyonun yan yoludur. Bu yöntemle üretilen mutant suşu istenilen toksik metabolitlere karşı dirençli olmaktadır, örneğin, antimetabolitler. Dirençli mutant suşların okzotrofik ve antimetabolitlerin kombinasyonu primer metabolitleri üreten mikroorganizmalarda çok yaygın rastlanmaktadır. L-glutamik asidin üretilmesinde membran geçirgenliği çok önemlidir. Lglutamıc asit ticarette en yaygın olanıdır. Yaklaşık 1,2 milyar pound monosodium glutamat üretilir, monosodium glutamat patentli bir lezzet artırıcıdır. Hücre içinde fermentasyon yoluyla değişik Corynebacterium ve Brevibacterium ( örneğin, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum ve B. lactofermentum) suşlar tarafından sentezlenmektedir. Membran değişikliği kasten biotin tarafından etkilenir ( bütün glutamik asit bakterileri, biotin okzotrofudur). Gliserol okzotrofun sınırlaması- gliserol, oleat okzotrofun sınırlaması- oleat, hızlıca büyüyen hücrelerin sınırlaması- eklenen penisilin veya yağ asidin türevleri. Bu manipulasyonların tamamı belki de sitoplazmik membranın fosfolipid yetersizliğinden kaynaklanabilir. Ayrıca istenilen ürünü etkili bir şekilde elde etmek için büyüme inhibisyonu ile birlikte yüksek değerinde karbon ve enerji gerekilidir. Gerçek salgılama sistemi, membran potansiyeline bağlı olan spesifik efflux sistemi tarafından dışarı salınır. Dünyada tüketilen tahıl ürünlerinin esas kısmı, esansiyel l-lizin amino asidinden yetersizdir. Tahıl ürünlerine lizin ekleyerek gıdalarda ve yemlerde bu denge sağlanabilir. Lizin amino asitlerin aspartat ailesi içerisindedir ve bakteriler tarafından üretilir. Aynı metabolik yol izi üzerinden bakteriler metionin, treonin ve izolösin de üretirler. Bu metabolik yol izi E.coli gibi mikroorganizmalarda çok dikkatli bir şekilde kontrol edilir. Bu organizma

üç tane aspartat kinaz içerir, her biri farklı son ürün tarafından kontrol edilir. Ek olarak, her basamak başlangıcında, başlangıç enzim kendi son ürünü ile inhibe edilir, böylece aşırı üretim meydana gelmemektedir. Ancak lizin fermente eden organizmada ( örneğin, çeşitli C.glutamicum mutant suşu) sadece tek bir aspartat kinaz enzimi bulunur, fig 2.

Bu aspartat kinaz enzimi treonin ile lizin feedback inhibisyonla regüle edilir. Glutamik asit üreten wild-type Corynebacterium türünden homoserin dehidrogenaz genini çıkarılarak, metionin, treonin içeren ortamlarda aşırı lizin üreten mutant suşuna dönüştürüldü. Treonin konsantrasyonu düşük tutulduğu sürece, intrasellüler treonin konsantrasyonu sınırlanır, böylece aspartat kinaz enzimin feedback inhibisyonu atlatılır. Diğer aspartat ailesindeki enzimler, aspartat semialdehyde ve treonin sentetaz gibi biyosentetik yollakları izleyen enzimler kontrol edilmemektedir. Aspartat kinaz enzimin feedback inhibisyon farklılığa ek olarak, lizin üreticileri E.coli’de belirtilen yollarda farklılık gösterir: 1) aspartat kinaz veya aspartat semialdehyde enzimlerin feedback represyonu meydana gelmemektedir. 2) lizin metabolik yol izinde yer alan birinci ve ikinci enzimler (dihydrodipicolinat synthetase ve dehydrodipicolinat reductase) son ürün olan lizin amino asit tarafından ne inhibe edilir ne de represyona uğrar. 3) l-lizin dacarboxylase aşırı lizin üreticilerde bulunmamaktadır. Pentoz fosfat yol izi, önceki yol için NADPH’a daha büyük gereksiniminden dolayı glutamik asit üretmesinde değil lizin üretmesinde çok daha büyük önem taşır. 4) Lizin salgısı, taşıyıcıları içeren aktif transport ile dışarı salgılanır ve membran potansiyel, lizin gradient ve proton gradien kuvvetler tarafından sürülür. Salgılama bir 2 OH/Lizin simportere kullanır ve

