Manual De Métodos Para La Evaluación Del Estado Fisiológico Del Pulpo Rojo Octopus Maya1

Manual de métodos para la evaluación del estado fisiológico del pulpo rojo Octopus maya

Honorio Cruz, Ariadna Sánchez, Carlos Rosas y Cristina Pascual Laboratorio Central 1 Bioquímica, Inmunología y Biología Molecular” UMDI, Fac. Ciencias, UNAM. Sisal, Yucatán.

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Índice

1.- Manejo de los organismos.........................................................................6 2.- Obtención de la sangre. ............................................................................. 7 3.- Evaluación de indicadores nutricionales sanguíneos....................9 4.- Metabolitos en plasma. .............................................................................10 5. Indicadores inmunológicos sanguíneos ...............................................17 6. Bioquímica de los tejidos; gónada, glándula digestiva y músculo. ............................................................................................................... 25 7. Determinación de contenido energético; mediante la bomba calorimétrica (Parr instrumens).................................................................. 29 8.- Bibliografia.................................................................................................... 33 9. Anexos.............................................................................................................. 36

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Introducción. En los últimos años se ha incrementado el interés por diversas especies de cefalópodos, tanto en su cultivo (Iglesias et al., 2000; Iglesias et al., 2004; Rosas et al., 2007), como en las ciencias biológicas y médicas por ser usados como modelos biológicos (Boletzky and Hanlon, 1983; Rosas et al., 2007). El pulpo rojo Octopus maya es un molusco con gran importancia económica, ocupa el doceavo lugar en cuanto a la captura en zona litoral de la Península de Yucatán y es cuarta pesquería más importante en el litoral del Golfo de México y Caribe, además de ser una especie endémica. Por tal motivo, se torna indispensable contar con herramientas de diagnóstico que nos permitan establecer estrategias de monitoreo para conocer la respuesta fisiológica integral en la que se encuentran los pulpos en diferentes condiciones ambientales, tanto en el medio natural como en condiciones de cultivo. El fuljo de materia y energía que mantiene un estado fisiológico integral ocurre de manera simultánea e incesante entre el organismo y su entorno. Este flujo comienza con la energía química contenida en a partir de los nutrimentos (lípidos, carbohidratos y proteínas) y aportados en primera instancia por el alimento. Esta energía se transforma en gradientes eléctricos, iónicos, osmóticos y de concentración muscular, etc., indispensable para producir trabajo y mantener la integridad estructural, además otros actividades como el crecimiento y la reproducción (Hill, 1979). En este sentido, en cualquier organismo la deposición movilización y utilización de los diferentes componentes bioquímicos e inmunológicos es indispensable como parte del mantenimiento de la homeocinesis. Los avances en la bioquímica fisiológica en organismos marinos como crustáceos decápodos ha permitido determinar que tanto los componentes de la hemolinfa, como de otros estructuras, como el músculo y la glándula digestiva, reflejan el aprovechamiento y el uso de la energía (Rosas et al 2001a; Rosas et al, 2001b; Sánchez et al 2001; Pascual et al. 2006). En cuanto a los cefalópodos, estos han sido objetos de diversos estudios, donde describen diversos patrones de comportamiento en la composición bioquímica de los principales tejidos (músculo, la glándula digestiva y gónada), con respecto a su hábitat, crecimiento, desarrollo sexual y alimentación (Pollero et al., 1987; Clarke et

al., 1994; de Moreno et al., 1997; Rosa et al., 2002; 2004; 2005a; 2005b; Otero et al., 2007; Seiro et al., 2006; Özogul et al., 2008; Cruz, 2009) La sangre o hemolinfa es un tejido de transporte y reserva de nutrimentos (carbohidratos, lípidos y proteínas), además del sistema de defensa. En este contexto y dado que en la sangre se encuentran las moléculas nutricionales e inmunológicas que son transportadas a los distintos tejidos internos, la evaluación de componentes en la hemolinfa ha sido utilizada como un indicador

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de los mecanismos de regulación en organismos expuestos a diferentes condiciones (Ferraris et al 1986; Vinagre y Da Silva, 1992; Santos y Keller, 1993; Webster, 1996; Hall y van Ham, 1998; Racotta y Palacios, 1998; Rosas et al 2001a; Rosas et al, 2001b; Sánchez et al 2001; Pascual et al. 2006). Las proteínas, ocupan una posición central por ser la base para la formación de enzimas, hormonas, hemocianina, componentes de la respuesta inmunitaria, y además intervienen directamente en la construcción de tejidos (crecimiento), y en la reparación y mantenimiento de éstos. Asimismo, son fuente de energía en los procesos catabólicos y son esenciales en el metabolismo de carbohidratos y lípidos. Dentro de las proteínas sanguíneas se encuentra la hemocianina (Ernst F. J. van Bruggen 1980; Marianne E. et al., 1998; Fabrice Mouche et al., 1999), macromolécula que tiene incorporado el cobre el cual funciona como un sitio activo, cuya función es de tipo respiratorio por acarrear oxígeno y también actúa como reserva de proteínas (Rainer y Brouwer, 1993; Van Holde et al., 2001). Los lípidos son insolubles en agua, entre ellos, los triacilglicéridos, que son ésteres de ácidos grasos y glicerina, representan la mayor fuente de energía y la forma predominante de almacenamiento. Otro compuesto lipídico de importancia es el colesterol, y es precursor de la vitamina D (controla la digestión y almacenamiento del Calcio) y de hormonas esteroides. Aunque el conocimiento de los sistemas de defensa de los cefalópodos está aún en una etapa inicial y se desconocen muchos de la regulación de la respuesta inmune, en el presente manual se presentan diferentes técnicas inmunológicas que, hoy por hoy, se han aplicado en el pulpo rojo del Caribe Octopus maya. Entre los carbohidratos, la glucosa es fuente de energía, y el lactato, producto del metabolismo de carbohidratos, se asocia a condiciones de estrés, por la activación del metabolismo anaerobio. Son muy pocos los estudios sobre indicadores nutricionales sanguíneos en moluscos cefalópodos (Heras and Pollero 1990; Malham et al., 1998; Águila et al., 2007; Cruz, 2009). Sin embargo, en estos estudios se observó que los metabolitos sanguíneos actúan, al igual lo observado en crustáceos, como indicadores del estado fisiológico. Aunque el conocimiento de los sistemas de defensa de los cefalópodos está aún en una etapa inicial y se desconocen muchos de la regulación de la respuesta inmune hay algunos estudios realizados hasta ahora en cefalópodos componentes del sistema inmunológico (Auffret M. et al., 1994; Oubella R. et al, 1993). Estos estudios señalan que los hemocitos, es decir, las células sanguíneas, presentan capacidad fagocítica, de encapsulación y neutralización de sustancias extrañas, y que también participan en procesos de inflamación y regeneración de heridas (Beuerlein et al., 2002). En invertebrados, la amplificación de la respuesta inmunológica está directamente relacionada al sistema profenoloxidasa (ProFO) (Hernández-López et al., 1996; Gollas-Galván et al.,

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1999) y el sistema de coagulación (Montaño-Pérez et al., 1999) presentes en estas células. El sistema ProFo, al activarse, genera algunos factores que estimulan a los hemocitos para que eliminen el material extraño (Söderhäll y Häll, 1984; Sung et al., 1998). Durante el proceso fagocítico, se origina el fagolisosoma, además de liberarse sustancias líticas biológicamente muy reactivas como el peroxido y el superóxido (Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002); este proceso se conoce como estallido respiratorio y juega un papel central en la actividad microbicida de los hemocitos. Las aglutininas son el componente humoral mejor estudiado en cefalópodos; y en éste, las lectinas de la hemolinfa intervienen al reconocer y aglutinar una variedad de eritrocitos de vertebrados así como de bacterias patógenas (Fisher y Dinuzzo, 1991). Con todo lo anterior, el presente manual se ha elaborado con el objeto de poner a la disposición, a estudiantes y profesionales, una serie de métodos estandarizados para la evaluación de diversos componentes tanto de la hemolinfa, como de otros estructuras, como el músculo y la glándula digestiva, en la que su integración permita un conocimiento integral de la bioquímica fisiológica de los organismos sujetos a estudio. En estos métodos se incluyen aspectos que intervienen en su correcta evaluación, desde el manejo de los animales, obtención y procesamiento de muestras, hasta la forma en que se deben procesar los datos.

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1.- Manejo de los organismos. a) Material. o o o o o o

Contenedores de 100 L (depende del tamaño del pulpo). Contenedores (20 L). (depende del tamaño del pulpo). Red de mano. Bombas de aireación. Termómetro. Contenedores de hielo.

b) Fundamento. El manejo antes de la toma de muestra de sangre es un aspecto crucial en este tipo de análisis. Esto se debe a que la manipulación en si misma puede alterar, de manera significativa, los componentes sanguíneos. Por esta razón antes de la extracción de la sangre, los pulpos se deben de introducir en un baño frio (16 ° C por debajo de la temperatura inicial) que funcionará como anestesia termal para reducir su metabolismo (se adormece) y prevenir que algunos de los metabolitos plasmáticos, como la glucosa y el lactato, no sean alterados rápidamente por la manipulación. El tiempo de exposición a este baño termal depende del tamaño de los organismos. En pulpos de 300 a 1000 g el tiempo es de 3 a 4 minutos mientras que en pulpos menores 200 g se mantienen por 2 o 3 minutos en el baño frío. a) Procedimiento Monte el sistema en el cual permanecerán los pulpos. Dependiendo del número y tamaño de los organismos son los contenedores donde estos serán colocados: para el caso de pulpos de menores de 200 g se recomiendan contenedores de 50 L, y para mayores de este peso, contenedores de 100 L. Se requiere llenar los contenedores a la mitad de su capacidad y mantenerlos con aireación (Fig. 1a). Cabe mencionar que es importante cuidar que el volumen de agua sea suficiente ya que ayuda a evitar que los organismos salgan. Es muy importante manipular a los pulpos en la menor medida posible por lo que al introducir los pulpos en los contenedores deben colocarse con suavidad ya que podrían estresarse y arrojar su tinta. Es necesario tomar por completo al pulpo ya que se podría adherir fuertemente al contenedor.

