Materi.docx

Tujuan pengujian kualitas oosit untuk mengetahui kemampuan fertilisasi dan perkembangan ke stadium blastosist, menimbulkan kebuntingan, dan akhirnya menghasilkan anak yang hidup. Maka dari itu, digunakan parameter yang pasti, seperti pembelahan dan produksi blastosist sebagai pengukuran kualitas oosit. http://yudhiestar.blogspot.com/2010/05/kualitas-oosit-dan-embrio.html tingkat fertilisasi oosit tidak hanya ditentukan oleh genetik namun ada faktor lain yang mempengaruhi fertilisasi. Kegagalan fertilisasi dapat disebabkan oleh beberapa hal, antara lain: (1) proses maturasi inti maupun sitoplasma yang kurang sempurna karena kualitas oosit yang rendah (2) kegagalan spermatozoa melakukan kapasitasi dan reaksi akrosom sehingga spermatozoa tidak mampu membuahi oosit, (3) kegagalan spermatozoa mengalami kondensasi dalam sitoplasma oosit sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus jantan (Crozet et al. 1995 dalam Hermilinda, 2014). Hermilinda, Bambang. 2014. Tingkat Fertilisasi Oosit Sapi Silangan Simmental Peranakan Ongole Secara In Vitro. Vol. 1, No. 6, 28 – 31. Jurnal Imlu Ternak. Kupang. Penentuan kualitas oosit dapat dilakukan dengan beberapa metode untuk memilih oosit yang akan digunakan pada proses FIV. Metode seleksi oosit yang banyak digunakan adalah pemilihan oosit berdasarkan morfologi sel kumulus yang berada disekitar oosit (Lonergan et al. 1994; Alvarez et al. 2009). Teknik grading merupakan cara yang lebih mudah dan objektif untuk mengevaluasi sel-sel kumulus oosit yang komplek. Keberadaan sel kumulus mendukung pematangan oosit sampai pada tahap metaphase II dan pematangan sitoplasma yang diperlukan untuk kemampuan perkembangan setelah fertilisasi (Abeydeera 2002). Oosit dengan kumulus yang multilayer digunakan dalam produksi embrio secara in vitro (Qian et al. 2005). Menurut Gordon (2003), kriteria pemilihan oosit yang berkualitas baik dapat dilihat dari bagian ooplasma yang homogen, sel kumulus yang kompak mengelilingi zona pelusida. Oosit yang dikoleksi dikategorikan menjadi 4 grade berdasarkan kualitasnya: grade A adalah oosit yang memiliki kumulus yang seragam dan kompak dengan dikelilingi oleh lima lapisan atau lebih sel kumulus. Oosit dengan grade B adalah oosit yang memiliki sitoplasma yang gelap dengan komplemen dari korona radiata yang lengkap tetapi dikelilingi tidak lebih dari lima lapis sel kumulus. Oosit dengan grade C adalah oosit yang ditandai dengan oosit yang kurang seragam dan warna sitoplasma lebih transparan dan tidak merata serta terlihat tidak kompak. Oosit dengan kategori D mempunyai sitoplasma yang transparan bahkan terdapat fragmentasi pada sitoplasma. Sel-sel kumulus yang mengelilingi oosit terlihat sangat jarang dan bahkan beberapa oosit tidak memiliki sel kumulus.

perkembangan folikel ovarium terjadi selama siklus estrus dari mana terjadi ovulasi (progesteron relatif lebih besar), ada tingkat kehamilan yang lebih besar daripada pada sapi yang memiliki ovulasi dari