ATP’den değil de elektromotiv kuvvetine bağlı olarak dipeptid alım sistemi tarafından katalize edilir. Rekombinant DNA teknikleri amino asit üretim sahası içine doğru kendi yollarını oluştururlar. E.coli ve Serratia marcescens suşları amino asit biyosentetik operonları taşıyan plazmitlerle oluşurlar. Plazmit transformasyon C.glutamicum içinde başarıyla sonuçlanır, ki rekombinant DNA teknolojisi şimdi bu ticari amino asit üretim suşlarını geliştirmek için kullanılır. Büyük kullanımlar aspartat kinaz feedback direnişlisini ve dihidrodipicolinat sentazının seviyelerini yükseltmek için gen clonisinde yer alır. Sonuç olarak, lizin endüstriyel üretim için her kullanılan glükoz gram ( 0.25-0.35 mol l-Lizinin molar verimliliği her kullanılan glukoz molu başına) başına 120 g/L ve 0.25-0.35 g l-Lizin HCl olur. L-Lizin HCL sektörü her yıl 360 milyon poundtır. Rekombinant teknoloji ve geleneksel mutagenesis ve seleksiyon 100g/L l-treonin, 40 g/L l-isolösin, 34 g/L l-lösin, 31 g/L l-valin, 28 g/L l-tirozin, 100 g/L l-prolin, 65 g/L larginin, ve 40 g/L l-histidin maddelerini üretebilen bakteriyel suşların oluşumunda büyük etkilere sahiptirler. C.glutamicim içindeki lizin biyosentetik yol izi ile treonin, metionin, izolösin, valin ve lösin arasindaki ilişki Figür 3’te gösterilmiştir. Aromatik amino asitlere

(fenilalanin triptofan ve tirozin) giden yol izi Figür 4’te verilmiştir.

Nükleotid fermentasyona olan ticari ilgi, lezzet artırıcıları (9,10) guanilik asit (GMP) ve inosinik asit (İMP) diye adlandırılan iki pürin ribonükleosit 5’-monofosfatların aktivitesinden kaynaklanır. Sedece Japonya’da yıllık yaklaşık 2500 ton GMP ve İMP üretilir. 3 ana yöntem kullanılır: 1) İMP’ ye giden AMP’nin enzimatik deaminasyonu tarafından takip edilen GMP ve AMP’ ye ulaşan fungal nükleaz yoluyla RNA mayasının hidrolizi 2) kimyasal fosfrorilasyon tarafından takip edilen Bacillus sabtilis mutantlar yoluyla inosin ve guanosin nükleositlerin fermentatif üretimi 3) Brevibacterium amoniagenezinin bütün hücrelerini kullanan enkaz sentezleri ile GMP’ den guanin oluşur. C.glutamicum mutantları ile İMP direkt şeker fermentasyonundan oluşur. Direkt fermentasyon ile İMP’ nin titreleri 27 g/L (10) ulaştı. Pürin ribonükleotid biyosentezlerinin yol izi ( Fig. 5) bütün canlı sistemlerde hemen hemen benzerdir. İlk belirli basamakta, 5’- fosforibosilamine ( PRA)’ yi oluşturmak için, ATP ve riboz- 5- fosfattan türeyen 5’-fosforibosil pirofosfat ( PRPP), glutamin ile amino asitlere eklenir. Dokuz bilinen enzimatik basamaklarınseri ile PRA, oluşan ilk pürin ribonükleotid

olan IMP’ ye dönüşür. Bu pivotal ara ürün AMP ve GMP’nin her ikisinin de prekürsörüdür., İMP daha sonra, aspartatı succinyl dönör gibi ve GTP’ yi enerji kaynağı gibi kullanarak adenylosuccinate ( S-AMP)’ e dönüşür. Adenylosuccinate daha sonra, adenylosuccinate lyase tarafından AMP’ ye dönüşür. Adenylosuccinate lyase enzimi hem bifonksiyonlu bir enzimdir hem de bir önceki basamağı katalize eder. İnosinik asit, XMP’ yi oluşturmak için NAD+ ‘ı bir kofaktör olarak kullanan IMP dehidrogenaz enzimi tarafından okside edilir. İkincisi (XMP), XPM aminaz enzim ile GMP’ ye dönüşür. Bu reaksiyonunda ATP, enerji kaynağıdır ve, organizmaya bağlı olarak, amonyak veya glutamine, amino grup donörüdür. Hem AMP hem de GMP, onların kendilerine ait di- ve tri- fosfatlara dönüştürülerek, nükleik asitlerin sentezi için kullanılabilirler. Alternatif olarak GMP, GMP redüktaz enzim ile IMP’ ye katalize edilebilir (elektron donörü olarak NADPH kullanır) ve APM’ yi IMP maddesine çevirmek için amino grupların eklenmesi ile yapılabilir. Bu tepkiler, her bir birikmiş fazlalığından her iki pürin nukleotidine ortak gösteren ara ürün rejenerasyon siklüsüna izin verir. Tüm purin ribonukleotid arası dönüştürmeler 5’-izomer yoluyla meydana gelir.

Hücre içindeki biyoreaksiyonların kompleksitesinden dolayı, her hücre reaksiyon hızlarının kontrolü çok önemli. Enzim aktivasyon regülasyonu negatif feedback inhibisyon ile yapılırken, enzim sentez regülasyonu ise represyon ile yapılır. Nükleotid biyosentezi kontrol eden tipik feedback kontrol sistemi Figür 6’ da gösterilmiştir. Genellikle AMP ve GMP ortak yol izinde ve onların dallarında feedback represyon ve inhibisyon uygulanır. PRPP amidotransferaz enzimi ile katalize edilen 1. basamak en önemli kontrol yeridir. Bazı organizmalarda yüksek konsantrasyonda AMP ve GMP, tüm enzim faaliyetleri inhibe eder. Diğer organizmalarda ise kümülatif regülasyon tipi gözlenir. Aynı yol izinde yer alan diğer

başka birçok enzimler gibi, amidotransferaz enzim sentezi de AMP ve GMP tarafından baskılanır. IMP dehidrogenaz enzim, diğer önemli bir kontrol yeridir, genellikle GMP tarafından inhibe edilir ve baskılanır. IMP’nin S-AMP’ ye dönüştürmesi ( adenylsuccinate synthase enzim ile katalizlenir) ve genellikle AMP tarafından inhibe ve represyon edilir.