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Prepare el contenedor de 20 L donde será transportado tra sportado el organismo al laboratorio donde se harán las evaluaciones sanguíneas. Pasar el pulpo al contenedor como ya se describió anteriormente. Una vez tra ransportado tado al laboratorio, tome la temperatura del medio en ell que ha sido mantenido el pulpo. pulpo En un recipiente de 20 L, L lleno con 15 L de la misma agua de mar, mar, coloque los contenedores con hielo hasta que se llegue a una temperatura 12 ° centígrados menor que la temperatura de mantenimiento. Es importante mantener esta temperatura en todo el muestreo. Se recomienda enda preparar dos contenedores para la anestesia termal por si algún pulpo llegará áa arrojar tinta.

a)

b)

Figura 1.. Sistema Sistema de aclimatación de los organismos en el laboratorio: laboratorio contenedores de 10 100 0L (1), con aireación (2). (2) b) manejo ejo del pulpo.

Una vez alcanzada la temperatura deseada deseada, se coloca suavemente al pulpo en el contenedor de anestesia anest termal y con un cronómetro se toma el tiempo de permanencia del del pulpo en esta condición (Fig. 2a). Paralelamente, s se monitorea onitorea la respuesta del pulpo: pasado un minuto minuto, se toma con las manos al pulpo y si pone resistencia, resistencia se le deja otro otros tres minutos. minutos Es s importante monitore monitorear continuamente al pulpo porque si se pasa del efecto de la anestesia termal, morirá y no se podrá extraer la sangre. sangre Una vez adormecido el pulpo pulpo, se extrae del contenedor y se envuelve los brazos con una franela, franela quedando só sólo la cabeza expuesta (Fig. 1b). Posteriormente se coloca al pulpo en la charola de disección para la extracción de la sangre.

2. Obtención de la sangre. 2.a) Material o Caté éteres es Marca Punzocat: No. 24 G * 3/4" (20 mm) y No. 22 G * 3/4"(25 mm). mm) o Catéter Catéter de alimentación (diámetro externo 2.67 mm) o Viales estériles de 10 ml

o Cinta teflón o Mango de bisturí y n navaja avaja de bisturí No. 11 o Puntas para micropipeta 100 a 1000 µl y de 20 a 200 µl. o Tubos Eppendorf de 1.5 ml. ml o Franelas de algodón. o Estuche de disección. o Plancha de disección.

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o o o o o o

Toallas secantes. Cronómetro. Alcohol al 70 %. Agua de mar filtrada. Gradillas con hielo Guantes

b) Equipo o Una micropipeta de 100 a 1000 µl y o Dos micropipetas de 20 a 200 µl.

Procedimiento. Antes de cada pulpo muestreado, el material debe ser enjuagado con alcohol al 70 %. El proceso de extracción sanguínea requiere de dos personas, una quien sujeta al pulpo, y la otra, quien realiza la disección requerida para la obtención de sangre. Cabe mencionar que la persona que sujeta al pulpo, coloque a éste en forma semiinclinada para así evitar que pierda el agua contenida en el manto. La disección se realiza en la zona central adyacente a la parte frontal del pulpo. En ese sitio se toma el manto con unas pinzas de ratón y, cuidadosamente con el bisturí se hace un pequeño corte longitudinal. Posteriormente se van cortando las capas del músculo del manto, hasta que se llega a la última capa, una capa muy delgada, a través de la cual se hace visible la aorta principal. En ese punto, con unas tijeras se corta la ultima capa de la dermis dejando al descubierto los órganos y la aorta principal (fig. 2b). Una vez encontrada la aorta, se obstruye con unas pinzas de presión con lo cual se mantiene el pulso, y con ello, el flujo de sangre. Posteriormente, se introduce el catéter y se conecta al catéter de alimentación el cual dirige la sangre al tubo colector estéril de 10 ml. Es importante mencionar mientras se extrae la sangre, se debe dar un ligero masaje por debajo de la cabeza del pulpo, lo cual ayuda a bombear la sangre (fig. 2c). El tiempo máximo para la obtención de sangre es de 4 minutos. Una vez extraída la sangre se distribuye para las diferentes evaluaciones en tubos Eppendorf de 1.5 ml y se conserva en frio (2-8 °C).

Figura 2. a) pulpo en proceso de anestesia termal, b) corte del músculo del manto, c) extracción de la sangre con cateter.

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3.- Evaluación de indicadores nutricionales sanguíneos. 3.1 Hemocianina. a) Material:

b) Equipo:

o Cajas de puntas para micropipeta de 2 a 20 µl y 100 a 1000 µl. o Agua destilada. o Tubos Eppendorf. o Papel secante. o Contenedor de desechos.

o Micropipetas de 2 a 20 µl y 100 a 1000 µl. o Espectrofotómetro con lámpara UV (absorbancia 335 nanómetros nm). o Cubetas Ultravioletas (UV) para espectrofotómetro.

Se prende el espectrofotómetro se ajusta a 335 nanómetros (nm). Posteriormente se coloca una celda de UV de 1 ml en el espectro la cual deberá contener 990 l de agua destilada, y se calibra a cero de absorbancia. Se debe de tener cuidado de no tocar con los dedos los lados de la celda de UV por donde pasa la radiación (Fig. 3).

No tocar

Figura 3. Celda de UV de 1 ml y espectrofotómetro. Se toman 10 l de la sangre con una micropipeta y se diluyen en 990 l de agua destilada contenidos en un tubo Eppendorf. Posteriormente se coloca en la celda para UV, se revisa que ésta no tenga manchas de dedos ni burbujas, y se coloca en el espectro. Se anota el valor obtenido. Este procedimiento se hace por triplicado. c) Cálculo: Se realiza un promedio de las réplicas de la muestra. La concentración de hemocianina (Hc) se calcula utilizando el coeficiente de extinción  =17.26.

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Ejemplo: Replicas: 0.327, 0.328, 0.330 = promedio 0.328, entonces: Hc = (0.328/17.26) * FD Donde: FD = Factor de Dilución. Si se utilizaron 10 l en 990 l, entonces 1000/10 = 100. Por lo tanto: Hc = (0.328/17.26) * 100 = 1.378 mmol/L

4.- Metabolitos en plasma. 4.1- Obtención del plasma. a) Material: o Tubos Eppendorf (0.5 ml) o Gradillas con hielo. o Puntas para micropipeta 20 a 200 µl y de100 a 1000 µl. o Contenedor de desechos.

b) Equipo: o Micropipetas de 2 a 20 µl y 100 a 1000 µl. o Centrifuga refrigerada.

Las muestras se centrifugan a 800 g (2500 revoluciones por minuto (rpm)) por 5 minutos a 4 °C. Posteriormente se retira el sobrenadante (plasma), introduciendo lentamente la punta de la micropipeta sin tocar el paquete celular, el cual para este tipo de análisis no interesa. El plasma se deposita en tubos Eppendorf nuevos y marcados con la misma secuencia de números que se siguió desde la extracción de la sangre. Las muestras de plasma siempre deben mantenerse a una temperatura de 28 °C., y deben realizarse el mismo día que se obtiene la sangre. 4.2.- Fundamento de cuantificación de metabolitos. La cuantificación de la glucosa, lactato, colesterol, triglicéridos y proteínas se llevan a cabo con Kits comerciales, a través de los cuales se evalúan colorimétricamente reacciones enzimáticas, a excepción de las proteínas, en las que no se cuantifican reacciones enzimáticas, sino la reacción de enlaces químicos de una solución acídica de color (Azul Coomassie) por la presencia de proteínas. El principio para todos los metabolitos se basa en los cambios de color diferencial, identificados espectrofotométricamente a través de la absorbancia de la solución en la longitud de onda correspondiente y registrada en densidades ópticas. a) Proteínas totales solubles. Se determina la concentración de proteínas solubilizada a través de una solución acídica de color, el azul Coomassie, el cual se liga a los aminoácidos primariamente básicos y aromáticos, especialmente la arginina. La absorbancia máxima para esta solución ocurre de 465-595 nm, cuando sucede el enlace con proteínas.

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b) Triglicéridos. El glicerol liberado en la hidrólisis de los triglicéridos, por la acción de la lipoproteínlipasa, se convierte, mediante la glicerol-3-fosfato, que se oxida por la glicerol-fofato oxidasa en dihidroxiacetona y peróxido de hidrógeno. Ante la peroxidsa, el peróxido de hidrogeno oxida al cromógeno 4-aminoantiripina/p-clorofenol, en un compuesto de color naranja pálido. c) Colesterol. Los ésteres del colesterol son hidrolizados por el colesterol éster hidrolasa para liberar colesterol y ácidos grasas. El colesterol libre existente, conjuntamente con el producido por el colesterol oxidasa a. a) Glucosa. La glucosa es transformada por la glucosa oxidasa en ácido glucónico y peróxido de hidrogeno; éste último, en presencia de peroxidasa, oxida el sistema cromógeno (4aminofenazona/fenol) convirtiéndolo en un compuesto de color rosa. a) Lactato. El acido láctico es convertido a piruvato y peróxido de hidrógeno (H2O2) por la lactato oxidasa. En la presencia de H2O2 formando, la peroxidasa cataliza la condensación oxidativa de cromógenos que produce un color violeta. 4.3.- Uso de Kits. Los Kits de glucosa (ELITech GPSL-5505), colesterol (ELITech CHSL-5505), y triglicéridos (ELITech TGML-5415), cuentan con el reactivo listo para ser usado. Sin embargo, con respecto al lactato y proteínas, el procedimiento cambia. En el lactato (Trinity 735-10), se adicionan 10 ml de agua libre de pirógenos (agua estéril, la cual puede encontrarse en las farmacias como agua inyectable) en el frasco y se disuelve. Para las proteínas, es necesario diluir el reactivo (Proteína BIO-RAD-500-0006) en agua libre de pirógenos, en una proporción de 1:4. Por ejemplo, si se desea preparar un total de 250 ml, se necesitan diluir 50 ml de reactivo madre en 200 ml de agua libre de pirógenos. Posteriormente se filtra, con filtro Whatman (0.2 µ de diámetro de poro), con ayuda de una bomba de vacío. Antes de realizar las evaluaciones, es importante verificar la fecha de caducidad marcada en la etiqueta externa del kit; y una vez preparado el reactivo, marcar la fecha de preparación y caducidad. Es necesario mantener los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 1).

