Materi Gc

1. Kromatografi Gas Kromatografi gas (KG) merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk analisis profil asam lemak karena kemampuannya memisahkan asam lemak dalam jumlah besar (Delmonte dan Rader 2007; Song et al. 2015). KG merupakan teknik pemisahan senyawa, di mana solut-solut yang mudah menguap dan stabil terhadap panas bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya. Solut akan terelusi secara terpisah berdasarkan perbedaan titik didih serta interaksinya dengan fase diam (Mjos dan Pettersen 2001). Sampel yang ideal dalam KG adalah sampel yang hanya mengandung senyawa target dalam pelarut yang mudah menguap, seperti etil eter, alkohol, dan keton. Oleh karena itu sebelum dianalisis dengan KG, sampel utuh harus melalui beberapa tahap pendahuluan, yaitu ekstraksi lemak yang bertujuan memisahkan komponen lemak dari matriks sampel serta derivatisasi asam lemak yang bertujuan mengubah komponen-komponen asam lemak menjadi senyawa volatil metil ester asam lemak (Fatty Acid Methyl Esther, FAME). FAME kemudian dilarutkan dalam pelarut organik dan disuntikkan ke dalam KG dengan alat penyuntik mikro (microsyringe) (AOAC 2000; AOCS 2005). Setelah disuntikkan, FAME akan dibawa oleh gas pembawa untuk melewati fase diam berupa gas yang menyelimuti permukaan dinding dalam kolom kapiler. Gas pembawa harus bersifat tidak reaktif; murni dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi. Gas pembawa yang biasa digunakan antara lain helium, nitrogen, dan hidrogen. Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis detektor yang digunakan. Helium merupakan tipe gas pembawa yang sering digunakan karena memberikan efisiensi kromatografi yang lebih baik

dan mampu

mengurangi pelebaran pita (Shimadzu Corporation 2000). Gas pembawa akan mengantarkan FAME keluar dari kolom untuk diproses lebih lanjut oleh detektor. Detektor merupakan suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik, sehingga bisa dianalisis dengan sistem komputasi.

Detektor yang biasa digunakan

adalah detektor ionisasi nyala api (Flame Ionization Detector, FID). FID bekerja dengan prinsip membakar senyawa yang keluar dari kolom dalam nyala api gas hidrogen dan oksigen. Potensial elektroda dilewatkan ke dalam nyala api. Adanya pembakaran senyawa organik yang mengandung atom C menimbulkan perubahan arus

pada

elektroda. Besarnya perubahan arus tergantung pada jumlah senyawa organik yang terbakar, di mana hasilnya jenis

dan

jumlah

asam

lemak

dicatat dalam bentuk kromatogram. Identifikasi pada

sampel

dapat

dilakukan

dengan

membandingkan puncak kromatogram sampel dengan puncak kromatogram dari asam lemak standar yang telah diketahui jenis dan konsentrasinya (Mjos dan Pettersen 2001). KG terdiri atas kontrol dan penyedia gas pembawa, ruang suntik sampel, kolom yang diletakkan dalam pemanas (oven) yang dikontrol secara termostatik, detector dan pencatat (recorder), serta komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data. Diagram skematik peralatan KG dapat dilhat pada Gambar 1 (Riyanto et al. 2013).

Kromatografi merupakan suatu metode pemisah fisik diantara komponenkomponen yang didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam umumnya mempunyai permukaan yang luas sedangkan fasa gerak mengalir lembut di sepanjang landasan fasa diam. Untuk fasa diam bisa berupa padatan maupun cairan, sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan maupun gas (Poole, 2012). a. Penggunaan Kromatografi Gas Kromatografi gas telah digunakan secara berhasil terhadap sejumlah besar senyawasenyawa dalam berbagai bidang. Ia digunakan baik itu terhadap senyawa organik