AMP ve GMP maddelerinin sınırlandırması, efektif pürin birikmesinin anahtarıdır. Bu efektif sınırlandırma pürin okzotrofun sıkı beslenmesi ile elde edilir. Böylece, adenine ihtiyaç duyan mutant suşu, adenylsuccinate synthetase (Fig. 7) enziminden eksik ve intrasellüler birikmiş IMP’ leri parçalayarak hipoksontin ve inosin komponentleri birikmektedir. IMP dehidrogenaz enzimin GMP tarafından güçlü inhibisyon represyon nedeni ile birikme, yol izinin GMP’ nin içine giden IMP’ yi aşmıyor. Bacillus subtilis suşunun belirli adenin okzotroflar 10g/L’ den daha fazla inozini salgılar. Bu suşlar, GMP enzim baskılama ortak yol izi için hala bir konudur. Bu düzenlemenin ciddiyetini minimize etmek için daha sonra IMP dehidrogenaz enzimi elimine amacıyla adenin okzotroflar mutasyona uğramaktadır. Bu adenin-xanthine çift okzotroflar ortak yol izlerdeki enzimlerinin belirli faaliyetlerde iki kat artışını gösterir ve adenin ile xanthine (veya guanozin) sınırlandırılmış koşulları altında inozin 15 g/L değerin üzerinde birikir. İlerideki deregülasyonlar, purin analoglara dirençli mutantların seçimi ile başarıya ulaşılır. Böylece, azaguanin’e direnli olan ve adenin ile xanthin’e ihityaç duyan mutant suşlar 20 g/L’ den daha fazla inozini üretmektedir. B.subtilis suşun içinde IMP dehidrogenaz enzimi kodlayan gen inaktivasyonu, 35 g/L inozin ürünü üreten başka bir suş kültürü meydana gelir. İnozin monofosfat dehidrogenaz enzim üzerindeki genetik modifikasyonlar ile oluşturulan yeni gen, 20 g/L guanozin ve 5 g/L inozin üretmektedir. Önceden B.subtilis mikroorganizma 7 g/L guanozin ve 19 g/L inozin maddeleri

üretirdi (12). Diğer B.subtilis mutantlar guanozini 23 g/L miktarında üretir (10). Purimidin üretimine dayanarak, diğer B.subtilis rekombinant suşlar 18 g/L cytidine üretir, ancak, hücredeki aspartat prekürsörün konsantrasyonunu artıran homoserin dehidrogenaz enziminden eksik mutant suşu, cytidine maddeyi 30 g/L miktarında üretmektedir.

Riboflavin ( B2 vitamin, Fig.8) ticari olarak fermentasyon ve kimyasal sentez yoluyla üretilir (15). Riboflavin aşırı üreten 2 maya-benzeri küf çeşidi var, bunlar Eremothecium ashbyii ve Ashbya gossypii riboflavin vitamini 20 g/L miktarından daha fazla üretirler. Riboflavin 1992 de 4 milyar pound civarında üretildi (16). Riboflavin üreten A.gossypii, kendi büyümesi için gerekininden, 40,000 kat daha fazla vitamini üretir. Riboflavin aşırı üretiminin biyokimyasal anahtarı demir represyonuna karşı duyarsızlığı içermektedir. Demir iyonu, clostridia ve Candida gibi zayıf ve ılımlı riboflavin üreticiler ile riboflavin üretimi inhibe eder ama E.ashbyii ve A.gossypii organizmalara karşı hiç bir inhibisyon davranışı göstermemektedirler. Normal mikroorganizmalarda, demir iyonu tüm riboflavin biyosentetik enzimleri inhibe ettiğini gösterir, halbuki riboflavin veya onun türevi, yol izindeki ilk enzim

olan GTP cyclohydrolase II’ yi inhibe etmektedir. Candida sp. veya rekombinant B.subtilis suşlar yarımıyla 20-30 g/L hacminde üreten yeni prosesler birkaç yıl içerisinde geliştirildi.

