Metabolismul Nucleotidelor Curs

METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt compuşi care îndeplinesc o multitudnine de funcţii celulare, fiind implicati practic (direct sau indirect) in toate tipurile de metabolisme. STRUCTURA NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt formate dintr-o bază azotată (purinică sau pirimidinică), o pentoză (riboza sau 2-deoxiriboza) şi una sau mai multe molecule de acid fosforic. Derivaţii purinici majori din celulă sunt adenina şi guanina. Alte baze întâlnite sunt hipoxantina şi xantina, intermediari din metabolismul adeninei şi guaninei. Bazele azotate pirimidinice sunt reprezentate de uracil, timina (derivatul metilat al uracilului) si citozina.

Fig. 1: Baze azotate purinice si pirimidinice Orice baza azotata cuplata cu o pentoza formeaza un nucleozid iar daca peste aceasta se asociaza si una, doua sau trei resturi de acid fosforic – vorbim de nucleotide mono, di si respectiv trifosfat:

N H 2 Adenina (baza azotata) N N N

N

O

O

O

CH 2O P-O-P-O-P-OH Riboza

H

H

H

N ucleotid Adenozintrifosfat

OH OH OH

H

3 resturi de H 3PO 4

OH OH N ucleozid (adenozina)

Fig 2: ATP are ca baza azotata adenina. Aceasta formeaza cu o pentoza (riboza) un nucleozid care genereaza un nucleotid impreuna cu trei resturi de acid fosforic. Nucleozidele derivate din aceste molecule conţin riboză sau deoxiriboză legată la nucleul purinic printr-o legătură β-N-glicozidică la atomul N-1. Ribonucleozidele conţin riboză în timp ce deoxiribonucleozidele conţin deoxiriboză (o moleculă de riboză în care gruparea hidroxil din poziţia 2 lipseşte, fiind inlocuită cu hidrogen). O

HN

O

N

O O

O

H

H

H

H

H OH

P

O-

O-

Fig 3: d-TMP, deoxiribonucleotid intalnit doar in structura ADN Nucleotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor. 3’-nucleotidele ca de exemplu adenozin-3’-monofosfatul (3’-AMP) se gasesc în celulă ca rezultat al degradării acizilor nucleici. În celulele normale, di şi tri – fosfat nucleozidele se găsesc în concentraţie mai mare decât monofosfat nucleozidele, nucleozidele sau bazele libere. Citozina şi uracilul sunt pirimidinele din nucleotidele care intră în structura ARN în timp ce timina şi citozina se găsesc în compoziţia ADN.

Ca şi derivaţii purinici, nucleozidele sau nucleotidele pirimidinice conţin fie riboză, fie deoxiriboză. Glucidul este legat la pirimidină printr-o legătură β-Nglicozidică la atomul N-1. Nucleozidele pirimidinice sunt uridina, citidina sau timidina (respectiv deoxiuridina, deoxicitidina sau deoxitimidina). Esterii monofosforici ai nucleotidelor pirimidinice sunt UMP, CMP şi TMP. În celulă compuşii majori pirimidinici conţin 2 sau 3 resturi de fosfat. Grupele fosfat sunt responsabile de încărcarea negativă a nucleotidelor şi a acizilor nucleici.

În concluzie se poate vorbi de mai multe structuri care sunt strâns legate unele de altele. Astfel avem 5 baze azotate mai importante (2 cu heterociclu purinic – adenina şi guanina şi 3 cu heterociclu pirimidinic – uracil, timina şi citozina), 5 nucleozide (care conţin pentoze) şi 5 nucleotide (care conţin 1,2 sau 3 resturi de acid fosforic). De menţionat că numărul acestor structuri este de fapt dublu dacă ţinem cont că putem avea ca pentoze şi riboza şi deoxiriboza. In afara de cele 5 baze azotate numite şi majore, se mai cunosc baze azotate minore. Acestea se gasesc într-o cantitate relativ mică atât în structura ADN-ului cât şi a ARN-ului, caracterizându-se prin mici modificari ale nucleelor purinice sau pirimidinice (metilări, prezenţa sulfului, izomeri ai nucleelor, etc).