maupun anorganik. Persyaratan yang dibutuhkan hanya tekanan uap yang cocok pada suhu saat analisis dilakukan. Dalam banyak hal, turunan-turunan dari senyawa yang berat molekulnya lebih besar digunakan untuk menaikkan volatilitas. Berikut adalah beberapa contoh dari kegunaan kromatografi gas pada bidangbidang yang besar ruang lingkupnya. 1) Bidang farmasi dan obat-obatan Kromatografi gas mempunyai peranan yang penting dalam analisis hasil-hasil farmasi dan obat-obatan. Digunakan dalam pengontrolan kualitas, analisis hasil-hasil baru dan dalam pengamatan metabolisme dalam zat-zat alir biologis. Telah diketahui juga bahwa kromatografi dapat menganalisis alkaloida-alkaloida. 2) Bahan makanan Kromatografi gas yang biasanya digabung dengan KLT dan kromatografi kolom, digunakan untuk mempelajari pemalsuan dan pencampuran, kontaminasi dan peruraian dari bahan-bahan makanan minyak olive, hasil-hasil ternak (susu, mentega dan keju) dan pembungkusan plastik pada bahan makanan. Kromatografi gas telah dipakai juga untuk pengujian jus apel, anggur, sirup, aspirin, dan yang populer adalah lemak babi. 3) Minyak atsiri Kromatografi gas telah digunakan untuk pengujian kemurnian dan kualitas terhadap minyak permen (peppermint oil), minyak jeruk, minyak-minyak sitrat, minyak olive linalool, minyak sereh, minyak daun cengkeh, minyak kenanga dan tepentin. 4) Sisa-sisa pestisida Dengan pemilihan dan penggunaan detektor yang sensitif, kromatografi gas dapat memainkan peranan penting dalam penentuan atau pengontrolan sisa-sisa pestisida yang diantaranya merupakan senyawa-senyawa yang mengandung halogen, belerang, dan fosfor. 5) Bidang kimia dan penelitian Di samping menguji kemurnian hasil, menentukan lama reaksi merupakan masalah utama dalam penelitian. Kita tidak dapat menentukan lama reaksi dengan cara pendugaan. Dengan adanya alat kromatografi gas, reaksi yang sedang berlangsung dapat diikutii jalannya, bahkan kita tidak hanya mengetahui kapan reaksi harus dihentikan, tetapi dari kromatogram kita juga dapat membuat kesimpulan bahwa reaksi dapat berjalan sempurna atau dapat balik. 6) Perminyakan Di dalam dunia perminyakan, penggunaan kromatografi gas telah menunjukan hasil-hasil yang sangat memuaskan dalam pemisahan dan identifikasi hasil-hasil dari gas-gas hidrokarbon yang ringan seperti lilin, aspal, dan minyak-minyak kasar. Sehingga analisis secara sempurna terhadap bahan bakar gas dapat dilakukan. Senyawasenyawa aromatik polisiklis

dalam lilin, dapat pula ditentukan dengan kromatografi gas dengan menggunakan detektor penangkap elektron. b. Prinsip Kromatografi Gas Prinsip kromatografi gas hampir sama dengan kromatografi kolom, yaitu sisem partisi. Pada kromatografi kolom meskipun pelarut sedikit selalu mengadakan interaksi dengan zatnya sehingga menimbulkan kesalahan kualitatif.Pada kromatografi gas, pelarut diganti dengan gas yang sama sekali tidak bereaksi dengan cuplikan (inert). Gerakan pelarut dalam kromatografi kolom sangat lambat, sedangkan pada kromatografi gas sangat cepat dan cuplikan pun dibuat menjadi fase gas pula. Proses yang terjadi dalam kolom dapat digambarkan sebagai berikut. Gambar 6. Proses Pemisahan Dalam Kolom Dalam kromatografi gas molekul cuplikan yang dibawa oleh gas akan ditahan oleh fasa cair. Lamanya penahanan komponen tergantung pada afinitas komponen dengan fasa cair. Bila afinitasnya lemah, maka penahanan akan sebentar saja, sehingga komponen dapat segera keluar dari kolom. Begitu pun sebaliknya apabila afinitas kuat, maka penahanan akan lebih lama sehingga keluar dari kolomnya agak lama. Dengan demikian komponen dalam cuplikan akan terpisah. Kemudian komponen yang telah terpisah akan keluar kolom bersama fasa gerak. Konsentrasi komponen tersebut dapat diukur dengan suatu detektor yang akan menghasilkan sinyal dan dikirim ke pencatat. Komponen-komponen dari sampel yang telah terpisahkan akan menghasilkan kurva-kurva karena masing-masing komponen tersebut ditahan pada kolom dalam waktu yang berbeda-beda. Lamanya waktu suatu komponen ditahan oleh kolom adsorpsi merupakan ciri khas komponen yang disebut sebagai waktu tambat.

c. Instrumentasi Kromatografi Gas Gambar 7. Instrumentasi Krogatografi Gas Secara garis besar, bagian dasar dari kromatografi gas ialah: 1) Gas pembawa Gas pembawa dalam kromatografi gas memiliki syarat-syarat, yaitu inert, koefisien difusi gas rendah, kemurnian tinggi, mudah didapat serta murah dan cocok dengan detektor yang dgunakan. Adapun contoh gas pembawa adalah N2, H2, He dan Ar. Ada kalanya sebelum masuk ke kolom gas pembawa terlebih dahulu dilewatkan pada sebuah penyaring (traps) untuk mencegah masuknya uap air atau impuritis yang lainnya.Gas pembawa yang paling banyak digunakan adalah gas helium