Vitamin B12 ticari olarak Propionibacterium shermanii veya Pseudomonas denitrificans organizmalar ile üretilir, Fig 9. (16, 18). Bu çeşit mikroorganizma suşu, kendi büyümesi için gereken miktarından 100,000 kat daha fazla B12 vitamini üretirler. Vitamin B12’ nin feedback represyonundan kaçınması fermentasyon için bir anahtarıdır. Anaerobik koşullar altında ve 5,6-dimethylbenzimidazole prekürsörlerin yokluğunda Propionibacterium shermanii fermentasyonun erken basamaklarına yönlenir. Bu koşullar vitamin B12 sentezini önler ve cobinamide gibi ara ürünün birikmesine izin verir. Daha sonra kültürün havalandırılması ile ve dimethylbenzimidazole maddesinin eklenmesi ile, cobinamid vitaminine dönüştürülür. Pseudomonas denitrificans fermentasyonunda, tüm prosesler düşük oksijen koşulları altında gerçeklesir. Oksijenin yüksek olduğu durumlarda, hücre içi ortamı oksitlenir ve yol izinin erken basamaklarda enzimlerin oluşması baskılanır. Pseudumonas denitrificans fermentasyonuna anahtar, betain maddesinin eklemesidir (19). Vitamin B12 aşırı üretimi Pseudomonas denitrificans ile tamamen betain maddesine bağımlıdır fakat bunun kontrol mekanizması henüz tanımlanmamıştır. Vitamin B12 üretim miktarı 150 mg/L düzeylerine ulaşmıştır (18).

Biotin üretiminde, protein acetyl-CoA biotin holoenzyme synthetase enzim ve korepresör olarak davranan biotin 5-adenylate enzimi feedback represyonuna neden olur (20). Serratia marcescense suşu, mutagenezisin biotin antimetabolitlere ve moleküler klonlanmasına karşılık gösteren seleksiyon ile elde edildi ve yüksek sülfür ile ferrous demir konsantrasyonunun varlığında 600 mg/L miktarında biotin üretmektedir (21). Böylece geleneksel kimyasal proses ile iktisadi yönden yarışmaya yeterince kadar yüksektir. Bunun yol izi figür 10’ da gösterilmiştir.

Vitamin C (askorbik asit) yeni sentez prosesi, Corynebacterium sp. suşun geni içeren ve genetiksel olarak tasarlanan Erwinia herbicola suş kullanılmasını içerir. Tasarlanmış organizma glukozu 2-ketogulonik asidine dönüşütürür ve daha sonra 2-ketogulonik asit baz veya asit tarafındn kolayca C vitaminine dönüştürülebilir (23). Diğer bağımsız olarak tasarlanmış yöntemi 40 g/L glukozu 20 g/L 2-keto-l-gulonata çevirir (24). Bu işlem, Erwinia citreus suşuna Corynebacterium sp.’sinden 2,5-diketo-D-gluconate reduktaz enzimi kodlayan gen klonlanmasını içerir. Gluconobacter oxydans bakterinin L-sorbitol dehidrogenaz ve Lsorbosone dehidrogenaz enzimleri kodlayan genlerin plazmid klonlanması yeniden bu organizmaya yerleştirilmesi 150 g/L D-sorbitol 130 g/L 2-keto-L-gulonata dönüştürme yeteneği ile sonuçlandı (25).

Ticari organik asitlerin üretiminden yaygın olarak miselli funguslar kullanıldı. Sitrik asit her yıl yaklaşık 1 milyar pound civarında üretilir. Bu organik asit, trikarboksilik asit siklusunun ilk aşaması ve Embden-Meyerhof yol izi yolundan üretilir (Fig. 11).

İşlemin esas kontrolü, sitrik asit tarafından fosfofruktokinaz enziminin inhibisyonu içerir. Ticari proses, demir ve manganez eksik ortamlarda Aspergillus niger mikroorganizmayı kullanır. Manganez eksikliği, sitrik asidine iki faydalı etki var. 1) hücre içi HN4’ nun yüksek düzeylere ulaştırır. Bu da fosfofruktokinaz sitrik asidin geri inhibisyona neden olur. 2) küçük miselli peletlerin oluşmasına yol açar. Bu da, sitrik asit üretimi için ne uygun morfolojik yapıdır. Morfolojik etki, düşük Mn+ ortamda büyüme ile hücre duvar kompozisyonunda yer alan değişiminden etkilenir. Yüksek konsantrasyonlu sitrik asidin üretimi hücre içi yüksek düzeyde fruktoz 2,6-bifosfatla iş birliği var. 2,6-bifosfat glikolizisinin aktivatörüdür (27). Yüksek sitrik asit üretime neden olan başka faktörler, düşük pH optimumu (1.7-2.0) ve sitrik asitle isocitrat dehidrogenazın inhibisyonudur. Yüksek pH değeri ( örneğin, 3.0) sitrik asidin yerine okzalik ve glukonik asitlerin üretimini tetikler. Düşük pH değeri glukoz oksidaz, enzimi inaktifleştirir. Normalde glukoz oksidaz enzimi glukonik asidi oluşturur (26). Yaklaşık olarak 4-5 gün içerisinde şekerin büyük bir kısmı (%80) sitrik aside dönüştürülür, hacim miktarı 100 g/L ulaşır. Sitrik asidin kolayca özümlenmesi, az toksik olması nedeniyle çok yaygın olarak gıda ve farmasetik endüstrilerde kullanılmaktadır. Asitleştirici ve lezzet-artırıcı ajanı olarak, yağ asitleri ve yağları bozulma inhibisyonunu için antioksidant ajanı olarak, jellerde ve reçellerde buffer ajanı olarak, ve