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4.4.- Evaluación. a) Material: o Puntas para micropipeta de 2-20 μl. o Puntas para Micropipeta de 1001000 μl. o Tubos Eppendorf de 0.5 ml y 1.5 ml (nuevos). o Gradilla para tubos Eppendor. o Placas de hielo. o Puntas para micropipeta de repetición. o Microplacas para lector de ELISA (Essay Link Immunology Specific Antibody). o Contenedor de desechos.

Guantes. Cronómetro. Plantillas de referencia. Canaletas para multicanal para los reactivos. o Gradillas con hielo. o o o o

b) Equipo: o o o o o

Micropipeta de 2-20 μl. Micropipeta de 100-1000 μl. Micropipeta de repetición. Espectrofotómetro de Microplacas. Vórtex.

c) Procedimiento: Antes de comenzar las evaluaciones es necesario atemperar las soluciones reactivas de los kits. Una vez obtenido el plasma, colocar en una microplaca para el lector de ELISA: 10 µl de muestra + 200 µl de solución reactiva (kit): Tiempo de incubación Lectura en el lector de microplacas. Es decir, se colocan 10 µl de la muestra de plasma en un pozo (cada muestra por triplicado). Posteriormente se añaden 200 µl de solución reactiva (kit), se espera el tiempo de incubación y se lee la absorbancia en un espectrofotómetro de microplacas (fig. 4). Con una pipeta de repetición se pueden dispensar los 200 µl lo cual reduce el tiempo empleado en el llenado de los pozos de la microplaca, sobre todo si se considera que la evaluación colorimétrica de cada uno de los metabolitos, tienen un límite de tiempo de incubación, mismo que es necesario medir con precisión.

Fig. 4. Lector de microplacas (Benchmark Biorad).

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Es importante mencionar que para evaluación de las proteínas, se requieren tomar 5 µl del plasma y diluirlo en 2 ml de agua libre de pirógenos, esto se realiza en un tubo Eppendorf de 2 ml. Dependiendo la concentración de proteínas que contenga el plasma se realizará otra dilución, por ejemplo, si las densidades ópticas están por debajo de los valores registrados para la menor concentración de la curva patrón, se realizará otra dilución aumentando la cantidad de muestra, por ejemplo, 10 µl en 2000 µl. Tabla 1. Uso de reactivos. Solución reactiva

Tempo de la reacción (minutos)

Estabilidad de la reacción (minutos)

Longitud de onda (nm)

Glucosa

2

60

500

Lactato

10

10

540

Colesterol

5

60

500

Triglicéridos

7

60

500

Proteínas

5

60

595

Tiempo de caducidad del reactivo preparado. La fecha que indica la caja, manteniéndolo en 2-8 °C y protegido de la luz 8 horas 18-26 °C; 7 días 2-8 °C; 30 días congelado. La fecha que indique la caja, de 57 días si se almacenan 4 °C, -20 °C 3 meses y varios años a -70 °C. La fecha que indique la caja, de 57 días si se almacenan 2-8 °C, 15-20 °C 3 meses y varios años a -70 °C. 60 días 4 °C; 2 semanas a 15-25 °C

Además de la muestras de plasma que se van a evaluar, se debe adicionar en la microplaca, un blanco y una curva patrón para cada metabolito. Al considerar un blanco se elimina la absorbancia que presentan las sustancias ajenas a la reacción colorimétrica del metabolito con el reactivo. Como blanco se usará agua libre de pirógenos, en particular para proteínas, debido a la dilución que se realiza para su evaluación. La curva patrón es un procedimiento técnico indispensable que permite cuantificar la concentración total final de cada uno de los metabolitos. Está integrada por una serie de seis diluciones, que van de una concentración menor a una mayor, y que se preparan a partir de una solución estándar, que no es más que el sustrato sobre el cual actúan las enzimas contenidas en la solución reactiva del kit.

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Al adicionar la solución reactiva a las diluciones preparadas con el estándar de acuerdo con las concentraciones consideradas en la curva patrón, se espera que los valores de la densidad óptica obtenida una vez que ocurre la reacción colorimétrica, sean directamente proporcionales al valor de concentración de la dilución (la forma de verificar este comportamiento se explica en la parte de cálculos). Por ello, a través de la evaluación de la reacción de las diluciones de la curva patrón con la solución reactiva del kit, es posible valorar la estabilidad de ésta, por ejemplo, si las densidades ópticas obtenidas de las diluciones que integran la curva patrón no tienen un comportamiento de aumento proporcional conforme aumenta la concentración de la solución estándar, o bien, si no hay reacción colorimétrica, entonces hay indicios de alteración en la solución reactiva del kit. Por ello, es necesario correr la curva patrón para cada uno de los metabolitos al momento de realizar las evaluaciones en la placa. En el anexo 1 presenta la relación de concentraciones requeridas y las diluciones a preparar para cada curva patrón. Los kits de glucosa, colesterol y acilglicéridos cuentan con la solución estándar. Para el caso de proteínas y lactato, la solución estándar se adquiere aparte. Para las proteínas es albúmina bovina (Sigma A-7906 o Pierce-23209, este último viene específicamente en la concentración deseada); y para el lactato, la solución de referencia tiene el número de catálogo: Trinity 826-10. A continuación se muestra un esquema de la plantilla de referencia de una microplaca de lector de ELISA con un formato de ubicación de los tres elementos que se consideran en el procedimiento: blanco, curva patrón y muestras (en el caso de que fueran 5 pulpos muestreados):

Blanco Curva patrón

Muestras (1-5)

En el esquema se observa que se tienen tres repeticiones por cada elemento considerado, sin embargo, una vez que el error manual de pipeteo disminuye, se pueden realizar sólo dos repeticiones. En el caso de las proteínas y los triglicéridos, se recomienda hacer las tres repeticiones. Es necesario recalcar la importancia que tienen las plantillas de referencia, estas son usadas para llevar un orden y para evitar una confusión en los pozos de la microplaca, estas se rotulan y se colocan abajo de la microplaca.

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Si las muestras a evaluar exceden los pozos de la microplaca, debe de repetirse el blanco en la nueva microplaca. Por otro lado, si no se cuenta con un espectrofotómetro de microplacas, las evaluaciones se pueden realizar en un espectrofotómetro convencional, siguiendo los pasos que marca el instructivo para cada kit clínico. 4.5.- Cálculo. Como ejemplo de los cálculos a realizar, a continuación se presenta el procesamiento de datos de proteínas obtenidos en un muestreo llevado a cabo en adultos de pulpo rojo del Caribe (Octopus maya). Se realizó una dilución de 5 µl en 2 ml de agua libre de pirógenos. a) Valores obtenidos (Densidades ópticas). Como primer paso, es necesario llevar a cabo una regresión lineal con el promedio de los valores de densidad óptica obtenidos en la curva patrón, a los cuales se les resta el valor promedio del blanco. Valores obtenidos en la curva patrón Concentraciones Curva patrón (mg/ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Densidades ópticas de la curva Repeticiones 0.402 0.480 0.617 0.743 0.858 1.050

0.406 0.482 0.616 0.759 0.896 1.025

Promedios 0.405 0.500 0.625 0.773 0.909 1.021

0.404 0.487 0.619 0.758 0.888 1.032

Densidades ópticas del blanco Repeticiones 0.336 0.339 0.338 0.338

Promedios de densidades ópticas Curva – blanco

0.404 0.487 0.619 0.758 0.888 1.032

b) Verificación estadística y comportamiento matemático de los valores obtenidos en la curva patrón. Como ya se mencionó, se espera que los valores de las densidades ópticas obtenidas en cada una de las concentraciones consideradas en la curva patrón, sean directamente proporcionales al aumento en la concentración del estándar. Por ello, al correr la regresión, se tiene que verificar el coeficiente de correlación múltiple (preferentemente no debería ser menor a 0.98), y el valor de significancia de la regresión (valor crítico de F ≤ 0.05).

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En caso de que el valor de correlación sea menor a 0.98, se requiere corre una nueva curva patrón. Además de estos índices, como resultado de la aplicación de la regresión se obtienen el valor del intercepto y la pendiente (variable x1), indispensables para el cálculo de la concentración final del metabolito a evaluar. Estadística de regresión

0.9997 0.00001 0.0342 1.3757

Densidades opticas

Coeficiente de correlación múltiple. Análisis de varianza: Valor critico de F. Intercepto. Variable X1(dependiente)

Variable X 1 Curva de regresión ajustada 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0

0.2

0.4

0.6

Concentraciones

c) Análisis final. Una vez verificado el comportamiento de los datos, el cálculo de la concentración final debe realizarse a partir de la ecuación de la recta: Donde: y = a + bx a= intercepto b= pendiente x= concentración (mg/ml) y= valores de densidad óptica (DO) Considerando los datos obtenidos en la ecuación de la recta, entonces: Concentración = ((DO muestra – DO blanco) – (intercepto) / pendiente) (FD)

DO = Densidades ópticas (valores promedios). FD = Factor de dilución, para el caso de proteínas 5 µl de plasma + 2 ml de agua libre de pirógenos; FD = 401. La concentración para todos los metabolitos (glucosa, lactato, colesterol, triglicéridos y proteínas) se expresa en mg/ml. Valores obtenidos:

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Muestras Blanco

Replicas (DO) 0.336

0.339

Promedio 0.338

0.338

Calculo: PromBlanco

1 2 3 4 5

0.878 0.970 0.830 0.910 0.843

0.88 0.969 0.835 0.900 0.841

0.875 0.975 0.833 0.951 0.843

0.878 0.971 0.833 0.920 0.842

0.540 0.634 0.495 0.583 0.505

mg/ml 154.803 181.861 141.803 167.128 144.596

Como ya se mencionó, este ejemplo corresponde a la evaluación de proteínas, y se llevaron a cabo tres repeticiones, y una dilución de 5 µl de plasma en los 2000 µl de agua libre de pirógenos. En caso que las réplicas no se comporten como tal, se elimina el valor alejado de los otros dos.