folikel dominan yang berkembang selama gelombang pertama perkembangan folikel ovarium (progesteron yang relatif lebih rendah) P4 yang lebih rendah dapat menyebabkan perbedaan dalam komposisi cairan folikuler (Cerri et al., 2011), ekspansi kumulus dan kompetensi oosit (Fair and Lonergan, 2012). Konsentrasi P4 yang relatif lebih rendah menyebabkan gangguan pematangan nuklir oosit Muhammad Saad, et al. 2019. Effect of plasma progesterone on oocyte recovery, oocyte quality, and early in-vitro developmental competence of embryos in Bos indicus dairy cows. Volume 202. Animal Reproduction Science. Pages 80-86. Elsevier B.V. Kualitas oosit adalah salah satu faktor penting dalam kesuburan wanita, pematangan in vitro (IVM), dan perkembangan embrionik selanjutnya [1]. Untuk ternak khususnya, IVM digunakan untuk menghasilkan banyak tanaman dewasa oosit yang mampu berkembang menjadi embrio [2]. Cumulus-oosit complexes (COCs), terdiri dari oocyte dan sekitarnya sel kumulus, adalah unit lengkap, fungsional, dinamis yang memainkan a peran penting dalam metabolisme oosit selama pematangan [3]. Antara oosit dan sel kumulus, pertukaran dua arah nutrisi dan molekul sangat penting untuk pematangan oosit, kumulus ekspansi sel, dan perkembangan embrionik selanjutnya [4]. Itu * Penulis yang sesuai. dua faktor parakrin turunan oosit primer, protein morfogenetik tulang 15 (BMP15) dan faktor diferensiasi pertumbuhan 9 (GDF9), berpartisipasi dalam penangkapan meiosis oosit dan mendukung dan mengatur metabolisme sel kumulus, pematangan, pertumbuhan, dan ekspansi [5]. Hormon steroid diproduksi oleh sel kumulus, seperti progesteron (P4) dan estradiol (E2), juga terlibat dalam pengaturan penting fase siklus reproduksi, termasuk pertumbuhan oosit dan pematangan [6]. Metabolisme energi sangat penting untuk pematangan oosit dan perkembangan embrionik selanjutnya, karena proses dinamis ini mengkonsumsi sejumlah besar energi yang berasal dari berbagai substrat, termasuk karbohidrat, asam amino, dan lipid [7]. Metabolisme karbohidrat (termasuk glukosa, piruvat, dan laktat) oleh oosit ditandai dengan baik [8]. Selain karbohidrat, asam lemak, yang beberapa kali lebih kaya energi daripada karbohidrat, juga merupakan sumber energi penting untuk pematangan dan mengembangkan oosit Hui-Yan Xu, 2018. Treatment with acetyl-L-carnitine during in vitro maturation of buffalo oocytes improves oocyte quality and subsequent embryonic development. Vol 118 Pg 80-89. Theriogenology Elsevier Inc. Selama oogenesis, oosit diatur oleh berbagai gen itu berkumpul menjadi program molekuler untuk menentukan morfologi dan kualitas oosit. Ekspresi gen abnormal biasanya menghasilkan disfungsi atau dislokasi komponen oosit, seperti mitokondria, gelendong, atau butiran kortikal (CG), yang akibatnya mengurangi potensi oosit dan mempengaruhi kualitas embrio yang dihasilkan selanjutnya

Yue Xie, et al. 2018. Oocyte-specific deletion of Gsα induces oxidative stress and deteriorates oocyte quality in mice. Experimental Cell Research 370 (2018) 579–590. Elsevier Inc.

Mrna ibu direkrut, diterjemahkan, dan terdegradasi secara spesifik waktu di mana gen zygotik diaktifkan (Li et al., 2013). Inaktivasi transkrip ibu terjadi melalui proses deadenylation (Huarte et al., 1992), terkait dengan protein pengikat RNA (Gu et al., 1998; Davies et al., 2000), dan eliminasi melalui aksi kelas RNA pembungkaman kecil (ssRNA). Pembungkaman gen pasca-transkripsi (PTGS) oleh RNA untai ganda (dsRNA) atau interferensi RNA (RNAi) telah menjadi teknik mapan untuk mempelajari gen fungsi (Tabel 1) (Paradis et al., 2005). Misalnya, peran fungsional untuk Cyclin B1 dan C-mos dalam kontrol sapi pematangan oosit telah diidentifikasi (Paradis et al., 2005; Nganvongpanit et al., 2006), sedangkan, JY-1, Follistatin, KPNA7, dan MSX1 ditemukan memainkan peran penting di awal perkembangan embrio pada sapi (Bettegowda et al., 2007; Lee et al., 2009; Tejomurtula et al., 2009; Tesfaye et al., 2010) M. Moussa. 2015. Maternal control of oocyte quality in cattle “a review”. Animal Reproduction Science 155 (2015) 11–27. Elsevier B.V Dalam sel somatik, mitokondria memainkan peran penting dalam akumulasi kalsium, apoptosis, dan produksi energi. Pada hewan domestik dan manusia, satu oosit mengandung sekitar 100.000 mitokondria. Mitokondria memasok ATP ke oosit melalui oksidasi dan asam lemak fosforilasi oksidatif untuk pertumbuhan oosit, pematangan, pemupukan, dan perkembangan embrio awal (Reynier et al., 2001; Dumollard et al., 2004; Santos et al., 2006; Dunning et al., 2010; Iwata et al., 2011). Itu angka mitokondria diyakini sangat penting sejauh oosit yang mengandung jumlah rendah dan kualitas rendah mitokondria memiliki kualitas oosit rendah (May-Panloup et al., 2005; Zhang et al., 2006). Oleh karena itu, penting untuk mengontrol kualitas mitokondria dan kuantitas dalam oosit untuk digunakan dalam teknologi reproduksi berbantuan pada manusia dan hewan. Kami sebelumnya melaporkan bahwa mitokondria uncoupler (CCCP) yang diinduksi depolarisasi mitokondria dalam oosit babi mengarah ke Sirtuin. 1 (SIRT1: histone deacetylase) - dan protein kinase yang diaktifkan AMP (AMPK) - degradasi mitokondria dan biogenesis, dan mempertahankan kualitas mitokondria dan kemampuan oosit untuk berkembang menjadi blastokista (Itami et al., 2015). Selanjutnya, kami juga menunjukkan bahwa resveratrol, penggerak potensial dan spesifik SIRT1, mendorong degradasi dan biogenesis mitokondria, dan meningkatkan kemampuan perkembangan oosit (Sato et al., 2014). Penemuan-penemuan ini