Fig 4: baze azotate rare Functiile nucleotidelor: - cea mai importantă este funcţia de suport informaţional deoarece nucleotidele intră în structura acizilor nucleici (atat pentru ADN – folosindu-se bazele azotate A, T, C, G cat si pentru ARN – care contine bazele azotate A, U, C, G). - depozite energetice – moneda de schimb intre reactiile producatoare de energie (exergonice) si cele consumatoare de energie (energonice). Cel mai cunoscut exemplu e ATP (adenozin trifosfat) dar de fapt orice nucleotid cu legaturi macroergice poate fi considerat ca „purtator al energiei chimice”. - transportori pentru unii intermediari activaţi din sinteza unor carbohidraţi, lipide şi proteine: UDP – glucoza din glicogenogeneza, CDP – colina din metabolismul fosfolipidelor, etc.

-

-

componente esenţiale ale unor coenzime: FAD – flavin adenin dinucleotid sau coenzima vitaminei B2, NAD+, NADP+ - nicotinamid dinucleotid fosfat sau coenzimele vitaminei PP şi coenzima A – derivat cu nucleotid de la acidul pantotenic). reglatori pentru unele căi din metabolismul intermediar, inhibând sau activând enzimele cheie din diferite căi metabolice. mesageri secunzi in caile de transmitere ale informatiei de la mesagerul primar (hormon) la unitatile efectorii celulare (ex – AMPc – cel mai cunoscut mesager secund). NH2

fosfodiesteraza

N

Fig 5: AMPc – sinteza si degradare

AMP

N N

N O H

ATP

adenilatciclaza CH 2O

H

H

OH

O

PP

H P=O OH

Bazele purinice şi pirimidinice din nucleotide pot fi sintetizate de novo sau pot fi obţinute prin căi de salvare care permit reutilizarea bazelor preformate rezultate din turnoverul celular normal sau din dietă. PROPRIETĂŢILE NUCLEOTIDELOR Componentele celulare conţinând fie baze purinice, fie pirimidinice pot fi evidenţiate uşor datorită absorbţiei puternice în ultraviolet a acestora. Bazele purinice, nucleozidele şi nucleotidele corespunzătoare au absobţie mai puternică decât pirimidinele şi derivaţii acestora. Lungimea de undă la care se află maximul de absobţie a acestor compuşi este în funcţie de baza componentă, dar în cele mai multe cazuri este în jur de 260 nm. Spectrul de absobţie în UV pentru nucleozide sau nucleotide variază în funcţie de pH. Absorbţia în UV şi diferenţele care apar datorită structurii specifice a bazelor reprezintă o metodă de cercetare pentru acesti compuşi. Legătura N-glicozidică din nucleozidele purinice sau pirimidinice este stabilă faţă de alcalii, în timp ce stabilitatea acestor legături la hidroliza acida diferă: legătura N-glicozidică din nucleozidele şi nucleotidele purinice este uşor hidrolizată de acizi diluaţi la temperatură ridicată (60°C) când se eliberează baza purinică şi glucidul sau glucid-fosfatul. Legătura Nglicozidică din nucleozidele şi nucleotidele pirimidinice este foarte stabilă la acest tratament. Totuşi, condiţii mai severe ca de exemplu acid percloric 60% şi 100°C hidrolizează aceste legături eliberând pirimidina cu distrugerea completă a pentozei. Datorită înaltei polarităţi a grupului fosfat, nucleotidele purinice sau pirimidinice sunt mult mai solubile în soluţii apoase decât nucleozidele şi bazele lor libere. În general nucleozidele sunt mai solubile decât bazele purinice sau pirimidinice libere.

Datorită caracterului aromatic al purinelor şi pirimidinelor, substituenţii oxo sau amino participă la tautomeria: ceto – enol şi amino – imino.