5. Indicadores inmunológicos sanguíneos Como ya se mencionó en el capítulo 2, correspondiente a “Obtención de sangre”, una vez extraída la sangre del pulpo se distribuye en tubos Eppendorf (1.5 ml) para las diferentes evaluaciones, algunas de las cuales corresponden a las inmunológicas:    

Conteo de hemocitos Actividad de Fenoloxidasa Estallido Respiratorio Hemaglutinación

5.1 Manejo de la hemolinfa: Obtención de plasma y degranulado de hemocitos a) Material: o Puntas nuevas para micropipeta de 2-20 μl. o Puntas nuevas para Micropipeta de 100-1000 μl. o Tubos Eppendorf de 1.5 ml. o Gradilla congelada para tubos Eppendor. o Contenedor de desechos. o Guantes.

b) Reactivos: o Solución anticoagulante. o Cacodilatos. o Agua estéril inyectable. c) Equipo: o Micropipeta de 2-20 μl. o Micropipeta de 100-1000 μl. o Centrífuga refrigerada.

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Algunas evaluaciones inmunes se realizan en plasma y otras en degranulado de hemocitos, por lo que, como primer paso, previo a su evaluación, es necesario separar el plasma. Como se especifica en el apartado 4.1 del capítulo de “Evaluaciones nutrimentales sanguíneas” , la hemolinfa se centrifuga a 800 g (2500 revoluciones por minuto (rpm)) por 5 minutos a 4 °C, y el sobrenadante (plasma) se retira cuidadosamente, sin tocar el paquete celular, y se coloca en un tubo Eppendorf (1.5 ml). Posteriormente, al paauete celular obtenido al separar el plasma, se le agrega suavemente, solución anticoagulante (anexo 2), en el mismo volumen que la hemolinfa tomada. Se centrifuga a 800 g por 5‘a 4 °C. Se desecha sobrenadante y se adiciona amortiguador de cacodilatos en el mismo volumen de hemolinfa. Se resuspende el paquete celular varias veces (al desagregarse el paquete celular, la solución se torna turbia). Se centrifuga a 2460 g por 5’ a 4 °C. Se toma sobrenadante y se colocar en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. 5.2 Conteo de hemocitos. a) Material. o Puntas para micropipeta de 2-20 μl. o Puntas para Micropipeta de 1001000 μl. o Tubos Eppendorf de 0.5 ml o Gradilla para tubos Eppendorf. o Contenedor de desechos. o Guantes. c)

b) Reactivos. o Alsever. o Formol. o Alsever formol 10 %.

Equipo. o o o o o

Micropipeta de 2-20 μl. Micropipeta de 100-1000 μl. Vórtex Cámara Neubauer . Microscopio óptico

Para el conteo de hemocitos, se toma directamente un volumen de muestra de hemolinfa y se mezcla en tres volúmenes de solución Alsever-formol 10 % (Anexo 2). Las muestras se refrigeran en 2-8 °C, hasta su análisis. El conteo de los hemocitos se realiza en una cámara Neubauer y en microscopio óptico en objetivo 40x.

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5.3 Actividad de Fenoloxidasa (FO) El sistema fenoloxiddasa, se determina evaluando espectroscópicamente la oxidación de la L-hidroxi-fenilalanina (L-DOPA), de acuerdo a Leonard et al (1985), modificada por Hernández-López et al (1996). La evaluación de la fenoloxidasa requiere la conversión de la profenoloxidasa (proFO) a su forma activa, fenoloxidasa (FO). El sistema profenoloxidasa se encuentra en compartimentos, principalmente en las células granulares, por lo que el contenido granular de estas células, se obtiene lisándolas (degranulado de hemcitos). Sin embargo, en el caso del pulpo, se evalúa la actividad total de fenoloxidasa tanto en degranulado de hemocitos como en el plasma, y la actividad con tripsina endógena (degranulado + plasma) a) Material o Solución anticoagulante (anexo 2) o Cacodilatos (anexo 2) o Tripsina(2.5 mg mL-1, en agua estéril inyectable) o L-DOPA (3 mg mL-1, en agua estéril inyectable) o Agua estéril inyectable

o Puntas para micropipeta de 2-20 μl. o Puntas para Micropipeta de 1001000 μl. o Tubos Eppendorf de 1.5 ml o Gradilla congelada para tubos Eppendor. o Contenedor de desechos o Microplacas estériles de 96 pozos fondo plano. o Guantes

c) Equipo o o o o

b) Reactivos.

Micropipeta de 2-20 μl. Micropipeta de 100-1000 μl. Centrífuga refrigerada Espectrofotómetro de microplacas

a) Actividad de Fenoloxidasa (degranulado de hemocitos). Procedimiento: o o o o o

Dispensar 50 L plasma en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril Añadir 180 L de L-DOPA Incubar 10’ a 25 °C ± 2 °C. Leer a 490 nm en el lector de ELISA. Registrar lectura también a los 20 y 30 minutos.

Blanco: 50 ul plasma + 180 ul agua estéril Muestra 50 ul plasma + 180 ul L-DOPA

5’ Lector de ELISA 490 nm 5’ Lector de ELISA 490 nm

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b) Actividad total de Fenoloxidasa (plasma y degranulado de hemocitos) Procedimiento: Plasma: o o o o o o o

Dispensar 50 L plasma en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril Dispensar 50 L de tripsina Incubar 5’ a 25 °C + 2 °C Añadir 180 L de L-DOPA Incubar 10, Leer a 490 nm en el lector de ELISA. Registrar lectura también a los 20 y 30 minutos.

Degranulado de hemocitos: o o o o o o o

Dispensar 50 L degranulado en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril. Dispensar 50 L de tripsina. Incubar 5’ a 25 °C + 2 °C. Añadir 180 L de L-DOPA. Incubar 10, Leer a 490 nm en el lector de ELISA. Registrar lectura también a los 20 y 30 minutos.

Blanco: 5’

10’

50 ul plasma + 50 ul tripsina 490 nm.

180 ul agua estéril 5’

50 ul DH + 50 ul tripsina 490 nm.

Lector de ELISA 10’

180 ul agua estéril

Lector de ELISA

Muestra: 5’ 50 ul plasma + 50 ul tripsina ELISA 490 nm.

10’ 180 ul L-DOPA

5’ 50 ul DH + 50 ul tripsina nm.

Lector de

10’ 180 ul L-DOPA

Lector de ELISA 490

c) Actividad de Fenoloxidasa con tripsina endógena (degranulado + plasma) Procedimiento: o Dispensar 50 L plasma en microplaca de 96 pozos fondo plano estéril. o Dispensar 50 L de degranulado.

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o o o o o

Incubar 5’ a 25 °C + 2 °C. Añadir 180 L de L-DOPA. Incubar 10, Leer a 490 nm en el lector de ELISA. Registrar lectura también a los 20 y 30 minutos.

Blanco: 5’ 50 ul plasma + 50 ul DH 490 nm.

10’ 180 ul agua estéril

Lector de ELISA

Muestra: 5’ 50 ul plasma + 50 ul tripsina 490 nm.

10’ 180 ul L-DOPA

Lector de ELISA

Para las tres evaluaciones de actividad de fenoloxidasa, los valores se expresan en Densidad óptica (DO). Importante:  El L-DOPA se oxida fácilmente y se afecta con la luz, por lo que se prepara el mismo día que se va a utilizar y se guarda en una botella opaca. Se prepara con agua libre de pirógenos y con la micropipeta se mezcla 30 veces.  Durante el procedimiento debe tenerse cuidado en mantener las muestras en 2-8°C. Se mantienen estables en esa temperatura hasta 12 horas. 5.4 Estallido respiratorio - Detección del anión superóxido. El estallido respiratorio es un proceso oxidativo asociado a la fagocitosis, en el que varios radicales tóxicos de oxígeno son generados para destruir al patógeno invasor que está siendo ingerido por las células inmunitarias. La producción del anión superóxido es cuantificado por la técnica espectrofotométrica de reducción del Nitroblue Tetrazolium (NBT), de acuerdo al protocolo optimizado por HérnandezLópez (2001). El test optimizado de microplacas de NBT se basa en la cuantificación a 630 nm de formazán solubilizado por KOH/DMSO mejorando la sensibilidad y exactitud de la cuantificación. La tasa de producción del 02, se obtiene dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra estimulada, por el valor de la absorbancia de la misma muestra sin estimulación. Al momento del muestreo se requieren tubos Eppendorf conteniendo Alsever. El factor de dilución es 1:1. Por cada muestra se hacen triplicados, de tal modo que se tengan tres pozos para actividad básica y tres pozos para actividad de células estimuladas, por lo tanto, el volumen de sangre requerido para tres repeticiones de es 800 l, para dos, 1100 l, y sólo una repetición, 600 l.