menunjukkan bahwa aktivasi SIRT1 non-invasif efektif dalam meningkatkan kualitas mitokondria, serta kemampuan perkembangan oosit. Karpe dan Tikoo (2014) melaporkan bahwa stres panas jangka pendek (SHS) pada tikus membalikkan ekspresi rendah SIRT1 yang diinduksi diet tinggi lemak jaringan aorta. Mereka selanjutnya menyarankan bahwa ekspresi SIRT1 yang tinggi di jaringan berasal dari aktivasi sengatan panas akibat stres panas protein 72 (HSP72). Henstridge et al. (2014) menunjukkan tikus itu bersama Aktivasi tampilan berlebih HSP72 dari SIRT1 dan AMPK, dan peningkatan jumlah mitokondria pada otot rangka. Selanjutnya, Ekspresi berlebih HSP72 meningkatkan aktivitas mitokondria dan mengembalikan resistensi insulin yang diinduksi obesitas pada otot rangka (Chung et al., 2008). Selanjutnya, Liu dan Brooks (2012) menunjukkan bahwa SHS menginduksi biogenesis mitokondria pada otot rangka melalui aktivasi dari jalur HSP72 / SIRT1, bersama dengan peningkatan selanjutnya dalam ekspresi PGC1α dan TFAM, yang mengatur biogenesis mitokondria. Namun, sejauh pengetahuan kami, tidak ada penelitian yang menyelidiki apakah SHS efektif untuk aktivasi SIRT1, juga sebagai peningkatan kemampuan perkembangan oosit. Dalam penelitian ini, kami menginkubasi oosit babi pada 41,5 ° C, yang adalah 3 ° C lebih tinggi dari kondisi kultur normal, untuk 1 jam pertama di titik waktu awal pematangan in vitro dan memeriksa Nobuhiko Itami. 2018. Short-term heat stress induces mitochondrial degradation and biogenesis and enhances mitochondrial quality in porcine oocytes. Journal of Thermal Biology 74 (2018) 256–263. Elsevier Ltd.

Suplementasi quercetin meningkatkan perkembangan folikel, oosit kualitas, dan mengurangi apoptosis ovarium pada kelinci selama musim panas Introduction Stres panas (HS) membahayakan efisiensi reproduksi oleh mengubah spermatogenesis, perkembangan folikel dan oosit atau pematangan pada hewan. Selama bulan-bulan musim panas, beberapa variasi terjadi pada tingkat hipotalamusepituitaryegonadal Sumbu (HPG) bertanggung jawab atas kesuburan rendah [1,2]. Telah menggambarkan bahwa laju pertumbuhan folikel yang tidak tepat [3], berubah dalam konsentrasi estradiol, mengurangi ekspresi reseptor LH dan aktivitas aromatase yang rendah menunda proses ovulasi di bawah HS [4]. Di Selain itu, paparan hewan betina ke HS selama praovulasi fase mengurangi kualitas oosit dengan keterlibatan peningkatan produksi spesies reaktif oksidatif (ROS) [5]. Meskipun, HS tidak memiliki pengaruh pada kerusakan vesikel germinal (GVBD) selama oogenesis, menghambat dalam memulai kembali metafase I (MI), metafase II (MII) dan pengembangan blastokista selanjutnya [6,7]. Variasi dalam lemak rasio asam, protein peredam panas, dan tingkat antioksidan menurunkan tingkat pematangan oosit [8] di bawah HS. Tingkat apoptosis lebih tinggi pada sel granulosa sebagai respons terhadap HS, adalah faktor lain yang bertanggung jawab pengurangan kompetensi oosit [9]. Tingkat pematangan oosit dan perkembangan embrio adalah