(He), karena: a) Mempunyai BM dan viskositas rendah, sehingga cepat bergerak dan membawa cuplikan keluar kolom. b) Ketahanan terhadap listrik tinggi cocok untuk TCD. c) Aman karena tidak mudah terbakar. Gas pembawa disimpan dalam tabung gas yang bertekanan tinggi. Suatu pengatur tekanan digunakan untuk menjamin tekanan dan aliran gas yang masuk ke kolom tetap, sehingga akan mengelusi komponenkomponen pada waktu yang tetap dan volume gas yang tetap. 2) Gerbang suntik (injector port) Dalam pemisahan dengan kromatografi gas, cuplikan harus berada dalam bentuk fasa uap. Gas dan uap dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan dan padatan yang pertama-tama harus diuapkan. Hal ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk ke dalam kolom. Panas tersebut terdapat pada tempat injeksi.Tempat injeksi pada kromatografi gas selalu dipanaskan. Pada kebanyakan alat, suhu dari tempat injeksi sekitas 500C lebih tinggi daripada titik didih campuran dari cuplikan yang mempunyai titik didih paling tinggi. Apabila kita tidak mengetahui titik didih komponen dari cuplikan maka kita harus mencoba-cobanya. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika puncak yang diperoleh lebih baik, berarti suhu percobaan pertama terlalu rendah. Namun apabila suhu tempat injeksi terlalu tinggi akan mengakibatkan perubahan karena panas atau penguraian dari senyawa yang akan dianalisis. Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan bantuan jarum injeksi, biasa disebut dengan syringe. Perlu diperhatikan bahwa jumlah cuplikan yang diinjekskan tidak boleh terlalu banyak, karena kromatografi gas sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan ketika melakukan analisis berkisar 0.5 – 50 mL untuk sampel gas dan 0.2 – 20 µL untuk sampel cairan. Suhu tempat injeksi harus cukup panas untuk menguapkan cuplikan sedemikian cepat, sehingga kurva tidak melebar tetapi tidak menyebabkan penguraian. 3) Oven Pada kromatografi gas oven yang digunakan harus memenuhi beberapa syarat yaitu oven harus memiliki keseragaman suhu yang baik, kestabilan suhu yang baik, rentang suhu yang lebar, serta dapat digunakan untuk analisis isotermal dan analisis pada suhu terprogram.Pada kromatografi gas, biasanya digunakan dua suhu analisis yaitu analisis isotermal dan analisis pada suhu terprogram. Analisis isotermal yaitu suhu ketika analisis tidak berubah, suhu yang dipakai biasanya sesuai dengan titik didih rata-rata cuplikan. Bila terlalu tinggidapat mengganggu daya pisah. Sedangkan bila terlalu rendah waktu retensi terlalu rama. Analisis suhu terprogram yaitu suhu oven berubah sesuai dengan kebutuhan (suhu naik sesuai dengan waktu berjalan yang diprogramkan). Pemrograman suhu ini digunakan untuk

memperbaiki, menyederhanakan atau mempercepat pemisahan, identifikasi, dan penentuan komponen cuplikan. Program digunakan ada tiga macam yaitu alami atau balistik, linear, dan matriks atau multilinear. Kromatografi gas suhu diprogram digunakan pada analisis campuran yang rumit dan komponen mempunyai rentang titik didih yang lebar. Jika kita gunakan suhu yang tetap, beberapa komponen tidak muncul atau saling bertumpukan. Adapun salah satu syarat suhu diprogram adalah oven untuk gerbang suntik, kolom dan detektor harus terpisah. 4) Kolom Kolom dapat diibaratkan sebagai jantungnya kromatografi. Pada bagian inilah terjadinya pemisahan komponen dari cuplikan. Secara umum kolom yang lebih panjang dapat memisahkan lebih baik, namun waktu analisisnya menjadi lebih lama. Selanjutnya semakin kecil diameter dalam, semakin baik pemisahannya. Kolom dibuat spiral atau untuk menghemat tempat. Ada dua jenis kolom: a) Kolom kemasan/ter-packing (packed column) Bahan pembuat kolom ini terbuat dari logam (misalnya stainless steel, tembaga, nikel, dan alumunium), kaca (fused silica), plastik (packing) misalnya politetrafluoroetilen (teflon), polivinilklorida (PVC), untuk kapiler dipakai nilon. Bahan pengisi kolom kromatografi gas terdiri dari fasa pendukung/penunjang yang dilapisi oleh cairan sebagai fasa diam. Persyaratan bagi fasa penunjang adalah harus tidak menyerap cuplikan, inert, kuat terhadap tekanan gas yang tinggi, dan stabil pada suhu tinggi. b) Kolom kapiler (capillary column) Kolom kemas dapat diganti dengan kolom kapiler yang panjang yang terbuat dari kolom kaca atau silikat yang dilelehkan (fused silica). Dalam hal ini dinding kolom kapiler berlaku sebagai fasa penunjang sedangkan fasa cair pada kolom kemasan dilapiskan pada fasa penunjang, kini dilekatkan pada dinding kapiler itu sendiri. Kolom kapiler berdiameter halus, misalnya 0.2 mm dengan panjang antara 50 – 100 m. Kolom seperti ini sangat efisien, dengan JPST sebesar 1 mm akan mempunyai jumlah kepingan teoritis sebanyak 50.000, padahal kolom kemas yang paling baik hanya mempunyai kepingan teoritis sebanyak 5000.Kalau pada kolom kemas fasa cair yang diisikan banyak jenisnya, maka pada kolom kapiler yang efisiensinya sangat tinggi cukup digunakan dua jenis saja, yaitu yang bersifat polar untuk pemisah komponen-komponen polar dan yang bersifat nonpolar untuk memisahkan komponen yang nonpolar. 5) Detektor Detektor pada kromatografi gas adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponenkomponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Pada garis besarnya detektor kromatografi gas termasuk detektor diferensial dalam arti kata respon yang keluar dari detektor memberikan hubungan yang linear dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang terelusi.