çeşitli gıdalarda stabilizatör ajanı olarak görev almaktadır. Farmasetik endüstriler yaklaşık % 16 mevcut sitrik asit kullanır. Sitrik asit üretimi için Candida maya türü prosesler geliştirilmiştir, özellikle hidrokarbonları kullanarak. Bu tür mayalar n-paraffin maddesini çok yüksek verimlilikte sitrik asit ve isositrik asitlere dönüştürür ( 150-170 % ağırlık başına). İsositrik asit üretimin yerine sitrik asit üretimi aconitase enziminden yetersiz olan mutant suşların seçimi ile tercih edilir. A.aceti sp.xylinum suşuna plazmid vektör üzerinden Acetobacter polyoxogenes’inden aldehit dehidrogenaz geninin klonlanması, asetik asit ürününün oranını % 100 ( 1.8’den 4 g/L-1h-1’ ye kadar) ve %40 titreyi (68’den 97 g/L’ ye kadar) artırdı (28). Etil alkol, fermente edilebilen polisakkarit veya temel şeker fermentasyon tarafından üretilen asıl primer metabolittir. Bu fermentasyon için, kullanılacağı substrata bağlı olarak, mayalar tercih edilir. Heksoz fermentasyon için Saccharomyces cerevisiae kullanılır iken, pentose ve laktoz fermentasyon için Candida ve Kluyveromyces fragilis maya türleri görev alır. Optimum koşullar altında, 5 gün içinde yaklaşık % 10 – 12 hacim etanol elde edilir. Bu kadar yüksek konsantrasyon maya büyümesini yavaşlatır ve fermentasyon oranı düşer. Özel maya tür yardımı ile fermentasyon % 20 konsantrasyonlu alkol üretimine dönüşerek devam edilebilir. Fakat, bu konsantrasyonlar fermentasyonla ay ve yıllar sonra kazanılır. Şu anda endüstriyel etanol çoğunlukla fermentasyon tarafından imal edilir, ama buna rağmen petrokimyasal endüstri ile elde edilen etanol hala yüksek miktarlarda elde edilir. Clostridium ve Zymomonas gibi bakteriler, etanol üretim açısından yıllar sonra yeniden incelenir. Anaerobik termofil olan Clostridium thermocellum, atık sellülözu doğrudan etanole çevirir. Diğer clostridia bakteri asetat, lactate, aseton ve butanol gibi maddeleri üretir, ayrıca dünyada petrol tüketildiğinde o zaman bu bakteriler kullanılır. Biyokütleden üretilmiş etanol yakıtı benzinden kaynaklanan hava kirletmesinden kurtarır ve ayrıca küresel ısınmaya katkı sağlamaz. Benzinin eliminasyonundan dolayı, etanol benzinin oktan derecesini yükseltmek için bir harman olarak yerine geçiriliyor. E.coli, rekombinant DNA teknolojisi ile mükemmel bir etanol yapımcısına ( % 43 v/v) dönüştürüldü (29). Zymomonos mobilis bakterıden alınan alkol dehidrogenaz ve pirüvat dekarboksilaz genleri E.coli’ ye eklenerek, rejenere NAD sisteminde dominant olmuştu. Genetik olarak tasarlanan bakterilerde, etanol fermentasyon ürünlerinin % 95’ inden daha fazla temsil eder. Multireaksiyonlu fermentasyona ek olarak, mikroorganizmalar biyotransformasyon proseslerin yürütmesinde son derece faydalıdır. Biyotransformasyon işeminde, hücre içinde bulunan bir ya da birkaç enzim tarafından bileşikler yapı bakımından ilgili ürünlere dönüştürülür (30). Kimyasal tepkilerin her türlü uygulama için biyodönüştürücü mikroorganizmalar bilinir. En bilinen ve en eskilerden biyotransformasyon işlemi progesteronun 11 α-hydroxyprogesteron maddesine dönüştürmede kullanıldı ( Fig.12). Bu reaksiyonlar sterospesifik, ve bu spesifitesi steroit biyotransformasyon ile örnek gösterilebilir. Bu özgüllük racemic karışımların çözünürlüğünde kullanır ve bir racemic karışımından ziyade spesifik izomer arzulanır. Biyotransformasyon yüksek değerde ürünleri ile karakterize edilir, (örneğin, 90-100%). Seri şeklinde iş gören enzimleri içeren mikroorganizmaların kullanılması ve ılımlı koşullar altında tepkilerin yürütmesi biyotransformasyonun diğer doğal bir özelliktir. Öyle işlemleri yürütmek için immobilize hücrelerin kullanılmasına büyük bir ilgi gösterir. Çoğu zaman immobilize hücreler serbest hücre ve enzimlere göre daha kararlı ve ekonomik açısından immobilize enzimlerden çok daha uygun. Rekombinant DNA teknikleri, yeni biyotransformasyonların geliştirmesinde faydalı oldu. Örneğin, Saccharomyces cerevisiae içinde fumaraz-kodlanan genin klonlaması, bir tek manipulasyon ile 2 g/L malatın 125 g/L fumarata biyotransformasyonu geliştirilmiştir (31). Tasarlanmış suşun dönüştürme oranı yaklaşık % 90’dır.