terkena dampak negatif karena stres oksidatif dan panas. Antioksidan memiliki kapasitas untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup oosit dan mengurangi kerusakan yang disebabkan oleh HS. Dalam hal ini flavonoid dapat menghambat dengan reaksi kimia yang merusak secara biologis di organ reproduksi dan mengais produksi ROS [10]. Di antara berbagai kelas flavonoid, kuersetin adalah flavonoid paling umum, secara alami ada dalam sayuran, buah-buahan, teh, dan anggur merah. Ia bekerja sebagai antioksidan kuat dan memiliki ROS kemampuan memulung yang mengandalkan konfigurasi molekulnya. Itu quercetin (3,5,7,30,40-pentahydroxyflavone) bereaksi dengan tidak berpasangan radikal dengan menyumbangkan proton dan menjadi radikal bebas itu sendiri. Namun, radikal tidak berpasangan yang dihasilkan dihilangkan dengan resonansi yang membuat quercetin radikal lemah dan kurang reaktif dengannya energi minimum [11]. Biasanya, tiga kelompok struktural (cincin B odihydroxyl kelompok, kelompok 4-okso dalam konjugasi dengan 2,3alkena, dan gugus 3 dan 5-hidroksil) menstabilkan kuersetin molekul dan membantu bertindak sebagai antioksidan [12]. Quercetin dianggap sebagai pengatur potensial reproduksi oleh memediasi sistem pensinyalan mTOR yang diperlukan untuk sel pertumbuhan, proliferasi, dan kelangsungan hidup [13]. Secara umum, dinamika ovarium menghasilkan kelebihan produksi ROS selama tahap akhir perkembangan folikel dan pada saat itu ovulasi. Kelebihan produksi ROS dihentikan oleh aktif sistem antioksidan enzimatik dalam sel. Sedikit peningkatan ROS diperlukan untuk dimulainya kembali meiotik dari penangkapan diplotene di oosit mamalia; Namun, berlebihan ROS di ovarium atau Ketidakseimbangan dalam keadaan redoks menyebabkan keadaan stres oksidatif. Itu peningkatan stres oksidatif menyebabkan perubahan sitoplasma yang tidak dapat diubah dan daerah nuklir oosit terbungkus oleh folikel itu lebih lanjut mempengaruhi kapasitas pembuahan oosit [14]. Quercetin melindungi sel kumulus dengan memuncaknya peroksidasi lipid, mempertahankan enzim antioksidan dan mengurangi apoptosis melalui memodifikasi sinyal XIAP, BAX, BCL2 dan caspase-3 ekspresi [15]. Sejauh pengetahuan kami, tidak ada laporan tunggal tentang efek pemberian makanan tambahan quercetin pada reproduksi efisiensi kelinci betina di bawah HS telah dipublikasikan. ini berhipotesis bahwa diet yang diperkaya quercetin makan bisa a cara untuk meningkatkan kinerja reproduksi kelinci betina oleh mengurangi stres oksidatif, terutama selama musim panas bulan. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi dampak suplementasi kuersetin pakan pada pengembangan folikel, apoptosis, produksi oosit atau pematangan selama panas periode musim panas pada kelinci. 2. Materials and methods Penelitian ini dilakukan di Unit Hewan Laboratorium, Departemen Reproduksi dan Inseminasi Buatan, Fakultas Sastra Indonesia Kedokteran Hewan, Universitas Adnan Menderes saat panas bulan-bulan musim panas (Juli hingga September 2015). Percobaan itu dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh perawatan hewan

komite dan sesuai dengan pedoman kelembagaan (ADÜ-HADYEK No. 64583101/2014/153). 2.1. Memberi makan dan pengelolaan kelinci betina Total tiga puluh empat kelinci betina berumur sekitar 8e9 bulan dan berat badan (3,2 ± 0,3 kg) dipilih dari garis murni Kelinci Putih Selandia Baru yang dikembangkan di laboratorium fakultas satuan hewan. Semua wanita yang dipilih adalah nulipara dan memiliki tidak pernah dibiakkan. Kelinci ditempatkan di kandang individual (70 50 35 cm3) di AC dan berventilasi baik ruangan untuk jangka waktu satu tahun. Untuk menyesuaikan diri dengan stres panas, itu hewan tidak memiliki fasilitas kondisi udara, setidaknya satu minggu sebelum awal studi, selama bulan musim panas yang sangat panas (Juli). Itu kelinci betina yang dipanaskan dengan panas kemudian dibagi menjadi dua kelompok (n ¼ 17 / setiap kelompok) dan diberi makan dengan diet basal (kelompok HS) atau ditambah quercetin (Quercetin hidrat; 30 mg / kg tubuh berat badan, 337951, Sigma-Aldrich, St. Louis, AS) (kelompok QU-HS) selama 18e20 hari berturut-turut. 2.2. Penilaian stres panas Suhu lingkungan dan kelembaban relatif dicatat dua kali sehari melalui thermohygrometer digital. Suhu yang lembab Indeks (THI) dihitung melalui persamaan yang diadaptasi oleh Marai et al. THI ¼ db_C e [(0.31e0.31 _ RH) _ (db _ _C - 14.4)] The heat stress level was categorized based on the THI values which are as follows: No heat stress _ 27.8 THI Moderate heat stress ¼ 27.9 to 28.9 THI Severe heat stress ¼ 28.9 to 30.0 THI Extreme heat stress _ 30.0 THI. 2.3. Koleksi oosit Oosit dikumpulkan melalui laparotomi. Hewan dipelihara off-feed untuk jangka waktu 18 jam sebelum prosedur bedah. Binatang diberikan obat pre-anestesi intravena (Xylazine) dan diikuti oleh anestesi (Ketamine). Sayatan garis tengah dibuat untuk mendekati rongga perut. Indung telur itu terletak, dipegang dengan forsep ibu jari dan dicuci dengan PBS steril. Semua folikel dengan rentang ukuran antara 1 dan 3 mm dipilih untuk aspirasi oosit dengan menggunakan jarum suntik insulin. Setelah itu, sayatan dijahit dan hewan dirawat di bawah perawatan intensif selama tiga hari. 2.4. Pemeringkatan dan pengukuran kumulus oofor kompleks (COC) Setelah pengumpulan, oosit dicuci tiga kali dalam TCM-199 medium (Sedang-199 M4530 Sigma-Aldrich, St. Louis, AS). Itu COC kompak yang dikumpulkan dikelompokkan ke dalam tiga kategori dasar sehubungan dengan lapisan kompleks oosit kumulus sekitarnya: The oosit terbesar dikelilingi oleh lapisan jumlah maksimum sel kumulus dinilai sebagai A. Oosit ditutup dengan 3e4 lapisan sel kumulus dinilai sebagai B, sedangkan oosit tanpa lapisan kumulus (sel gundul) dinilai sebagai C. Dimensi COCs