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a) Material o Puntas para micropipeta de 2-20 μl. o Puntas para Micropipeta de 1001000 μl. o Tubos Eppendorf de 1.5 ml o Gradilla congelada para tubos Eppendor. o Contenedor de desechos o Microplacas estériles de 96 pozos fondo plano para cultivo celular. o Guantes. b) Reactivos o Alsever (anexo 2)

o o o o o o o

Hanks (anexo 2) Zimosán(2 mg mL-1) Nitroblue tetrazolium (NBT) Metanol al 70 % Dimetyl sulfóxido (DMSO) Hidroxido de Potasio 2 M (KOH) Agua estéril inyectable. c) Equipo

o o o o

Micropipeta de 2-20 μl. Micropipeta de 100-1000 μl. Centrífuga refrigerada Espectrofotómetro microplacas

de

Procedimiento: Se dispensan 250 l de la muestra de hemolinfa diluida en Alsever en una microplaca de 96 pozos para tejido celular estéril. A continuación se muestra una plantilla que sirve de guía para dispensar las muestras:

Nota: Si el número de muestras sobrepasa el que pueda colocarse en una microplaca, utilizar otra placa, utilizando el mismo formato con la respectiva numeración de muestra. En caso de que sean dos placas, se colocan todas las muestras en los pozos, y ambas se ponen a centrifugar al mismo tiempo. o o o o o o o o o o

Centrifugar 300 g, 10 minutos a 20 ºC Desechar plasma Adicionar 100 L de Hanks Desechar sobrenadante En BASALES, adicionar 200 L de Hanks En ACTIVADAS, adicionar 200 L de Zimosán Incubar en agitación 30 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) Adicionar 100 L de Hanks Adicionar 200 L de NBT Incubar 30 minutos en un lugar protegido de la luz

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o o o o o o o o o

Descartar sobrenadante Añadir 200 L de metanol al 70 %. Descartar sobrenadante Repetir dos veces el lavado con metanol al 70 % Descartar sobrenadante Dejar secar la microplaca a temperatura ambiente (5 min) Añadir 120 L de KOH Añadir 140 L de Dimethyl sulfóxido (DMSO) Inmediatamente leer a 630 nm en el lector de ELISA

Los valores se expresan como densidad óptica (DO) Importante: El NBT es un reactivo altamente inestable, por lo que se prepara en el proceso de análisis de la muestra y se prepara con DMSO y Hanks, los cuales se adicionan en ese orden. Volumen requerido 20 ml 10 ml 8 ml

NBT 57 mg 33 mg 24 mg

DMSO 5.7 ml 33 ml 2.4 ml

Hanks 13.3 ml 7.7 ml 5.6 ml

5.6 Hemaglutinación. Dentro de los procedimientos inmunológicos, este es un útil y práctico inidcador que se basa en la especificidad de la unión Antígeno-Anticuerpo. Esta unión pueda ser visualizable por la aglutinación. a) Material b) Reactivos. o Puntas para micropipeta de 2-20 μl. o Puntas para Micropipeta de 1001000 μl. o Tubos Eppendorf de 1.5 ml o Tubos falcón de 15 ml. o Vaso de precipitado de 10 ml o Tubo Eppendorf de 2 ml. o Gradilla congelada para tubos Eppendor. o Contenedor de desechos. o Microplacas de 96 pozos fondo U. o Plantillas para microplacas. o Guantes.

o Sangre humana tipo O+, para Solución de eritrocitos al 2 % o Hidróxido de sodio (NaOH) al 0.9 % (solución salina isotónica) o Agua estéril inyectable c) Equipo o o o o

Micropipeta de 2-20 μl. Micropipeta de 100-1000 μl. Micropipeta multicanal. Centrífuga.

a) Preparación de solución de eritrocitos al 2 %

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      

Agitar la unidad de sangre humana (tipo O+) y verter aproximadamente 1.5 ml en un contenedor de más de 2 ml (vaso de precipitado o Tubo Eppendrof de 2 ml) Tomar 1 ml de sangre y diluirlo en 10 ml de solución salina isotónica al 0.9 % (SSI) en un tubo Falcón de 15 ml. Desechar la punta de la micropipeta. Centrifugar a 800 g por 5` a 25 ºC Desechar sobrenadante sin tocar botón de eritrocitos Adicionar nuevamente 10 ml de la SSI. Repetir dos veces vez más el proceso de lavado, centrifugación y desecho. Tomar 400 l del botón de eritrocitos y diluirlo con 19 600 l de SSI para al final tener un volumen de 20 ml. (los 20 ml son suficientes para evaluar 30 muestras).

Procedimiento:  

Dispensar 50 l de SSI en cada pozo de una microplaca de 96 pozos de fondo U. Dispensar 50 l de plasma en la segunda columna de la microplaca.

Importante: Cada hilera de la microplaca corresponderá a una muestra, de tal manera que en una microplaca se pueden correr 8 muestras. Elemplo:

A B C D E F G H

1 C C C C C C C C

2 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

3 D1 D1 D1 D1 D1 D1 D1 D1

4 D2 D2 D2 D2 D2 D2 D2 D2

5 D3 D3 D3 D3 D3 D3 D3 D3

6 D4 D4 D4 D4 D4 D4 D4 D4

7 D5 D5 D5 D5 D5 D5 D5 D5

8 D6 D6 D6 D6 D6 D6 D6 D6

9 D7 D7 D7 D7 D7 D7 D7 D7

10 D8 D8 D8 D8 D8 D8 D8 D8

11 D9 D9 D9 D9 D9 D9 D9 D9

12 D10 D10 D10 D10 D10 D10 D10 D10

C= Control (50 l de SSI + 50 l de eritrocitos al 2 %). M= Muestra (de la 1 a la 8) (50 l de plasma + 50 l de SSI + 50 l de eritrocitos al 2 %). D= Diluciones.  Con ayuda de una micropipeta multicanal, se toman de 50 l de la segunda columna, se homogenizan lentamente tres veces, y en la última homogenización, se toman 50 l y se diluyen en la siguiente columna de la microplaca. Se sigue el mismo procedimiento de homogenización. Este procedimiento se repite sucesivamente hasta la 12ª columna, en la que por último que se toman 50 l y se desechan.

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Nota: Con este procedimiento se tienen diluciones seriadas de la concentración de lectinas en plasma: 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512,1024.   

Adicionar 50 l de la solución de eritrocitos al 2 % en todos los pozos. Tapar la microplaca Observar la hemaglutinación una hora después

La aglutinación se observa como una mancha difusa roja o como un punto rojo poco definido al fondo del pozo. Cuando no aglutinan aparece un punto rojo. Todos los controles no deben aparecer aglutinados. El título de hemaglutinación se reporta como el inverso de la última dilución.

6. Bioquímica de los tejidos; gónada, glándula digestiva y músculo. 6.1 Determinación de glucógeno: Modificado de Nicholas, V et al., 1955.

Material:    

Tubos Eppendorf de 1.5 ml y 2ml. Gradilla para tubos Eppendor. Microplacas para lector de ELISA. Puntas para micropipeta de 1001000 μl.  Puntas para micropipeta de 2-20 μl.  Tijera y pinza para obtener el corte del tejido.  Guantes. Reactivos:  Acido Tricloroacético al 5 %.

 Fenol al 5 %.  Acido Sulfúrico.  Alcohol etílico absoluto anhídro al 95 % (etanol).  Estándar de glucosa 1mg/ml.  Agua destilada. Equipos:        

Micropipeta de 2-20 µl. Micropipeta de 100-1000 μl. Balanza analítica. Centrífuga. Homogenizador. Estufa de incubación (37 °C). Lector de Elisa. Campana de extracción.

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Procedimiento: o o o o o o o o o o o o o o

Extraer la glándula digestiva. Hacer un corte del tejido que pese entre 0.400 g. Congelar en nitrógeno líquido y almacenarlo en -40ºC (Repco). Colocar el corte en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, al cual se añadieron previamente 200 μl de ácido tricloroacético TCA al 5 %. Homogenizar el tejido en el TCA al 5% durante un minuto. Centrifugar a 7000 rpm (centrífuga Eppendorf) durante 6 minutos. Tomar 100 μl del sobrenadante (extracto) y poner en un tubo Eppendorf de 1.5 ml que contiene 500 μl de etanol al 95 %. Homogenizar con ayuda de la micropipeta. Incubar en estufa a 37 °C por 3 horas. Centrifugar a 4550 g (7000 rpm) por 15 minutos. Desechar el sobrenadante y poner a escurrir los tubos en forma invertida sobre un papel absorbente. (como resultado se obtendrá un botón en la parte inferior de la pared del tubo Eppendorf “paquete sedimentado”). Agregar 20 μl de agua destilada hirviendo a las muestras. Agregar 200 μl de fenol al 5% a las muestras. Preparar blanco y estándar:

 Blanco: 20 μl de agua destilada hirviendo + 200 μl de fenol al 5% + 1 ml de ácido sulfúrico.  Estándar: 10 μl del estándar de glucosa (1 mg/ml) + 200 μl de fenol al 5% + 1 ml de ácido sulfúrico. o Agregar 1 ml de ácido sulfúrico a las muestras. o Agitar en vórtex. o Dispensar 200 μl por muestra en una microplaca de Lector de Elisa. Incluir blanco y estándar. Cada uno por triplicado. o Leer la absorbancia a 490 nm. Las densidades ópticas de los blancos y del estándar deben estar en un rango de: DO Blanco = 0.107 a 0.146 DO Estándar de glucosa = 0.358 a 0.380 Las densidades ópticas de las muestras deben ser < 3; de ser mayor se requiere diluir la muestra con ácido sulfúrico. Nota: Para realizar el calculo: se saca el promedio de las densidades ópticas (DO) de los triplicados de cada una las muestras, incluyendo Blanco y Estándar. Calculo: Glucógeno (mg/g) = (((PM–PBCO)/(PStd.))*(1)*(0.1/PeT)*(0.9))*FD Dónde:

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Promedio de la muestra = PM Promedio del blanco = PBCO Promedio del estándar = PStd Estándar de glucosas (Kit comercial de Bayer) 100 mg/dl = 1 mg/ml Volumen del extracto = 100 μl = 0.1 ml Peso del tejido = PeT Factor de conversión de glucosa a valores de glucógeno = 0.9 Factor de Dilución = FD (se aplica solo en caso de que se haya hecho una dilución). Preparación de los Reactivos:  Acido tricloroacético al 5 %. Ejemplo: para preparar 100 ml: 5 g de TCA en 100 ml de H2O destilada.  Fenol al 5 %. Ejemplo: para preparar 100 ml: 5 g de fenol en 100 ml de H2O destilada.  Alcohol etílico absoluto anhídro al 95 % (etanol). Ejemplo: para preparar 100 ml: 95 de etanol en 5 ml de H2O destilada. 6.2 Determinación de lípidos por el método de: Foch et al 1957. Material:               

Tubos Eppendorf de 1.5 ml. Tubo de vidrio del homogenizador. Gradilla para tubos Eppendor. Matraz Erlenmeyer de 25 ml. Frascos de pesada. Embudos de separación. Embudo de vidrio para filtrar. Matraz erlenmeyer de 500 ml para filtrar. Filtros whatman No. 40. Picetas. Tijera y pinza para obtener el corte del tejido. Guantes. Papel parafilm. Papel secante. Mascarilla.