Mikroorganizmalar tarafından üretilen sekonder metabolitler, sağlımımız ve beslenmemiz için son derece önemlidir (31). Hayvan ve bitki büyüme faktörleri, antibiyotikleri, pestisidleri, toksinleri, ve başka tıbbı ilaçları içeren bir grup büyük ekonomik öneme sahiptir. Genellikle sekonder metabolitler kesikli veya beslemeli-kesikli kültürde büyüme yavaşladıktan sonra üretilir. Sekonder metabolitlerin üretken kültür büyümesinde (organizmaların doğada hayatta kalmasına katkıda bulundukları halde) hiç bir fonksiyonu yok, ayrıca kısıtlı taksonomik grupları tarafından üretilir ve çoğu zaman yakın kimyasal aile karışımları olarak biçimlendirilir. 1990’ dan 1994’ e sadece actinomycetes’ten 1000 yeni sekonder metabolit karakterize edildi (33). Antibiyotikler, sekonder metabolitlerin en iyi bilinenlerden ( Figür 13 ve 14).

Farklı yapılar ve tarzdaki biyolojik aktif moleküllerin heterojen topluluğu,belirtilen bileşik gruplar tarafından biçimlendirilir (Tablo 2).

1996’ da antibiyotik pazarı 160 antibiyotik ve 23$ milyarlık market içerdi (36). 1940 yıllar itibaren tıbbı, zirat ve temel araştırmalar alanları içinde yeni potentli antibiyotik moleküllerin kullanılışı dünyada büyük tanıklık yaptı. Buna rağmen, sürekli evrimleşen patojenleri ile, doğal dirençli bakteriler, virüsler ve önceden direnci kazanmış mikropları ile savaşabilen yeni antibiyotikleri bulmak için araştırma devam edilir: ayrıca farmakolojik özellikleri geliştirmek; tumör, virüs ve çeşitli parazitleri ile mücadele etmek; daha güvenilir, daha patentli ve daha geniş spekrumlu yapmak amacıyla yeni antibiyotikler sürekli olarak geliştirilir. Yaklaşık 6000 antibiyotik tarif edildi, sadece actinomycetes’ten 4000 idi, ve hala da her yıl 300 oranında yeni antibiyotikler durmadan keşfedilir. Streptomyces griseus bakteri 40 üzeri ve Bacillus subtilis bakteri ise 60 tan daha fazla antibiyotik üretir. S.hygroscopicus bakteri suşu neredeyse 200 antibiyotik üretir. Bir Micromonospora suşu 48 aminosiklitol antibiyotik üretebilir. Antibiyotikler, cycloserine (102 Da) ve bacilysin (270 Da) gibi küçük moleküllü antibiyotiklerden nisin gibi 34 amino asit rezüdeleri içeren uzun polipeptidli moleküllere kadar çeşitlilik gösterir. Antibiyotikler, mikroorganizmanın protein sentezini, membran fonksiyonunu, elektron transportu, spor oluşumu, üremesini ve her türlü DNA, RNA içeren mikrobiyal aktiviteleri bozar. Yeni antibiyoitkler araştırmalar, kimyacılar tarafından doğal ürünleri değiştirerek yapılır. Bu proses semisentez olarak adlandırılır. 1974’ te 20,000 üzeri semisentetik pensislin, 4000 cephalosporin, 2500 tetracyclin, 1000 rifamycin, 500 kanamycin, ve 500 chloramphenicol hazırlanmıştı. 1980 yıllarda dünya çapında antibiyotik üretimi 25,000 ton miktarına ulaşmıştı. 17,000 ton penisilin, 5000 ton tetracyclin, 1200 ton cephalosporin, ve 800 ton erythromycin üretildi. Antibiyotikler, tıbbı kemiteröpatik

olarak sadece insan ve hayvanlarda kullanılmaz, aynı zamanda çiftçilik hayvanların büyümesinde ve bitkilerin korunması için kullanılır. Doğada sekonder metabolitler organizmalar için çok önemli, 1) seks hormonlar; 2) ionophores; 3) bakteri, fungus, amebae, böcek ve bitkilere karşı rekabete dayanan biyolojik silahlar; 4) simbioz ajanları; ve 5) farklılaşma efektörleri (37). Yıllarca, esas farmasötik maddeler bulaşıcı olmayan hastalıklara karşı kesinlikle sentetik ürünler kullanıldı. Bunun gibi hayvanlarda mikrobiyal olmayan hastalıkları için (örneğin, coccidiostats ve antihelmintics) asıl terapötik tedaviler moleküler değişikliği izleyen sentezlenen bileşikleri izlenmesi ile elde edilir. Binlerce sentetik bileşenlerin denemesine rağmen, yapı aşısından sadece bir kısım meydana çıktı. Yeni bileşenleri zor bulmak nedeni ile, mikrobiyal ortamlar ve ürünler mikrobiyal olmayan hastalıkların tedavisi için önemli yer almaktadır. Bugünlerde mikrobiyal olarak üretilen monensin, lasalocid, ve salinomycin gibi polieterler coccidiostat pazarını baskılar, ve aynı zamanda ruminant hayvanlar için esas büyüme ajanı görev yapar. Avermectin, $200 milyonluk pazar alanına sahip streptomycete ürünlerin diğer bir grubu, hayvan bağırsak parazitlere ve artropodlara karşı yüksek etkinliklere sahiptir (39). Gerçekten, avermectin grubun etkinlikleri daha önceden keşfedilmiş birçok sentetik antihelministik ajanlara göre çok daha yüksek değerde olduğunu gösterilmişti. Farmakolojik aktiviteleri bilinen mikrobiyal sekonder metabolitler Tablo 3’ te gösterilmiştir.