termasuk zona ke zona jarak (mm), seluruh COC di bidang horisontal dan tegak lurus (mm) diukur di bawah stereomicroscope (Olympus SZ51, Jepang) pada perbesaran 40. 2.5. Pematangan oosit in-vitro Oosit grade A dan B dipilih dan sekitar 8e10 oosit disimpan dalam media maturasi selama 24 jam di bawah steril penutup minyak mineral. Media pematangan (TCM199) ditambahkan dengan 50 mM Hepes (HEPES sodium salt H3784 SigmaAldrich, St. Louis, AS), 0,3 mM natrium piruvat (Sodium piruvat P5280 Sigma-Aldrich, St. Louis, AS), 10% serum janin janin (FBS F0804 Sigma-Aldrich, St. Louis, AS), stimulasi folikel 10 mg / mL hormon (FSH, Folltropin 700 IU Bionichi Kesehatan hewan Eropa ltd Dublin Irlandia), 5 IU / mL hormon human chorionic gonadotrophin (hCG Pregnyl 1500 IU NV Organon Oss-Holland), 100 IU / mL penisilin G potasium, 50 mg / mL streptomisin sulfat. 2.6. Penilaian maturasi oosit: ekspansi kumulus dan pewarnaan nuklir Pematangan oosit dinilai dengan ekspansi sel kumulus tingkat COC dan pewarnaan nuklir. Ekspansi sel kumulus dalam COC, dikenakan media pematangan, diamati setelah 24 jam inkubasi di bawah mikroskop stereo. Tingkat ekspansi kumulus (%) dikategorikan sebagai non-diperluas (kepatuhan ketat dari sel kumulus ke zona pelusida), sebagian diperluas (perluasan cumulus sekitar ~ 200 mm diameter dari zona pellucida) atau sepenuhnya diperluas (ekspansi massa sel kumulus sekitar lebih besar dari ~ 300 mm dari diameter zona pellucida). Untuk status nuklir dalam oosit matang, fluoresensi DAPI metode dilakukan [17]. Secara singkat, sel kumulus adalah dihilangkan dengan pemipaan yang lembut dan oosit difiksasi dalam paraformaldehyde 4% solusi selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah itu, oosit diinkubasi dalam 0,5% Triton X-100 (Triton X-100, X100, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) dalam solusi DPBS untuk permeabilitas selama 30 menit. Setelah permeabilisasi, oosit diinkubasi dalam buffer yang mengandung 2% BSA (Bovine Serum Albumin, A9418, Sigma-Aldrich, St. Louis, AS) untuk 1 jam. Akhirnya, oosit itu diwarnai dengan DAPI (DAPI 406-diamidino-2-phenyindole, dilactate, D9542, Sigma-Aldrich, St. Louis, AS) untuk mengamati nuklir mereka isi. Oosit yang diwarnai dipasang pada slide kaca dan diperiksa menggunakan mikroskop epifluoresensi untuk status nuklir. Itu status nuklir diklasifikasikan ke dalam berbagai kategori: 1) germinal vesikel (GV), adanya bahan kromatin yang terkondensasi dalam oosit; 2) germinal vesicle break-down (GVBD), oosit dengan tersebar bahan kromatin; 3) metafase-I (MI), adanya clumpy kromatin dengan pembentukan jaringan bivalen individual yang tidak beraturan atau pelat metafase tanpa badan kutub di oosit dan 4) metaphase-II (MII), oosit dengan satu atau dua benda kutub yang berbeda bintik-bintik kromatin. 2.7. Ovarium pengambilan dan penimbangan Pada paruh kedua percobaan, lima kelinci betina (a subset dari masing-masing kelompok) dibantai untuk pengambilan ovarium. Setelah