Fig 6: guanina – forme tautomere amino-imino si ceto-enol DISTRIBUŢIA NUCLEOTIDELOR ÎN CELULĂ Derivaţii 5’-nucleotidici sunt formele principale ale compuşilor purinici şi pirimidinici. Concentraţia intracelulară a nucleotidelor variază mult şi depinde de tipul de celulă. ATP – ul este nucleotidul cu cea mai mare concentraţie intracelulară. De exemplu în globulele roşii adenin-nucleotidele se găsesc în exces faţă de alte nucleotide prezente în concentraţii extrem de mici. În ficat şi alte ţesuturi este prezent spectrul complet de mono, di şi trifosfonucleotide ca şi UDP-glucoza, acidul UDPglucuronic NAD+ şi NADP+. Bazele libere, nucleozidele sau 2’ şi 3’ nucleotidele din fracţia acid solubilă din celulă reprezintă produşi de degradare ai nucleotidelor endogene şi exogene sau acizilor nucleici. Prezenţa aşa numitor baze minore este datorată degradării acizilor nucleici. Concentraţia ribonucleotidelor din celulă este de ordin milimolar în timp ce concentraţia deoxiribonucleotidelor din celulă este de ordin micromolar. Nivelu de deoxiribonucleotidelor este subiectul flutuaţiilor majore din timpul ciclului celular, comparativ cu nivelul ribonucleotidelor care rămâne relativ constant. În condiţii normale, concentraţia totală a nucleotidelor oscilează în limite foarte stricte, însă concentraţia componentelor individuale poate varia. De exemplu concentraţia totală a adenin-nucleotidelor (AMP, ADPşi ATP) este constantă dar variază raportul ATP/AMP+ADP, dependent de starea energertică a celulei. Aceste “concentraţii fixe” se datorează faptului că sinteza nucleotidelor este una din căile metabolice cele mai fin reglate din celulă. EXEMPLE DE FUNCŢII METABOLICE ALE NUCLEOTIDELOR Toate tipurile de celule (mamifere, bacterii şi plante) conţin o mare varietate de nucleotide şi derivaţii lor. Unele din aceste nucleotide se gădsesc în concentraţii relativ mari (de ordin milimolar) în celule. Numărul mare de nucleotide şi derivate ale acestora din celulă este motivat de implicarea acestora într-o multitudine de procese metabolice importante pentru dezvoltarea şi creşterea normală a celulelor. Principalele roluri lae nucleotidelor sunt: - unităţi monomerice ale macromoleculelor informaţionale, ADN şi ARN. În sinteza acizilor nucleici, nucleozid-5’-trifosfaţii sunt substrate şi sunt legaţi în polimer prin legături 3’,5’-fosfodiesterice (cu eliberare de pirofosfat). - mediatori fiziologici: nucleotidele sau nucleozidele servesc ca mediatori ai proceselor metabolice cheie.

-

-

-

AMPc este unul dintre cei mai cunoscuti mesageri secunzi (ex: reglarea glicogenolizei mediată de epinefrină şi glucagon). GMPc activează ca mediator şi alte evenmente celulare. ADP este indispensabil agregării plachetare normale şi deci coagulării sângelui. adenozina produce dilataţia vaselor coronare şi prin urmare este importantă pentru reglarea circulaţiei coranariene. GTP este necesar pentru funcţii ca: transducerea semnalului de către proteinele G care leagă GTP în scopul activării acestora. componente ale coenzimelor: NAD+, NADP+, FAD, FMN, adenozilcobalamina, S-adenozil-metionina şi CoA sunt constituenţi celulari implicaţi direct în multe mecanisme enzimatice. rol în metabolismul energetic: ATP este principala formă de stocare a energiei chimice în celulele vii. Sinteza ATP se poate face cu ajutorul reacţiilor de fosforilare oxidativă cuplate cu lanţul respirator mitocondrial şi cu ajutorul reacţiilor de fosforilare la nivelul substratului. ATP este utilizat pentru a dirija reacţiile metabolice şi este implicat în diverse procese consumatoare de energie: contracţia musculară, transportul activ prin membrane, generarea potenţialelor de acţiune în celule specializate, etc. Ca agent de fosforilare ATP serveşte ca donor de fosfat pentru generarea altor nucleozid-trifosfaţi (GTP, UTP, CTP şi TTP). intermediari activaţi: nucleotidele servesc ca transportori de intermediari „activaţi” necesari pentru o varietate de reacţii. Ca exemple se pot da: UDPglucoza este intermediar cheie în sinteza de glicogen, glicoproteine şi acid glucuronic; GDP-manoza, GDP-fucoza, UDP-galactoza, acidul CMP-sialic sunt intermediari cheie în reacţiile în care restul de zahăr este transferat pentru sinteza de glicoproteine; CDP-colina, CDP-etanolamina sau CDPdiacilglicerolul cu rol în metabolismul fosfolipidelor; S-adenozil metionina (SAM) şi 3’-fosfoadenozin-5’-fosfosulfatul (PAPS) sunt compuşi donori de metil respectiv sulfat în diverse căi metabolice. efectori alosterici: multe trepte reglate din căile metabolice sunt controlate de concentraţia intracelulară a nucleotidelor.