Reactivos:  Cloroformo.  Metanol. Equipos:

     

Balanza analítica. Homogenizador. Agitador. Bomba de vacío. Desecador. Campana de extracción.

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Procedimiento: o o o o o o o o o o o o o o o o o o

Extraer el tejido. Colocar tejido en un tubo eppendorf de 1.5 ml Congelar en nitrógeno líquido y almacenarlo en -40ºC (Repco). Hacer un corte del tejido que pese entre 0.400 a 0.600 g. Coloca el tejido en el tubo de vidrio del homogenizador. Agregar al tejido con una piceta aprox. 3 ml de cloroformo/metanol. Macerar la muestra por un minuto. Verter el contenido macerado en un matraz erlenmeyer de 50 ml y agregar cloroformo/metanol hasta un volumen final aproximado de 20 ml, tapar con parafilm. Colocar en el agitador por un periodo de 15 minutos. Filtrar en la bomba de vació con un matraz kitazato y con embudo de vidrio, al cual se le colocara un filtro whatman. Pasar al embudo la solución filtrada y agregar aprox. 1/3 del volumen agua/metanol. Se vierte el embudo unas tres veces con la mano y se deja reposar aproximadamente una hora en un soporte. En este trascurso se pesan los frascos de pesada. La muestra contenida en el embudo después de ese tiempo, se separa en dos fases, la fase inferior es el extracto puro (total de lípidos) y la fase superior es el agua metanol, la cual se desecha. Después se vacía al frasco de pesada la fase separada (fase inferior). Previamente pesados los frasco. Se colocan las muestras en un desecador y se deja dentro de la campana de extracción. Una vez evaporada la muestra (aprox. 2-4 días) se pesa de nuevo el frasco de pesada y la diferencia es el total de lípidos. Posteriormente se realizan los cálculos.

Nota:  Los frascos de pesada siempre se deben tomar con guantes en todo momento (desde la pesada del frasco hasta todo el proceso de la muestra).  Desechar el agua metanol en un frasco de vidrio de desecho.  Se debe de monitorear la evaporización de las muestras. Calculo: Lípidos totales (mg/g)= (((PFcm–PFsm)*1000)/PT) Dónde: PFcm = Peso del Frasco con muestra. PFsm = Peso del frasco sin muestra. PT = Peso del Tejido.

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Preparación de reactivos: Agua-Metanol (3:1). Ejemplo: si se requiere preparar 1 litro de esta solución tomar: 750 ml de agua destilada + 250 ml de metanol = 1 litro agua-metanol (3:1) Cloroformo-metanol (2:1). Ejemplo: si se requiere preparar 1 litro de esta solución tomar: 666.6 ml de cloroformo + 333.4 ml de metanol = 1 litro cloroformo-metanol (2:1).

7. Determinación de contenido energético; mediante la bomba calorimétrica (Parr instrumens) El método de calorimetría se basa en la diferencia de temperatura antes y después de realizar la combustión. En la bomba calorimétrica (una atmósfera comprimida de CO2), se realiza la combustión completa de compuestos hidrocarbonatos los cuales se oxidan a CO2 y H2O. Los compuestos azufrados se transforman en óxidos gaseosos y son absorbidos en agua que se encuentran en la base de la bomba, junto con elementos inorgánicos como arsénico, boro y halógenos.

Material:           

Termómetro de alta sensibilidad. Alambre de ignición. Cápsula de combustión. Soporte para bureta. Vaso de precipitado de plástico de 2litros. Vaso de precipitado de 40ml con agua destilada. 2 Pinzas. Tijeras. Espátula. Pipeta de 1ml. Bureta.

 

Cronómetro. Papel absorbente o toalla.

Reactivos:  Naranja de metilo 0.1%.  NaOH 0.1 N.  Ácido nítrico o agua acida. Equipos:  Tanque de oxígeno.  Bomba calorimétrica.

Preparación de la muestra: La cantidad de la muestra utilizada no deberá ser mayor a un 10 g y deberá estar seca, por tal motivo el tamaño de la muestra no debe desprender más de 7.000 kcal al quemarse. Se pulveriza la muestra a evaluar en una capsula de porcelana, el polvo se coloca en la capsula y se compacta, posteriormente se pesa la pastilla.

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Procedimiento: NOTA: en todo el procedimiento se requiere utilizar guantes y pinzas.            

   

  

Llenar el vaso de precipitado de plástico con dos litros de agua destilada (esta cantidad debe de ser precisa. Temperar: el agua de la cubeta debe estar cuando menos 2°C por debajo de la temperatura ambiente y 2 °C por arriba de la temperatura mínima que marca el termómetro (18°C). (dejar unos minutos a temperatura ambiente) Cortar 10 cm del alambre de ignición. Anotar el peso de la cápsula metálica, el alambre de ignición y la muestra (pastilla). Agregar 1 ml de agua destilada al fondo de la bomba calorimétrica (Esta agua permitirá cuantificar la cantidad de ácido nítrico formado por la reacción). Sujetar el alambre al soporte de la bomba. Colocar la cápsula metálica en el soporte correspondiente de la bomba. Doblar el alambre a modo de columpio y colocar la pastilla, de tal forma que el alambre no toque la cápsula. Cerrar la bomba despacio y con precaución, dado que la pastilla se puede caer. Colocar el contenedor de acero dentro del calorímetro y agregarle los 2 litros de agua destilada previamente temperada, corroborar que la temperatura no sea mayor de 20 ºC. Conectar la manguera del tanque de oxígeno a la válvula de entrada de la bomba. Abrir la llave del regulador muy despacio para llenar la bomba, dejar salir el aire durante 30 segundos y cerrar la válvula de escape. En estas condiciones dejar que la bomba se llene de oxígeno lentamente hasta alcanzar 30 atmósferas de presión y cerrar la llave del regulador, importante: liberar el aire de la manguera de alimentación. Introducir con mucho cuidado y con ayuda de las pinzas la bomba al recipiente de agua, colocar los electrodos y cerrar el calorímetro con mucho cuidado. La polela deberá quedar hacia atrás. Colocar el termómetro hacia delante y colocar la banda del motor de la polea. Encender el motor durante 4 minutos tiempo aproximado de la estabilidad de la temperatura del agua de la cubeta. Una vez estabilizada la temperatura se registra esa temperatura la cual será la inicial y se oprime el botón de ignición en la fuente de poder debe prender el foco rojo por un segundo, a partir de ese momento se registrar las lecturas a intervalos de un minuto, hasta que la temperatura se vuelva constante aproximadamente en 7 minutos. Apagar el motor. Abrir el calorímetro, quitar los electrodos y sacar la bomba con mucho cuidado, secarla con el papel absorbente o una toalla limpia y dejar salir el CO2 abriendo lentamente la válvula de escape. Abrir la bomba y colocar en el soporte. Retirar el alambre quemado, la capsula y pesarlos. 30

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  



Recuperar el líquido de la bomba en un vaso de precipitado, agregarle una gota de naranja de metilo. Titular con hidróxido de sodio (NaOH 0.1 N) lentamente y en agitación constante hasta que cambie su coloración de naranja a amarillo. Concluidas todas las determinaciones se debe lavar la bomba y el recipiente de acero inoxidable con agua destilada y secar. Las cápsulas metálicas se lavan con el ácido nítrico se enjuagan con agua destilada y se ponen a secar en la estufa. El equipo deberá ser guardado en el lugar destinado para tal efecto. Notas importantes: o Si no sube la temperatura durante 3 minutos después de la ignición puede ser por varias razones: o Se cayó la pastilla y solo se quemo el alambre de ignición. o No hubo flujo de energía, la fuente o electrodo podrían estar dañados. o El recambio se hace cuando ya está muy sucia el agua, en caso de evaluar pocas muestras se recuperara el agua según su estado. o Se debe de mantener siempre los 2 L de agua destilada en el contenedor de acero. o En caso de no haberse quemado completamente la pastilla a notar los residuos que quedaron en la capsula. Precauciones:         

Nunca ponga en la bomba una muestra que libere más de 8000 calorías. La presión de O2 nunca deberá ser superior a 40 atmósferas, ya que es la máxima presión que soporta la bomba, por tal motivo se debe de tener precaución al momento del llenado. Nunca realice la ignición cuando haya fugas de O2 por pequeñas que sean. Cuando libere el CO2 debe de permanecer separado de la bomba ya que podría marearlo. No ponga la cabeza o las manos cerca de la bomba durante la ignición. Deben pasar 20 segundos para acercarse. Se deberá evitar el uso de las muestras con alto contenido de azufre o de cloro pues pueden dañar la bomba. Esta bomba no resiste cloro, fluor o bromo en presencia de humedad. No utilice aceite en ningún sistema de oxígeno No olvide cerrar la llave del tanque de oxígeno.