pengumpulan, ovarium ditimbang dan diproses untuk histopatologi dan imunohistokimia. 2.8. Histopatologi ovarium Indung telur yang diambil tetap dalam paraformaldehyde netral berbahan 4% larutan. Semua sampel tetap mengalami dehidrasi dengan etil alkohol (50e100%) dan tertanam dalam parafin. Tertanam jaringan dibelah (5 mm) dan kemudian diwarnai dengan hematoxylin / eosin. Dua bagian histologis dari setiap ovarium diamati di bawah mikroskop cahaya untuk menyortir populasi folikel (Olympus BX 51, Jepang). Folikel yang diamati dikategorikan ke dalam primordial, folikel primer, sekunder dan antral berdasarkan jumlah lapisan sel granulosa yang mengelilingi oosit. Jumlah folikel untuk setiap kategori dihitung secara terpisah. 2.9. Imunohistokimia ovarium Untuk menentukan apoptosis dalam sel granulosa, bagian ovarium adalah diwarnai dengan menggunakan metode TUNEL. Aktivitas apoptosis dalam sel adalah diamati melalui kit TUNEL yang tersedia secara komersial (Millipore “APOPTAG® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit”) oleh mengikuti instruksi dari pabriknya. Secara singkat, bagian parafin dan dideparfininasi dalam alkohol dengan pencucian seri. Setelah itu, sampel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dalam proteinase K (20 mg / mL) selama 15 menit pada suhu kamar dan kemudian dicuci dua kali dalam air suling selama 2 menit. Kemudian, slide bagian disimpan dalam larutan H2O2 3% selama 5 menit dan kemudian dicuci dua kali dengan PBS selama 5 menit. Untuk reaksi TUNEL, bagian-bagiannya adalah diinkubasi dalam ruang lembab pada 37 C selama 1 jam menggunakan 50 mL tetes Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dan fluorescein-dUTP (29-ke 59-deoksiuridin trifosfat). Reaksi diamati di bawah mikroskop fluoresen. Bagian yang disiapkan bergetar dengan 1/34% larutan kit air suling (Stop / Wash) selama 15 detik dan kemudian diinkubasi lebih lanjut pada suhu kamar selama 10 menit dalam waktu yang sama larutan dan dicuci dengan PBS (3 1 menit). Setelah itu, slide ditutupi dengan konjugat anti-digoksigenin peroksidase yang disiapkan dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit dan kemudian dicuci lagi dengan PBS (4 2 mnt). Akhirnya, sampel disimpan dalam 0,045% (v / v) mengandung 0,08% H2O2 (b / v) 3, 3-diaminobenzidine larutan tetrahydrochloride (DAB) selama 3e6 menit untuk menginduksi reaksi kromogenik. Pada akhirnya, reaksi diamati di bawah mikroskop cahaya dan sampel dicuci dengan air suling (3 1 mnt). Bagian diwarnai dengan hematoxylin Mayer dan mengalami dehidrasi dalam pengenceran alkohol serial. Slide yang disiapkan adalah ditutupi dengan coverlip. Bagian kontrol negatif juga disiapkan dengan cara yang sama, namun, mereka tidak dirawat reaksi TUNEL terminal transferase. Slide diamati pada a mode acak dengan memilih lima bidang berbeda (10 tubulus / bidang) untuk menghitung sel TUNEL-positif menggunakan mikroskop cerah di bawah 20 perbesaran. TUNEL pewarnaan positif menunjukkan tingkat kerusakan DNA dan tipe sel yang terkena yang menerangi berwarna coklat. Kehadiran sel granulosa apoptosis dalam folikel dihitung secara terpisah untuk setiap jenis folikel dan disajikan