BIOSINTEZA NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt sintetizate prin 2 tipuri de reacţie: de novo, adică din molecule mici precursoare şi de salvare din purinele şi pirimidinele care pot fi reutilizate după catabolismul acizilor nucleici. BIOSINTEZA NUCLEOTIDELOR PURINICE A. Sinteza de novo a nucleului purinic în celulele mamiferelor utilizează aminoacizi ca donori de C şi N iar CO2 şi formiatul ca donor de C. În figura 7 sunt indicate sursele de C şi N din bazele azotate purinice.

Fig 7: sursele scheletului purinic S-a demonstrat că nivelul glutaminei şi aspartatului influenţează rata sintezei acestor nucleotide în celulele tumorale. Multe din reacţiile acestei căi necesită ATP.

Toate enzimele implicate în sinteza purin-nucleotidelor se găsesc în citoplasma celulară dar nu toate celulele sintetizează nucleotide. O serie de 10 reacţii conduc la sinteza de novo a inozin-monofosfatului (IMP) care serveşte ca precursor pentru adenozin-5’-monofosfat (AMP) şi guanozin5’-monofosfat (GMP).

CONVERSIA IMP LA AMP ŞI GMP Conversia IMP la GMP necesită ATP ca sursă de energie în timp ce conversia spre AMP necesită GTP. Prin urmare, dacă în celulă există suficient ATP, IMP va fi convertit la GMP şi invers, când este suficient GTP în celulă IMP este convertit la AMP.

Rata sintezei depinde de disponibilitatea R-5-P şi de activitatea PRPPsintetazei, o enzimă sensibilă la concentraţia de fosfat şi la purin-ucleotidele care acţionează ca reglatori alosterici. Reacţia 2 de formare a 5-fosforibozil aminei este trepta de control în cadrul sintezei şi este puternic reglată de nucleotidele IMP, GMP şi AMP. La punctul de ramificare al căii, cele 2 enzime IMP dehidrogenaza şi adenilosuccinat sintetaza au valori ale KM similare pentru IMP, AMP este un inhibitor competitiv al adenilosuccinat sintetazei în timp ce GMP este inhibitor competitiv pentru IMP-dehidrogenaza. Printr-un mecanism de feed-back AMP şi GMP inhibă PRPP-amidotransferaza. Produşii finali ai biosintezei de novo acţionează ca efectuori negativi asupra enzimei care catalizează reacţia 2. Concentraţia PRPP în celulă este un determinant major în sinteza nucleotidelor purinice şi reflectă rata sintezei, utilizarea şi degradarea lor.

CALEA DE SALVARE Eficienţa metabolismului celular în condiţii normale se datorează aşa numitei căi de salvare în care bazele preformate (din surse exogene sau din turn-over-ul acizilor nucleici) pot fi reutilizate, cu economisirea unor mari cantităţi de energie pentru celulă.

Enzima care catalizează ambele reacţii este hipoxantin-guanin-fosforiboziltransferaza (HGPRT) şi necesită ioni de magneziu. Este reglată de prezenţa IMP sau GMP care acţionează ca inhibitori competitivi.

Nucleozid difosfaţii sunt sintetizaţi din NMP corespunzător şi ATP care se găseşte în concentraţie mai mare în celulă. Enzimele implicate sunt adenilat kinaza sau guanilat kinaza.

Adenilat chinaza este acctivă în ficat şi muşchi unde concentraţia ATP este mare. NDP şi NTP sub acţiunea nucleozid difosfat chinazei sunt interconvertibili.