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Cálculos: Hg = ((ΔT°C * W) – e1 – e2-e3)/m) Dónde: Hg = Es la energía bruta de la muestra (cal/g). ΔT°C es la diferencia de temperatura entre el valor de la T°Co y T°Cx W = Constante de estandarización (2379.99) este valor será utilizado en todas las evaluaciones dentro de la UMDI. e1 = es el valor de corrección por el gasto de NaOH. e2 es el valor de corrección de combustión del alambre (peso del alambre inicial – alambre final x 1400). e3 m = es el peso de la pastilla.

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8.- Bibliografia. Auffret M, Oubella R. 1994. Cytometric parameters of bivalve molluscs: effects of environmental factors. In: Stolen JS, Fletcher TC, editors. Modulatorsof fish immune responses. Fair Haven, New Jersey: SOS Publications; 1994. p. 23-32. Carrol, R. W. Longley, and Joseph, H.R. 1955. The determination of glycogen in liver and muscle by use of an throne reagent. Cruz, H. 2009. Variación estacional de la condición fisiológica de la población silvestre del pulpo rojo Octopus maya (Voss y Solís-Ramiréz 1966) en la localidad de Sisal, Yucatan-México. Tesis de licenciatura. p. 1-64. Clarke A, Rodhouse PG, Gore DJ. 1994. Biochemical composition in relation to the energetic of growth and sexual maturation in the ommastrephid squid Illex argentinus. Philos Trans R Soc Lond B 344:201–212. De Moreno, J.E.A., Moreno, V.J., Ricci, L., Roldan, M., Gerpe, M. 1997. Variations in the biochemical composition of the squid Illex argentinus from the South Atlantic Ocean. Comparative Biochemistry and Physiology Part B 119 (1998) 631–637. Ernst F. J. van Bruggen 1980. Hemocyanin: the mystery of blue blood. Fabrice Mouche , Nicolas Boisset, Josette Lamy, Franck Zal, and Jean N. Lamy 1999. Structural Comparison of Cephalopod Hemocyanins: Phylogenetic Significance. Journal of Structural Biology 127, 199–212. Ferraris, R.P. Parado-Estepa, J. M. Ladia. y E.G. de Jesús. 1998. Effect of saninity on the osmotic, chloride, total protein and calcium concentrations in the hemolymph of the prawn Penaeus monodon (Fabricius). comp. bioch. Physiol. 85A(4): 701-708. Gaxiola, G, Sánchez A, Maldonado T y Rosas C. 2007. The effects of fish hydrolysate (CPSP) level on Octopus maya (Voss and Solis) diet: Digestive enzyme activity, blood metabolites, and energy balance. Aquaculture 273 (2007) 641–655. Hall, M.R., van Ham, E.H., 1998. The effects of different types of stress on blood glucose in the giant tiger prawn Penaeus monodon. J. World Aquacult. Soc. 29, 290–299. Heras H, y Pollero, R. 1990. Occurrence of plasma lipoproteins in octopods. Partialcharacterization and interorgan transport of lipids. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 1990, Vol. 140, pp. 29-38. Hérnandez-López, J. 2001. Diseño de técnicas para la cuantificación de moléculas plasmáticas de camarón. Tesis para obtener el Título de Doctorado en Ciencias.Hill, R.W 1997. Energy Metabolism y Thermal Relationship. P 7-57. En: Comparative Physiology of Animals: An Environmental Approach. Harper & Row, publishers. New York, USA. 656 pp. Iglesias,J., Otero,J.J., Moxica,C., Fuentes,L., Sánchez,F.J., 2004. The completed life cycle of the octopus (Octopusvulgaris, Cuvier) under culture conditions: paralarval rearing using Artemia and zoeae, and first data on juvenile growth up to 8 months of age . Aquaculture International 12, 481-487. Iglesias,J., Sánchez,F.J., Otero,J.J., Moxica,C., 2000. Culture of octopus (Octopus vulgaris, Cuvier): present knowledge, problems and perspectives. Recent

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advances in Mediterranean Marine Aquaculture Finifish Species Diversification. Cahiers Options Méditerranéenes 47, 313-322. Marianne E. Cuff, Karen I. Miller, Kensal E. van Holde and Wayne A. endrickson 1998. Crystal Structure of a Functional Unit from Octopus Hemocyanin. J. Mol. Biol. (1998) 278, 855-870. Oubella R, Maes P, Paillard C, Auffret M. 1993. Experimentally induced variation in hemocyte density for Ruditapes philippinarum and R. decussates (Mollusca, Bivalvia). Dis Aquat Org 1993;15:193e7. Otero, J., Gónzalez, A.f., Sieiro, P.M. Guerra., A. 2007. Reproductive cycle and energy allocation of Octopus vulgaris in Galician waters, NE Atlantic. Fisheries Research 85:122–129. Ozogul Yesim, Duysak, Onder, Fatih, Ozogul, Serhat Ali O zku tuk y Tureli Canan. 2008. Seasonal effects in the nutritional quality of the body structural tissue of cephalopods. Food Chemistry 108 (2008) 847–852 Pollero R.J. y Iribarne O. 1987. Biochemical changes during the reproductive cycle of the small Patagonian octopus, Octopus tehuelchus, D’Orb. Comp. Biochem. Physiol. 90B, 317-320 Rainer, J y M. Brouwer. 1993. Hemocyanin synthesis in the blue crab Callinectes sapidus. Com. Biochem. Physiol. 104B (1): 69-73. Racotta, I.S., Palacios, E., 1998. Hemolymph metabolic variables in response to experimental manipulation stress and serotonin injection in P. Õannamei. J. World Aquacult. Soc. 29, 351–356. Rosas, C., Cuzon, G., Pascual, C., Gaxiola, G., López, N., Maldonado, T., Domingues, P., 2007. Energy balance of Octopus maya fed crab and artificial diet. Mar. Biol. 152, 371–378. Rosas, C., Cuzon, G. Gaxiola, G., LepPriol, C., Pascual, C., Rossignyol, J., Contreras, F., Sánchez, A., and Van Wormhoudt, A. 2001a. Metabolism and growth of juveniles od Litopenaeus vannamei: effect of salinity and dietary carbohydrate levels. J. Exp. Marine Biol. Ecol. 259: 1-22. Rosas, C., Cuzon, G., Taboada, C., Pascual, G. Gaxiola A., and Van Wormhoudt, A. 2001b. Effect of dietary protein and energy levels (P/E) on growth, oxygen consumption, hemolymph and digestive gland carbohydrates, nitrogen excretion and osmotic pressure of Litopenaeus vannamei and L. setiferus juveniles (Crustacea, decapoda: Penaeidae). Aquac. Res. 32: 1-20. Rosa, R., Nunes, M. L., & Sousa Reis, C. 2002. Seasonal changes in the biochemical composition of Octopus vulgaris, Cuvier, 1797, from three areas of the Portuguese coast. Bulletin of Marine Science, 71, 739–751. Rosa, R., Costa, P., Nunes., M. L. 2004. Effect of sexual maturation on the tissue biochemical composition of Octopus vulgaris and Octopus defilippi (Mollusca: Cephalopoda). Mar Biol. 145, 563–574. Rosa, R., Pereira, J., y Nunes, M. L. 2005a. Biochemical composition of cephalopods with different life strategies, with special reference to a giant squid, Architeuthis sp. Marine Biology, 146, 739–751. Rosa, R., Costa P.R., Bandarra, N., Nunes M.L. 2005b. Changes in Tissue Biochemical Composition and Energy Reserves Associated With Sexual Maturation in the Ommastrephid Squids Illex coindetii and Todaropsis eblanae. Biol. Bull. 208: 100–113. 34

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Sánchez A., Pascual C., Sánchez A., Vargas-Albores F., Le Moullac G., and Rosas C. 2001. Hemolymph metabolic variables and immune response in Litopenaeus setiferus adult males: the effect of acclimation. Aquaculture 198: 13-28. Sánchez, A., Pascual, C., Sanchez, A., Vargas-Albores, F., LeMoullac, G., and Rosas, C. 2002. Acclimation of adult males of Litopenaeus setiferus exposed at 27°C and 31°C: Bioenergetic balance. In Escobar Briones E. S.K. Malham, C.L. Coulson, N.W. Runham 1998. Effects of repeated sampling on the haemocytes and haemolymph of Eledone cirrhosa (Lam.) Comparative Biochemistry and Physiology Part A 121 (1998) 431–440. SEMARNAP. 1999. Anuario Estadístico de Pesca 1998. Secretaria del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, Gobierno Federal. México. Van Holde, K., K., Miller, y H. Decker (2001). Hemocyanins and invertebrate Evolution. J. Biol. Chem. 276 (19): 15563-15566. Vinagre, A.S., Da Silva, R.S., 1992. Effects of starvation on the carbohydrate and lipid metabolism in crabs previously maintaned on a high protein or carbohydrate-rich diet. Comp. Biochem. Physiol. 102A, 579– 583. Webster, S.G. 1996. Measuarement od crustacean hyperglycaemic hormone levens in the edible crab Cancer pagurus during emersion stress. J. Exp. Biol. 199: 1579-1585.