sebagai sel TUNEL positif rata-rata di setiap kategori folikel. 2.10. Serum malondialdehyde (MDA) Untuk menentukan status peroksidasi lipid dalam stres panas tingkat serum MDA kelinci diperiksa. Secara singkat sampel darah dikumpulkan pada akhir uji coba eksperimental. Serumnya adalah dipisahkan melalui sentrifugasi (3000 rpm, 10 menit). Yang dikumpulkan sampel serum disimpan pada 20 C sampai analisis. Konsentrasi MDA adalah diukur dengan zat reaktif asam tiobarbiturat (TBARS) dalam serum yang didasarkan pada reaksi antara MDA dan asam tiobarbiturat. Volume 1,75 mL larutan (0,67% Asam tiobarbiturat dan asam 20% 2-tiobarbiturat) ditambahkan 0,25 mL sampel serum. Sampel direbus pada suhu 95 C untuk 30 mnt dan sampel terpapar ke lemari pendingin untuk menurunkan suhu. Dalam sampel yang didinginkan, volume 2 mL n-butanol adalah ditambahkan, vortex dengan benar dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit pada 4 C. Setelah sentrifugasi, supernatan diperoleh dan absorbansi diukur melalui spektrofotometer (Shimadzu UV-1601, Kyoto, Jepang) pada 532 nm. Nilai yang diperoleh adalah dihitung dengan menggunakan rumus berikut. Konsentrasi MDA adalah dinyatakan sebagai mmol / mL. XD535 ¼ 1:56 _ 106 M_1 cm_1 Discussion Suhu lingkungan yang lebih tinggi mempengaruhi acara reproduksi seperti folliculogenesis, fertilisasi, perkembangan embrionik, uterus lingkungan, dan kesuburan pada hewan sasaran. Di latar belakang ini, the laporan yang tersedia mengkonfirmasi bahwa oosit dikumpulkan dari panas betina terpapar, mudah mengalami perubahan seperti apoptosis yang mengurangi pematangan in vitro dan kapasitas pemupukan. Dalam penelitian ini, pengaruh HS dan dampak perbaikan quercetin pada pengembangan folikel, kualitas oosit dan kompetensinya untuk menjadi dewasa telah dievaluasi. Ini adalah studi pertama dari jenisnya yang menggambarkan dampak positif quercetin pada perkembangan folikel, produksi oosit, dan aktivitas apoptosis di bawah HS kondisi. Musim panas HS atribut untuk tingkat kehamilan yang rendah karena penurunan perekrutan dan pengembangan folikel [18,19]. Pada saat ini studi, lebih sedikit jumlah oosit yang diambil dan perkembangan folikel menunjukkan efek yang merugikan dari HS pada reproduksi pada wanita kelinci. Folikel mengandung pertahanan antioksidan yang mapan sistem yang melindungi integritas fungsional dan struktural membungkus sel oosit dan granulosa di sekitarnya. ROS memainkan peran vital peran untuk terjadinya ovulasi; Namun, semakin tinggi produksi ROS dalam folikel dalam kondisi stres menyebabkan penuaan oosit [20]. Karenanya, a keseimbangan antara produksi ROS dan sistem antioksidan dalam folikel adalah prasyarat untuk kelangsungan hidup oosit dan sekitarnya sel granulosa selama kondisi normal dan stres [21]. Dalam penelitian ini, wanita HS diberi makan dengan kuersetin diet yang merupakan senyawa antioksidan kuat. Kehadiran lebih tinggi

jumlah folikel dan oosit yang diambil dari kelompok yang diberi quercetin jelas bahwa ROS tambahan telah dihapuskan oleh ketentuan quercetin pada kelinci HS. Temuan saat ini sejalan dengan Pengamatan sebelumnya, di mana vitamin C diberikan kepada wanita HS kelinci [19]. Demikian pula, Beazley dan Nurminskaya [22] melaporkan hal itu asupan quercetin oral meningkatkan perkembangan folikel dan fekunditas pada tikus betina muda. Atresia folikuler kemungkinan disebabkan oleh produksi ROS tinggi, sementara itu, kehadiran jumlah yang lebih tinggi folikel pada ovarium kelompok QU-HS mungkin terkait dengan suplementasi quercetin [23]. Selain itu, semakin tinggi konsentrasi FSH merangsang sintesis glutathione di dalam folikel yang di dalamnya gilirannya mengurangi tingkat ROS dan selanjutnya menurunkan insiden apoptosis sel granulosa [24]. Ini berspekulasi bahwa diet quercetin mungkin terlibat dalam stimulasi FSH yang secara tidak langsung meningkatkan sintesis GSH yang pada gilirannya menghilangkan ROS yang berlebihan dari pengembangan folikel. Tingkat pematangan oosit tergantung pada oosit awal ukuran. Oosit dengan ukuran kecil tidak dapat matang; namun demikian oocyte dengan dimeter lebih dari 80% dari ukuran akhir, memiliki kapasitas untuk melanjutkan proses meiosis. Pada kelinci, rata-rata oosit diameter (tanpa zona pellucida) sekitar 147 mm [25]. Dalam penelitian ini, diameter yang lebih rendah (143 mm) oosit dikumpulkan di kelompok yang diberi quercetin dan ukuran oosit yang dikumpulkan ini mampu untuk melanjutkan aktivitas meiotik. Demikian pula, telah dilaporkan bovine oocyte dengan diameter 100 mm [26] dan 115 mm [27] melanjutkan kompetensi meiotik penuh (tahap MII) dan perkembangan kompetensi untuk tahap blastokista. Perbedaan tidak signifikan dalam hasil tingkat IVM menunjukkan bahwa oosit dikumpulkan baik dari quercetin kelompok yang diberi suplemen atau tidak sama-sama mampu menjalani pematangan, terlepas dari oosit ukuran. Dalam penelitian ini, hasil yang sama diperoleh setelah pematangan dari oosit yang dikumpulkan dari quercetin yang ditambah atau kelinci betina HS tanpa tambahan. Sebaliknya, peningkatan oosit tingkat maturasi dilaporkan dalam laporan sebelumnya [19]. Tambahan studi direkomendasikan untuk mengungkap temuan terperinci tentang efek quercetin pada oosit, pematangan, pemupukan dan selanjutnya perkembangan embrio dalam kondisi HS. Sejumlah penelitian tersedia mengenai efek kuersetin pada oosit selama in vitro percobaan [28,29]. Namun, ada variabilitas besar di antara yang dilaporkan hasil yang berkaitan dengan tingkat dosis quercetin. Sebagai tambahan, perbedaan yang tidak signifikan ini dapat dikaitkan dengan impedansi eCG / FSH, yang membantu untuk mempertahankan tingkat GSH dalam mengembangkan folikel [30] dan aktivitas steroidogenik folikel sel [31]. Dalam penelitian ini, eCG atau FSH belum digunakan stimulasi ovarium; Oleh karena itu, sejumlah kecil GSH dalam oosit tanpa FSH tidak dapat mempertahankan antioksidan internal sistem terhadap produksi ROS yang lebih tinggi. Kondisi ini mungkin bertanggung jawab untuk menginduksi perubahan apoptosis atau ireversibel pada sel granulosa, oosit dan tingkat maturasi oosit selanjutnya.