Enzima care catalizează această reacţie este adenin fosforibozil transferaza (APRT-aza) şi necesită ioni de Mg. Produsul reacţiei este AMP care funcţionează şi ca inhibitor al enzimei. Aceste reacţii sunt importante nu numai pentru faptul că se conservă energia, dar permit unor celule (ex.: eritrocitul) să formeze nucleotide din baze azotate simple. Aceste celule nu sintetizează 5-P-ribozilamină din PRPP din cauza lipsei enzimei PRPP-amidotransferazei, motiv pentru care depind de fosforiboziltransferaze pentru a sintetiza nucleotide. DEGRADAREA PURINELOR Nucleotidele, nucleozidele şi bazele purinice parcurg o cale comună de degradare. Produsul final al acestei degradări la om este acidul uric. Enzimele implicate în degradarea acestori compuşi variază ca specificitate.

Xantin oxidaza (XO) este o enzimă care conţine FAD, Fe (III) şi Mo (VI) în reacţiile catalizate oxigenul este substrat generânduse apă oxigenată ca produs de reacţie.

Există afecţiuni clinice în care nivelul seric al acidului uric este crescut. Guta primară este un deficit metabolic de reglare al catabolismului purinelor şi se caracterizează prin hiperuricemie. Clinic guta se manifestă prin crize de artrită acută (atac de gută) legată de inflamaţia produsă prin depozitarea cristalelor de urat de sodiu greu solubil la nivelul articulaţiilor. Prin acelaşi fenomen precipitarea uratului de sodiu la nivel renal poate produce litiază renală. Există şi hiperuricemie secundară datorată unei superproducţii de acid uric în cadrul unor afecţiuni în care catabolismul purinelor este accelerat: cancer, iradiere, boli endocrine, etc. Tratamentul clasic cu alopurinol inhibă competitiv xantin oxidaza scăzând în acest fel produsul final de catabolism care este greu solubil. Deficienţa de adenozin dezaminază (ADA) cauzează imunodeficienţă, implicând disfuncţia celulelor T şi B. Deficienţa de purin nucleozid fosforilaza duce la creşterea nivelului de purin nucleozide şi nucleotide. METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE A. SINTEZA Pirimidinele sunt sintetizate de novo în celulele mamiferelor din aminoacizi. Se folosesc glutamina şi aspartatul ca donor de azot şi carbon, iar CO2 ca donor de carbon.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Secvenţa de reacţii care duce la sinteza nucleotidelor este: formarea carbamil fosfatului (C-2 şi N-3 din nucleu de pirimidină). adiţia aspartatului (N-1, C-4, C-5 şi C-6). Reacţia este considerată treapta de reglare în sinteza de pirimidine. închiderea nucleului cu formarea acidului dihidroorotic. oxidarea la acid orotic. adiţia ribozo-5-fosfatului sub acţiunea orotat fosforibozil transferaza. PRPP este donor de ribozo-5-P. decarboxilarea orotidin-monofosfatului. Enzima implicată se numeşte OMPdecarboxilaza şi lipsa acesteia duce la aciduria orotică. sinteza de UTP, CTP sau TTP.

Deşi calea de sinteză de novo necesită prezenţa a 6 activităţi enzimatice care catalizează 6 trepte, acestea sunt produse numai de 3 gene: - Carbamil fosfat-sintetaza, aspartat carbamil-transferaza şi dihidro-orotaza, (abreviate PYR 1-3 sau CAD) se găsesc pe acelaşi lanţ polipeptidic ( 200000 Da). - Dihidro-orotat-DH este o proteină separată. - Orotat-fosforibozil transferaza şi OMP-decarboxilaza (PYR 5-6) sunt pe acelaşi lanţ polipeptidic (51000 Da). Enzimele multifuncţionale PYR 1-3 şi PYR 5-6 se găsesc în citosol, în timp ce dihidroorotat-DH este o enzima mitocondriala. Deci produsul final al acestor reacţii este UMP. Formarea citidin nucleotidelor are loc din uridin nucleotide, cu precădere din derivaţii trifosforici mai curând decât monofosforici.