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9. Anexos. Anexo1. Preparación de curvas patrón. Para preparar las curvas patrón se requiere de estándares con concentraciones conocidas de cada metabolito. En el caso de triglicéridos y glucosa los estándares vienen en el kit respectivo. Con respecto a las proteínas, lactato y colesterol, se preparan las concentraciones ya que estas no vienen en el kit. Colesterol. Se diluyen 2 mg de colesterol en 1 ml de alcohol etílico absoluto, y la concentración de la solución madre será de 2 mg/ml. Se toman 500 µl y se afora a 2000 µl alcohol etílico absoluto, quedando así una concentración de 0.5 mg/ml. Lactato. Se toman 1000 µl del estándar del kit (0.4 mg/mL Trinity 825-10) y se afora a 2000 µl de agua libre de pirógenos, quedando una concentración de 0.2 mg/ml. Una vez preparadas las concentraciones de cada estándar, se hacen las diluciones respectivas de las concentraciones que integran la curva patrón de cada metabolito, como ya se mencionó. En el caso de triglicerdidos y glucosa, se toma los volúmenes para preparar la curva patrón directos del Kit, ya que estos ya vienen preparados a cierta concentración. A continuación se presenta una tabla con las concentraciones de la curva de cada metabolito. Diluciones de la curva patrón. Metabolitos y concentración de la solución estándar

Concentraciones de sol. Estándar en curva patrón mg/ml

Volumen de a solución estándar µl

Volumen del agua libre de pirógenos µl

Volumen fina µl

0.05

25

475

500

0.1

50

450

500

Glucosa

0.2

100

400

500

1 mg/ml

0.3

150

350

500

0.4

200

300

500

0.5

250

250

500

36

Manual de métodos para la evaluación del estado fisiológico del pulpo rojo Octopus maya 0.01

12.5

487.5

500

0.025

31.25

468.75

500

Lactato

0.05

62.5

437.5

500

0.4 mg/ml

0.1

125

375

500

0.15

187.5

312.5

500

0.2

250

250

500

0.05

12.5

487.5

500

0.1

25

475

500

Acilglicéridos

0.2

50

450

500

2 mg/ml

0.3

75

425

500

0.4

100

400

500

0.5

125

375

500

Colesterol

0.05

12.5

487.5

500

2 mg/ml

0.1

25

475

500

Importante: la soluciones se llevan a cabo con etanol

0.2

50

450

500

0.3

75

425

500

0.4

100

400

500

0.5

125

375

500

0.05

12.5

487.5

500

Proteínas

0.1

25

475

500

2 mg/ml (albúmina bovina)

0.2

50

450

500

0.3

75

425

500

0.4

100

400

500

0.5

125

375

500

Cada concentración se prepara en tubo Eppendorf (500 µl), y se agita en vórtex. Todas las curvas deben mantenerse en frío (2-8 °C).

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Anexo 2. Preparación de soluciones fisiológicas Anticoagulante: Solución isotónica ompuesto Cloruro de Sodio (NaCl) Cloruro de Potasio (KCl) Hepes EDTA.Na2 pH 7.3 ( pH inicial 6.98 + 0.13) mOsm 997 + 28.41 mOsm/Kg.

Peso Molecular 58.44

mM

gramos para 500 ml

450

13.145

74.55

10

0.37275

260.3 372.24

10 10

1.3015 1.861

Después de pesar cada uno de los reactivos en papel parafilm en las cantidades calculadas, se incorporan, uno por uno, en 400 ml de agua estéril inyectable en agitación. Este procedimiento asegura la completa disolución de los reactivos. Al vaciar cada uno de los reactivos, es importante enjuagar el parafilm en el que se pesó el reactivo con el fin de que no queden restos. Una vez diluidos los reactivos, se ajusta el pH 0.1-0.3 unidades por debajo de 7.3, es decir, 6.9-7.2, porque el pH aumenta una vez que el reactivo se filtra. Para ajustar el pH, si usa Ácido Clorhídrico (HCl) 1 M, para disminuir el pH, oHidróxido de Sodio (NaOH) 1 M para aumentarlo. Una vez ajustado el pH, se vacía el contenido en un matraz aforado de 500 ml, donde se completan los 500 ml con el agua estéril inyectable. La solución se filtra con una bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma Sigma E9029). Se evalúa la presión osmótica en el microosmómetro. Se etiqueta el frasco con el nombre de la solución, fecha, nombre de quien lo preparó, pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera a 2-8 ºC. Importante: Todo el material de plástico y cristalería debe estar estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Alsever Compuesto Citrato de Sodio Cloruro de Sodio (NaCl) Glucosa EDTA.Na2 pH 7.0 (pH inicial 6.26 + 0.33) mOsm 987 + 31.58 mOsm/Kg.

Peso Molecular

mM

294.1 58.4

30 338

gramos para 500 ml 4.41 9.86

180.2 372.2

115 10

10.36 1.86

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Después de pesar cada uno de los reactivos en papel parafilm en las cantidades calculadas, se incorporan, uno por uno, en 400 ml de agua estéril inyectable en agitación. Este procedimiento asegura la completa disolución de los reactivos. Al vaciar cada uno de los reactivos, es importante enjuagar el parafilm en el que se pesó el reactivo con el fin de que no queden restos. Una vez diluidos los reactivos, se ajusta el pH 0.1-0.3 unidades por debajo de 7.3, es decir, 6.9-7.2, porque el pH aumenta una vez que el reactivo se filtra. Para ajustar el pH, si usa Ácido Clorhídrico (HCl) 1 M, para disminuir el pH, oHidróxido de Sodio (NaOH) 1 M para aumentarlo. Una vez ajustado el pH, se vacía el contenido en un matraz aforado de 500 ml, donde se completan los 500 ml con el agua estéril inyectable. La solución se filtra con una bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Se evalúa la presión osmótica en el microosmómetro. Se etiqueta el frasco con el nombre de la solución, fecha, nombre de quien lo preparó, pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera a 2-8 ºC. Importante: Todo el material de plástico y cristalería debe estar estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean). Alsever - Formol 10 % Dado que el formol se evapora, se prepara sólo la cantidad de reactivo requerido. Por ejemplo, si se requieren 10 ml, entonces a 9 ml de Alsever se adiciona 1 ml de formol. Buffer Cacodilatos Compuesto Ácido cacodílico * Cloruro de Calcio (CaCl2) Dimethylarsinic acid C2H7AsO2 pH 7.0 (pH inicial 3.96 + 0.47) mOsm 112.50 + 24.33 mOsm/Kg.

Peso Molecular

mM

138 110.99

10 10

gramos para 500 ml 0.69 0.55

Después de pesar cada uno de los reactivos en papel parafilm en las cantidades calculadas, se incorporan, uno por uno, en 400 ml de agua estéril inyectable en agitación. Este procedimiento asegura la completa disolución de los reactivos. Al vaciar cada uno de los reactivos, es importante enjuagar el parafilm en el que se pesó el reactivo con el fin de que no queden restos. Una vez diluidos los reactivos, se ajusta el pH 0.1-0.3 unidades por debajo de 7.3, es decir, 6.9-7.2, porque el pH aumenta una vez que el reactivo se filtra. Para ajustar el pH, si usa Ácido Clorhídrico (HCl) 1 M, para disminuir el pH, o Hidróxido de Sodio (NaOH) 1 M para aumentarlo.

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Manual de métodos para la evaluación del estado fisiológico del pulpo rojo Octopus maya

Una vez ajustado el pH, se vacía el contenido en un matraz aforado de 500 ml, donde se completan los 500 ml con el agua estéril inyectable. La solución se filtra con una bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Se evalúa la presión osmótica en el microosmómetro. Se etiqueta el frasco con el nombre de la solución, fecha, nombre de quien lo preparó, pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera a 2-8 ºC. Importante: Todo el material de plástico y cristalería debe estar estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Solución Hanks pH 7.0 (pH Inicial 7.63 + 0.32) mOsm 386.86 + 25.86 mOsm/Kg La Solución Hanks (HBSS, Sales balanceadas de Hanks) que se utiliza (Sigma H1387) está en presentación leofilizada y lista para preparar 1000 ml. Es una solución salina que mantiene el pH y el balance osmótico en el medio y provee a las células el agua y los iones inorgánicos esenciales. La solución de una sal balanceada está influenciada por el tipo de célula, el tipo de cultivo (monoclonal, suspensión, clonal), y el grado de definición química. En 900 ml de agua estéril, con temperatura entre 15 y 20 ºC, se adiciona, poco a poco, el polvo contenido en el frasco. Después de vaciar el reactivo, es importante enjuagar el frasco con agua libre de pirógenos, con el fin de que no queden restos. Posteriormente, agregar el bicarbonato de sodio. Ambos reactivos se adicionan mientras el agua está en constante agitación. Mantener hasta su completa disolución. Una vez diluidos los reactivos, se ajusta el pH 0.1-0.3 unidades por debajo de 7.0, es decir, 6.7-6.9, porque quizá el pH aumente una vez que el reactivo se filtra. Al ajustar el pH, si los valores son mayores a 7.0 debe adicionarse gota a gota Ácido Clorhídrico 1N (HCl); si por el contrario, está por abajo, se adicionará, también gota a gota, Hidróxido de Sodio 1 N (NaOH). Ajustado el pH, se vacía el contenido en un matraz aforado de 1000 ml, donde se completan los 1000 ml con el agua estéril. La solución se filtra con una bomba de vacío a través de un filtro de celulosa de 0.2 m nuevo y se vacía en un frasco estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). Se evalúa la osmolaridad en el microosmómetro. Se etiqueta el frasco con el nombre de la solución, fecha, y nombre de quien lo preparó, pH y osmolaridad (mOsm). Se refrigera (2-8 ºC). Importante: Todo el material de plástico y cristalería debe estar estéril o lavado con un jabón neutro especial para inmunología (ETOXA-Clean, Sigma E9029). 40

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Anexo3. Valores de referencia de las evaluaciones bioquímica de 68 hembras y organismos de Octopus maya.

Lípidos totales

Glucógeno

Gónada

Media

Máximo

Mínimo

H M Glándula H M Músculo H M Gónada H M

29.036 22.960

30.172 23.782

27.900 22.139

40.577 41.457

41.888 42.508

39.267 40.406

7.657 6.303

8.012 6.564

7.302 6.042

1.726 0.590

1.844 0.633

1.608 0.547

4.063 41.457

4.243 42.508

3.884 40.406

0.287 0.250

0.302 0.260

0.272 0.240

4539.37 4466.78

4576.86 4502.84

4501.88 4430.73

Glándula H M Músculo H M Valor calórico

Músculo H M

Hembras (H), Machos (M).

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