Perlu dicatat bahwa oosit diproduksi di bawah tekanan kondisi, kurang memiliki kemampuan untuk matang karena mengandung tinggi tingkat ROS. Suplemen antioksidan dalam pematangan media atau menyuntikkan antioksidan ke wanita adalah strategi untuk diatasi berbagai HS menyebabkan perubahan ireversibel pada oosit [32] misalnya penyimpangan kromosom meiotik [33], perubahan pada tahap GV oosit [34], dan penurunan ekspresi gen ibu [35]. Di Selain itu, konfigurasi nuklir dan sitoplasma oosit organel memiliki sensitivitas tinggi terhadap perubahan yang diinduksi HS [36]. Sebelumnya, peran apoptosis pada penghambatan meiosis pada oosit HS dan pengaruh pada mikrotubulus aktin dan mikrofilamen di sitoskeleton oosit telah didokumentasikan [9]. Ini penting untuk menjaga konfigurasi kedua kompartemen agar berhasil pematangan oosit. Oleh karena itu, penyelidikan yang luas diperlukan untuk mengeksplorasi perubahan yang diinduksi HS dan efek perbaikan flavonoid yang berbeda pada kompartemen nuklir dan sitoplasma dari oosit. Sel-sel kumulus mempengaruhi tingkat pematangan oosit [37] dan membantu memerangi stres oksidatif [38] dengan mensintesis protein dan memperketat persimpangan GAP yang mempertahankan transformasi agen pengatur untuk mekanisme tahan-termal. Perubahan dalam mekanisme ini dan insiden apoptosis yang lebih tinggi di Indonesia sel kumulus bisa menjadi alasan yang masuk akal untuk oosit yang sama tingkat pematangan antar kelompok dalam penelitian ini. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kuersetin melindungi sel kumulus terhadap kadmium diinduksi toksisitas dengan mempertahankan sistem antioksidan dan mengurangi apoptosis [15]. Apalagi penentuan tekad ekspresi faktor-faktor terkait stres dalam sel kumulus bisa menarik untuk mengungkapkan pengaruh quercetin di bawah HS. Dalam penelitian ini, apoptosis folikel pada primer, sekunder atau tahap antral telah diselidiki selama kondisi HS. Aktivitas apoptosis dalam sel granulosa sangat menurun pada quercetin menambah kelompok HS. Insiden apoptosis adalah maksimal pada folikel primer dan antral, namun, folikel primordial tetap tidak terpengaruh. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwa apoptosis memiliki hubungan positif dengan produksi ROS yang berlebihan [39], sehingga tingkat apoptosis yang lebih rendah dalam folikel quercetin ditambah kelompok jelas menunjukkan aksi antioksidan kuat quercetin melawan stres oksidatif. ROS tinggi dan konsentrasi GSH rendah di bawah tekanan bisa menjadi alasan yang mungkin untuk apoptosis yang lebih tinggi pada sel granulosa dari folikel antral. Apalagi quercetin administrasi memainkan peran penting dalam mengurangi ekspresi interleukin yang bertanggung jawab untuk peningkatan superoksida tingkat dismutase dan kemampuan beradaptasi hewan terhadap iklim panas. Level GSH yang lebih tinggi dan pemberian antioksidan menghambat proses sel apoptosis granulosa [40]; Oleh karena itu, penentuan Penanda antioksidan atau kadar MDA dalam cairan folikuler bisa jadi membantu untuk mengeksplorasi keterlibatan ROS dalam sel granulosa apoptosis selama HS. Dampak flavonoid pada kompetensi oosit dan pengembangan embrio lebih lanjut perlu dieksplorasi.

Terlebih lagi, sebuah studi elaboratif tentang ekspresi apoptosis atau faktor-faktor terkait stres dalam mengembangkan folikel atau dalam oosit bisa membantu memahami mekanisme terkait stres pada molekul tingkat.