Concentraţii mai mici de 0,2 mM GTP stimulează activitatea CTP sintetazei de 5-10 ori. Deşi carbamilfosfat sintetaza I mitocondrială este diferită de cea citoplasmatică II, în condiţii de stres fiziologic, când în ficat este un exces de amoniac, enzima I sintetizează carbamilfosfat care trece din mitocondrii în citoplasmă şi devine substrat pentru aspartat carbamil transferază. Când concentraţia de amoniac este mare (toxică) s-a observat o eliminare mai mare de acid orotic. Calea de sinteză a pirimidinelor diferă de cea a purinelor: - în sinteza purin nucleotidelor legătura N-glicozidică se formează în prima treaptă care este şi treapta de reglare în timp ce în sinteza pirimidin nucleotidelor mai întâi se formează nucleul de pirimidină şi apoiu legătura Nglicozidică. - toate enzimele implicate în sinteza de nucleotide purinice sunt în citoplasmă în timp ce în sinteza pirimidin nucleotidelor una se găseşte în mitocondrii (orotatDH) şi celelalte cinci fiind prezente în două proteine din citosol. REGLAREA SINTEZEI Are loc la nivelul a două enzime: - carbamil fosfat sintetaza care este inhibată de UTP. - OMP-decarboxilaza (inhibitorii enzimei sunt UMP şi într-o măsură mai mică CMP). Deoarece OMP-decarboxilaza şi orotat fosforibozil transferaza sunt pe acelaşi lanţ polipeptidic, funcţionarea lor este simultană. B. CALEA DE SALVARE Pirimidinele provenite numai din acizii nucleici celulari (nu şi cele din aportul exogen) pot fi salvate cu ajutorul unei reacţii de fosforilare a nucleozidelor corespunzătoare:

Există 2 tipuri de kinaze: o enzimă acceptă ca substrat uridina şi citidina şi alta timidina. S-ar părea ca acest tip de reutilizare e mai important decât in cazul purinelor. FORMAREA DEOXIRIBONUCLEOTIDELOR Concentraţia deoxiribonucleotidelor este extrem de redusă pentru celulele în repaus. Numai în timpul replicării în ADN (faza S) fondul de nucleotide creşte pentru a susţine această sinteză. Deoxiribonucleotidele se formează prin reducerea directă în poziţia 2’ a ribonucleotidelor corespunzătoare.

Reacţia este reglată nu numai de efectori alosterici dar şi de modificări ale concentraţiilor enzimelor implicate. Enzima care catalizează transformarea este nucleozid difosfat reductaza (ribonucleotid reductaza). Această reducere a NDP necesită un nucleozid trifosfat specific (NTP) ca efector alosteric pozitiv sau negativ al enzimei. Ribonucleotid reductaza este formată din 2 subunităţi identice care separat nu aă activitate enzimatică. Una din subuntăţi conţine centrii de legare a efectorului în timp ce a 2-a subunitate conţine fier neheminic şi un radical liber tirozil (probabil care face parte din centrul aactiv al enzimei). Cele 2 subunităţi care formează enzima activă sunt codificate de gene separate care sunt exprimate diferenţiat în timpul ciclului celular. La mamifere nu este clar dacă există o singură enzimă pentru toate substratele (CDP, UDP, ADP, GDP) sau dacă sunt enzime şi centri de legare separaţi. Deoxi-ATP este un puternic inhibitor al reductazei celor 4 substrate. Acest fapt furnizează bazele biochimice pentru toxicitatea deoxiadenozinei pentru multe celule mamifere. Tioredoxina este o proteină cu masă moleculară mică (12000) care este oxidată în timpul reducerii grupului 2’-OH din restul de riboze. Pentru a completa ciclul catalitic tioredoxina redusă este regenerată de către tioredoxin-reductază (o flavoproteină) şi ENADPH. Ribonucleotid reductaza este singura enzimă responsabilă de cataliza reacţiei de formare a deoxinucleozid trifosfaţilor necesari pentru replicarea ADN. În controlul nivelului deoxiribonucleotidelor din celulă sunt utilizate cel puţin 2 căi: - concentraţia celulară a reductazei. - reglarea strict alosterică a activităţii enzimei de către NTP. SINTEZA DEOXITIMIDILATULUI Deoxitimidilatul se formează prin transferul concomitent cu reducerea unei unităţi cu un singur atom de carbon (metil) pe deoxiuridin monofosfat (dUMP). Reacţia este catalizată de timidilat sintaza şi necesită N5N10-metilen-FH4 ca transportor de fragmente cu un carbon.