Önemli farmakolojik aktivitelere sahip birçok mikrobiyal ürünler, inbitörleri basit enzimatik protokolleri ile araştırırken ortay çıktı (40). En büyük başarı lovastatin (mevinolin) gösterdi. Hayvanlarda kolesterol düşürücü olarak etki gösteren bir compactin grubun (41) içinde fungal ürünüdür. Lovastatin Aspergillus terreus tarafından üretilir. Hidroksi asit formunda mevinolin, karaciğerde bulunan 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coemzyme A reduktaz için yarışan bir inhibitördür. Başka bir enzim inhibitörü olan acarbose enzimidir. Acarbose doğal bir inhibitör, Actinoplanes’ inin bir tür olan actinomycete tarafından üretilen bağırsak glucosidase enzimi (42) inhibe eder. Acarbose, şeker hastalığı, obezite ve tip IV hiperlipidemia hastalıklardan acı çeken hastaların adipoz dokuda, karaciğerde ve bağırsak duvarlarda yer alan hiperglisemi ve triglyceride sentezini düşürür. Ticari kullanım içinde aynı zamanda fungusit (örneğin, kasugamycin, polyoxins), insektisit (örneğin, Bacillus thuringiensis kristal, nikkomycin, spinosyns), herbisit (örneğin,

bialaphores), antihelminsit ve önceden bahsedilmiş coccidiostat, ruminant büyümü teşvik eden ajanlar (örneğin, monensin, lasalocid, salinomycin), bitki büyüme düzenleyiciler (örneğin, gibberelinler), organ nakletmesinde immunosüpresörler (örneğin, cyclosporin A, FK-506, rapamycin (Figür 15)), çiftçilik hayvanlarda anabolik ajanlar (örneğin, zearelanone), uterocontractantlar (örneğin, ergot alkaloids), ve antitümör ajanlar (örneğin, doxorubicin, daunorubicin, mitomycin, bleomycin) (43, 44) yer alır. İlk başta bileşenlerin çoğu bizim yararımız için çalışmak için koyulmuş olmadan önce zayıf veya toksik antibiyotik (örneğin, monensin, cyclosporin, rapamucin) veya mikotoksinler (örneğin, ergot alkaloids, gibberellins, zearelanone) gibi elde ediliyordu. Kuvvetli aktiviteye sahip sekonder matbolitler şu an araştırma altında. Kesikli kültür üretimde, birkaç sekonder metabolit işlemleri bir ürün büyüme aşaması (trophophase) ile izleyerek ürün üretim aşamasını (idiophase) sergiler. Başka fermentasyonlarda, trophophase idiophase ile üstüste biner; zamanlama kültüre sunan nutrient ortama, büyüme oranına, veya her ikisine de bağlı olmaktadır. Doğada sekonder metabolit ürünleri organizma için farklılaşmaya ve diğer organizma formları ile tesirli olarak yarışmaya izin verir. Trophophase safhası organizma üretimine yardım edinceye kadar antibiyotik üretimini geciktirir, çünkü çoğu zaman mikroorganizmalar büyüme sırasında kendi üreten antibiyotiklere karşı oldukça hassaslar. Sekonder metabolitleri üreten mikrorganizmalarda resistans mekanizması antibiyotik enzimatik modifikasyonu, hücre hedefinin deşikliği, ve azalmış salgılanan antibiyotik alımını içerir.

İkincil metabolizma ürünlerinin hammaddesi olan birincil metabolizma ürünleri, sekonder matabolitler üzerinde negatif ya da pozitif etki gösterebilirler. Gelişme programlarında kullanılacak ortamların manipülasyonu yapılırken, eklenecek olan maddeler ve optimum prekürsör miktarları denenir. Bazen ürün miktarı artmış prekürsörlerde bulunmaktadır. Prekürsör, bazen, fermentasyonu istenen spesifik ürünün üretimine çevirebilir. Bu olaya direkt biyosentez denilmektedir. Bir çok fermentasyon prosesinde prekürsörler etki göstermezler, çünkü yeterli miktarda değillerdir. Bir çok durumda eklenecek maddelerin taranması dramatik sonuçlar doğurur,sekonder metabolit üretiminde nonprekürsör moleküllerin stimülasyonu ya da inhibisyonu gibi. Bu etkiler daima fermantasyon organizmasında, bileşenlerin interaksiyonu ile olmaktadır. Sekonder metabolizmada düzenleyici matabolizmalar, birincil metabolizmadakiler ile aynıdır. Kloramfenikol, akrilamin sentetazın represyonu ile kendi sentezini limitleyebilmektedir. ERgot alkoloidlerde, dimetilal transferazı inhibe ederek regülasyon metabolizması çalışır. Bu enzimler sekonder metabolit yol izlerindeki başlangıç enzimleridir.Glikoz çabuk büyüme için karbon katabolit