Kromatogram dibuat dengan memplot waktu tambat, Rt (dalam menit) dengan laju tegangan listrik mV yang tinggi, h (dalam cm), hasilnya merupakan deretan bukit yang setiap bukit menunjukkan satu komponen. Bila dihubungkan dengan Mass Spectromter (MS) hasilnya akan berupa garis. Berikut adalah 13 detektor yang direkomendasikan oleh ASTM: a) Thermal Conductivity Detector (TCD) b) Flame Ionization Detector (FID) c) Electron Capture Detector (ECD) d) Nitrogen Phosporus Detector (NPD) e) Flame Photometric Detector (FPD) f) Electrolytic Conductivity Detector (ELCD) g) Photo Ionization Detector (PID) h) Infra Red Detector (IRD) i) Atomic Emission Detector (AED) j) Helium Ionization Detector (HID) k) Mass Selecting Detector (MSD) l) Redox Chemiluminescence Detector (RCD) m) Thermionic Ionization Detector (TID) Pada penentuan kadar lemak trans dalam margarin ini digunakan detektor FID (Flame Ionization Detector) dimana detektor ini mendeteksi berdasarkan selisih tegangan listrik yang dihasilkan oleh komponen-komponen dalam sampel. 6) Sistem Pengolah Data Sinyal analitik yang dihasilkan oleh detektor dikuatkan oleh rangkaian elektronik agar bisa diolah oleh rekorder. Sebuah rekorder bekerja menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. Pena yang dipasangkan di atas kertas tersebut akan digerakkan oleh penguat keluaran sinyal detektor. Hasil rekorder adalah kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi contoh dan jenis detektor yang digunakan (Poole, 2012) d. Flame Ionization Detecto (FID), Detektor Ionsasi Nyala Dalam detector jenis ini, komponen zat dibakar menjadi ion yang bermuatan oleh nyalah hidrogen dan udara. Ion tertarik ke anoda atau ke katoda di dalam tabung detector yang sudah mempuyai selisih tegangan listrik tertentu. Dengan adanya ion, maka selisih tegangan listrik

antara anode dan katoda terganggu. Besarnya pebedaan tegangan listrik yang terjadi sesuai dengan jumlah/konsentrasi komponen. Perubahan tegangan listrik diteruskan ke transducer untuk diamplifiksikan sehingga menggerakkan jarum rekorder seperti rekorder-rekorder yang biasa digunakan. Sinyal dari detector tertentu dapat dihubungkan ke computer atau data processor yang mencatat waktu retensi, luas area puncak dan bahkan dapat langsung megenali jenis komponen jika sebelumnya sudah diprogramkan. Untuk mengopeasikan detector FID, diperlukan gas hidrogen dan udara tekan, sedangkan sebgai fasa geraknya digunakan gas nitrogen murni atau helium. Pada alat kromatografi gas komersial biasanya selalu dilengkapi dengan dua detector FID (detector A dan detector B) agar dapat digunakan secara bergantian. Masing-masing dapat melakukan analisis pada kolom A dan kolom B sendiri-sendiri dengan jenis kolom yang berbeda fasa diamnya. Detektor A dan detector B masing-masing berdiri sendiri.