dUMP pentru această reacţie provine din 2 căi diferite: dezaminarea dCMP sub acţinea enzimei dCMP-dezaminaza şi reducerea UDP la dUDP care este convertit apoi la dUMP. CATABOLISMUL PIRIMIDIN NUCLEOTIDELOR Din turnover-ul acizilor nucleici se formează pirimidin nucleotide care se află într-o continuă dinamică, fiind constant sintetizate şi degradate.

Prin catabolism nucleotidele sunt degradate la nucleozide şi apoi la baze libere (uracil şi timină). Conversia la nucleozide este catalizată de fosfataze nespecifice. Deoxicitidilat dezaminaza are preferinţă pentru dCMP dar poate utiliza şi CMP ca

substrat. Citidina şi deoxicitidina sunt dezaminate la uridină şi respectiv deoxiuridină de către nucleozid dezaminaza. Uridin fosforilaza catalizează fosforoliza nu numai a uridinei dar şi a deoxiuridinei şi deoxitimidinei. Trebuie subliniat că celulele mamiferelor conţin o deoxi-UTP fosforilază specifică în concentraţie mare care catalizează reacţia: dUTP  dUMP + pirofosfat Uracilul şi timina sunt degradate mai departe la β-alanină şi β-amino izobutirat. Enzimele implicate în această etapă de degradare sunt: - dihidropirimidin-dehidrogenaza - dihidropirimidinaza - ureidopropionaza

Acidul β-amino izobutiric este excretat prin urină şi nivelul lui creşte la pacienţi cu cancer supuşi chimioterapiei sau radioterapiei (la aceştia un nr. Foarte mare de celule sunt omorâte şi ADN-ul degradat). NUCLEOZID ŞI NUCLEOTID KINAZELE Purin şi pirimidin nucleotidele sunt sintetizate “de novo” ca monofosfat. Totuşi cele mai multe reacţii dacă nu toate necesită nucleotide ca difosfaţi sau trifosfaţi. În acest sens există kinaze specifice care “salvează” nucleozidele ca nucleotide şi care convertesc nucleozid monofosfaţii la di şi trifosfaţi. De exemplu:

Alte kinaze care catalizează astfel de reacţii sunt: - pirimidin nucleozid monofosfat kinaze a căror substrate sunt CMP, UMP şi dCMP. - timidin kinaza - timidilat kinaza - adenozin kinaza - nucleozid difosfokinaza - AMP kinaza - GMP kinaza COMPUŞI CARE INTERFERĂ CU METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PURINICE ŞI PIRIMIDINICE – AGENŢI CHEMOTERAPEUTICI Sinteza de nucleotide purinice şi pirimidinice este necesară pentru replicarea, menţinerea şi funcţionarea normală a celulelor. Reglarea acestei sinteze are o deosebită importanţă deoarece defecte ale unor etape din aceste căi sunt la originea difweritelor afecţiuni. Mulţi compuşi care au fost sintetizaţi sau izolaţi ca produşi naturali din plante, bacterii sau fungi sunt inhibitori relativ specifici ai enzimelor implicate în producerea sau interconversia nucleotidelor. Aceşti compuşi utilizaţi în terapia multor afecţiuni au fost clasificaţi ca: antimetaboliţi, antifolaţi, antagonişti ai glutaminei şi alţi compuşi. ANTIMETABOLIŢII sunt analogi structurali ai bazelor azootate purinice sau pirimidinice sau ai nucleozidelor şi interferă cu enzimele din căile specifice acestora. Dintre aceştia amintim:

1. 6-mercaptopurina şi 6-tioguanina sunt utilizate în tratamentul leucemiei cronice. Activitatea citostatică este legată de formarea 6-mercaptopurin ribonucleotidelor de către celulele tumorale.