represyonunda kullanılır. Benzer olarak ta amonyum iyonları ya da sık kullanılan amino asitler nitrojen metabolizması ile sekonder metabolizmada kullanılırlar. İnorganik fosfatın sekonder metabolit üretiminde güçlü negatif etkisi vardır. Alkoloid ve antibiyotik üretiminde enzim indüksiyonu çok belirgindir. Aktinomisetlerde gama bütirol aktonlar otoindüktör rol alırlar. Daha önce bahsedilen spesifik regülasyon tiplerinin ötesinde , sekonder metabolisma büyüme hızı ile de kontrol edilmektedir. Maksimum spesifik büyüme hızında, genellikle sekonder metabolitler üretilmez. Fakat, kullanılan ortam düşük hızdaki büyümeleri etkileyecek ortamsa idiofaz tropofaza kayabilir. Antibiyotik biyosentezi antibiyotik bozulmasıyla ya da bu enzimlerin feedback inhibisyonu ya da represyonu ile durabilir. Çünkü kontrol mekanzimaları genetik mekanizmlarla gerçekleşmektedir ve mutasyon, sekonder metabolizma da ana etkiyi yapmaktadır. Metabolitlerin aşırı üretimi için, çevre koşullarının manipülasyonunun önemliliği kanıtlanmıştır. Fermantasyon parametrelerinin (pH, oksijen transferi ve sıcaklık gibi) optimizasyonu da oldukça önemlidir. Eğer proses indüklenebilen bir proses ise, indüktör eklenir. Sefalosporin C formasyonu için metionin, tilosin üretimi için valin ergot alkoloid üretimi için de triptofan kullanılması örnek verilebilir. Aslında bütün fermentasyon proseslerinde, başlangıç safhasındaki dengesiz büyüme şartlarında etkili olan anahtar elementler bilinmelidir. Bu elementler genellikler büyümeyi durduran ve ürün birikimine neden olan nutrientlerdir. Genetiğin, antibiyotik gibi sekonder metabolit üretimi üzerinde uzun bir geçmişi vardır. Fermentasyon verimindeki muazzam artışlar ve maliyetlerin azalmasında mutagenezin ve yüksek üretim yeteneğine sahip suşların taranmasının önemi büyüktür. Mutasyon;  Metabolitlerin üretilme oranlarının olumlu yönde dağılımını  Sekonder metabolizma yol izlerinin aydınlatılmasında  Yeni bileşimlerin kazanılmasında da önemli rol oynar. Medikal alanda kullanılan dimetiltetrasiklin ve adriamisin gibi bileşiklerin üretimi basit mutasyonlarla sağlanmıştır. Mutasyonel biyosentez tekniği bir çok aminoglisid, makrolid ve natrasiklin antibiyotiğin keşfinde kullanılmaktadır.Yenilerde ise ticari avermektin üretiminde kullanılmaya başlanmıştır. Protoplast füzyonda farklı suşlar arasında genetik rekombinasyonu sağlayarak yeni antibiyotiklerin üretimi sağlanmaktadır. Protoplast füzyon aynı zamanda penisilin broth dan istenmeyen komponentlerin eliminasyonunu da sağlamaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi antibiyotik üretiminde uygulanmaktadır. Natibiyotik biyosentezinde rol alan bir çok özel enzim geni klonlanarak yüksek eksprese olabilen heterolog mikroorganizmalara verilir. Rekombinant DNA teknolojisi limitli enzimlerin aşırı üretimine de öncülük eder. Bu sefalosporin biyosentezinde başarılmıştır. Ek olarak mikroorganizmalardaki antibiyotiğe dayanıklılık genleri de klonlanıp eksprese olmaktadır. Aktinomisetlerde antibiyotik biyosentez yol izini kontrol eden genler kromozomlarda kümelenmiştir. Bu şekilde bütün bir yol izi tek bir manipülasyonla kontrol edilmektedir. Aktinorhodin yol izi genleri Streptomyces coelicolor kromozomları üzerinde kümelenmiş haldedir. Yeni ve modifiye ürünlerin keşfi için, rekombinant DNA teknolojisi ile istenilen antibiyotiği üretmeyen suşlara gen aktarımı yapılarak bu antibiyotiklerin eldesi sağlanmaktadır. İzokromakinon antibiyotik üreten streptomiset suşlarından alınan genlerin granatisin, dihidrogranatisin ve mederomisin üretimi yapan suşlara aktarılması ile iki yeni antibiyotik türevi elde edilmiştir. Mederrohidin A ve dihidrogranatirhodin. Hibrit bir antibiyotik olan izovalerilspiramisin, carbomisin üretimi yapan S. thermotolerans dan alınan carE geni, spiramisin üreten S. Ambofaciens’a aktarılması ile elde edilmiştir.

Birçok yeni poliketid sekonder metaboliti, poliketid üreten suşlardan alınan genlerin streptomisetlere aktarılması ile elde edilmiştir.