Utilizând PRPP şi HGPRT-aza, 6-mercaptopurin ribonucleozid 5’-monofosfatul se acumulează în celulă şi serveşte ca efector negativ al PRPP amidotransferazei, blocând etapa de reglare în sinteza de novo. Acest nucleotid acţionează şi ca inhibitor al conversiei IMP la GMP în calea IMP dehidrogenazei şi a IMP la AMP în calea adenilosuccinat sintetazei. Î Deoarece GMP este substrat pentru xantinoxidaza se formează prin oxidare acid tiouric şi alopurinolul poate fi admnistrat pentru a inhiba această degradare şi a potenţa activitatea antitumorală. 2. 5-fluorouracilul (F-ura) este un analog pirimidinic care nu are acţiune citotoxică

Metabolitul activ al F-ura este fluorodeoxiuridilatul (F-dUMP) şi FUTP. F-dUMP este inhibitor al timidin sintetazei iar FUTP împiedică transformarea pre ARNmesager la ARNm funcţional (deci maturarea ARNm). 3. Citozin-arabinozidul (Ara-C) este utilizat în tratamentul mai multor forme de cancer. Pentru a-şi exercita efectele citotoxice trrebuie să fie transformat în citozin-arabinozid-5’-trifosfat. Acest compus intră în competiţie cu dCTP în reacţia ADN polimerazei.

Clinic, eficacitatea ara-C ca medicament antileucemic se corelează cu concentraţia ara-CTP în celulele tmorale care determină nivelul de ara-CMP incorporat în ADN. Formarea ara-CMP via deoxicitidin kinaza este etapa limitantă în activarea ara-CTP. 4. Azatioprina este folosită pentru imunosupresie la pacienţii cu transplant de organe. 5. Alopurinolul este folosit pentru tratamentul gutei şi hiperuricemiei. 6. Aciclovirul este util în tratamentul infecţiei cu virusul herpetic şi tratamentul zonei Zoster. ANTIFOLAŢII sunt compuşi care interferă cu formarea FH4 din FH2 sau din acid folic prin inhibiţia folat reductazei. Metotrexatul estre un exemplu de antifolat utilizat ca agent antitumoral şi acţionează prin inhibiţia competitivă a folat reductazei.

ANTAGONIŞTII GLUTAMINEI inhibă utilizarea acesteia ca donor de azot. Glutamina are rol de a asigura atomii de azot din poziţia 3 şi 9 în sinteza de novo a purinelor dar şi în conversia IMP la GMP, UTP la CTP şi a nicotinat adenin dinucleotidului la NAD. Compuşii care inhibă aceste reacţii sunt antagonişti ai glutaminei:

1.

azaserina (O-diazoacetil-L-serina) izolată din culturi de Streptomices este un inhibitor al utilizarii glutaminei.

Un dezavantaj al acestui tip de compuşi este toxicitatea. ALŢI AGENŢI CARE INHIBĂ CREŞTEREA CELULARĂ 1. Hidroxiureea inhibă specific sinteza de ADN şi în mai mică măsură sinteza de ARN şi de proteine. Mecanismul implică inhibiţia ribonucleotid reductazei, deci blocarea reducerii celor 4 nucleozid-difosfaţi la derivaţi 2’deoxi. Toxicitateaei rezultă din depleţia 2’deoxi NTP necesari pentru replicarea ADN. Utilizarea ei în clinică este limitată de clearence-ul prea rapid şi necesitatea unor concentraţii mari terapeutice. 2. Tiazofurin este convertit la tiazofurin adenin dinucleotid (TAD) care inhibă IMP-dehidrogenaza cu diminuarea concentraţiei intracelulare de GMP.

ANALOGI PURINICI ŞI PIRIMIDINICI CA AGENŢI ANTIVIRALI Mai cunoscuţi sunt compuşii care acţionează împotriva infecţiei cu HIV şi cu virus herpes simplex. 1. Aciclovirul (acicloguanozina) 2. AZT (3’-azido-2’-deoxiimidina)

Aciclovirul este activat la monofosfat de către o kinază specifică doar virusului herpes şi oprit de către enzimele celulare la forma di şi trifosfat. Rezultă un fals substrat pentru ADN-polimeraza fiind incorporat în ADN viral. AZT este fosforilat la AZT trifosfat de către o kinază celulară. Este inhibată astfel HIV-ADN polimeraza pentru care s-ar părea că există o mai mare specificitate.