Makalah Perancangan Primer.docx

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “PERANCANGAN PRIMER”

Dosen Jaga : Bawon Triatmoko, S. Farm., M. Sc., Apt

Kelompok : J7 Nama : Heni Ratna Dila

(162210101050)

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2018 i

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya haturkan atas kehadirat ALLAH SWT yang telah memberikan Rahmat dan karunia-Nya sehingga kami dapat mengerjakan lapora praktikum ini tepat pada waktunya yang berjudul “Laporan Perancangan Primer ”. Saya menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari harapan, oleh karena itu saran dan kritik yang konstruktif dari berbagai pihak sangat saya harapkan untuk menghasilkan laporan yang lebih baik untuk masa mendatang. Akhir kata, saya sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah berperan serta dalam penyusunan laporan ini. Semoga laporan ini bermanfaat untuk semua. Jember, 23 Mei 2018

Penyusun

ii

DAFTAR ISI KATA PENGANTAR ................................................................................................................ ii BAB 1 ......................................................................................................................................... 1 PENDAHULUAN ...................................................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................................. 1 1.3 Tujuan ............................................................................................................................... 2 BAB II ........................................................................................................................................ 3 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................................. 3 2.1 PCR ................................................................................................................................... 3 2.2 Primer DNA ...................................................................................................................... 4 BAB III ....................................................................................................................................... 6 METODE ................................................................................................................................... 6 3.1 Alat dan Bahan .................................................................................................................. 6 3.2

Prosedur Kerja ............................................................................................................. 6

BAB IV ....................................................................................................................................... 8 HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................................................. 8 4.1 Hasil Primer ...................................................................................................................... 8 4.2 Pembahasan .................................................................................................................... 11 4.3 Hasil data pengamatan .................................................................................................... 13 BAB V ...................................................................................................................................... 15 PENUTUP ................................................................................................................................ 15 5.1 Kesimpulan ..................................................................................................................... 15 5.2 Saran ............................................................................................................................... 15 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................... 16 LAMPIRAN ............................................................................................................................. 17

iii

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebgainya. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik biologi molekuler yang memiliki tingkat sensitivitas dan spesifitas yang tinggi. Dengan penggunaan teknik PCR maka keberadaan penyakit pada organisme dapat diketahui sedini mungkin, sehingga dapat dilakukan langkah pengendalian penyakit atau tindakan pencegahan. Pada proses PCR terdapat beberapa siklus yaitu denaturasi, annealing, dan ekstensi. Denaturasi merupakan proses pemanasan dengan menggunakan suhu 90-95˚C dengan tujuan untuk memisahkan untai ganda pada DNA sehingga menjadi dua untai tunggal yang akan menjadi tempat menempelnya primer. Selanjutnya tahap annealing yaitu proses penurunan suhu sampai mencapai 45-50˚C, penurunan suhu ini dilakukan agar primer berpasangan dengan sekuen kompleknya atau terjadinya penempelan antara oligonukleotida dengan utas tunggal DNA. Suatu kenerhasilan reaksi PCR dipengaruhi oleh desain primer yang digunakan, desain primer dapat dibuat dengan menggunakan beberapa aplikasi, dalam pembuatan desain primer cukup suli dilakukan sehingga dibutuhkan ketrampilan dalam membuatnya. Perancangan primer dapat dilakukan secara manual, menggunakan software komputer tertentu, maupun dilakukan secara online menggunakan fasilitas yang ada di website. Saat ini beberapa program perencangan primer telah dikembangkan baik untuk tujuan komersial maupun edukatif, salaah satunya program DNAStar.

1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana cara melakukan perancangan primer secara online? 1

2. Bagaimana cara menetukan spesifitas primer yang dibuat?

1.3 Tujuan 1. Untuk mengetahui dan melakukan perancangan primer secara online. 2. Untuk menentukan spesifitas primer yang dibuat.

2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PCR PCR ( Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleutida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) untai ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extention) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3 ‘. Hanya saja pada teknik PCR tidakn menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligpnukleutida, deoksiribonukleutida (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang bebrapa puluh siklus sampai diperoleh juamlah sekuens DNA yang diinginkan. Tahapan dari proses PCR meliputi : 1.

Denaturasi

Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat. 2.

Penempelan (Annealing)

Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 550C selama 30-60 detik. 3.

Pemanjangan (Ektension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida. 3

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial. Primer yang biasa digunakan adalah primer yang spesifik dan primer acak (tersusun atas nukleotida sembarang yang belum diketahui denjgan jelas susunan nukleotidanya). Keberhasilan suatu proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan bedasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. 2.2 Primer DNA Primer DNA adalah sekuens DNA yang komplemen terhadap sekuens yang akan diamplifikasi, terutama dalam reaksi berantai polimerase (PCR). Batasannya, primer ini akan menempel pada kedua ujung sekuens DNA yang ingin diamplifikasi dengan arah yang berkebalikan (utas sense dan antisense). Dalam suatu reaksi berantai polimerase digunakan dua primer, yaitu primer maju dan primer mundur. Kedua primer ini harus ada dalam reaksi polimerasi agar amplifikasi DNA terjadi. Molekul primer dapat berupa molekul DNA, RNA, atau bahkan protein spesifik. Biasanya, primer yang digunakan pada PCR adalah molekul DNA. Pada akhir proses PCR akan terdapat sejumlah besar fragmen-fragmen pendek DNA hasil amplifikasi. Setelah dilakukan amplifikasi, terdapat berbagai cara untuk melihat hasilnya. Salah satu diantaranya adalah elektroforesis gel. -

Primer Maju dan Primer Mundur Primer maju (forward) dan primer mundur (reverse) bekerja berlawanan arah.

-

Visualisasi Visualisasi dengan elektroforesis gel dapat dilakukan setelah proses amplifikasi terjadi untuk melihat hasil DNA yang terbentuk. Apabila terdapat delesi untuk suatu lokasi templat, akan terjadi polimorfisme. Dengan elektroforesis gel, akan terlihat pita yang terputus-putus apabila terdapat polimorfisme. 4

5

BAB III

METODE

3.1 Alat dan Bahan Seperangkat lengkap komputer dengan assesorisnya Koneksi internet

3.2 Prosedur Kerja 1. Mencari CDS gen target dari situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Dibuka laman tersebut Ketikkan gen yang dicari sekuens-nya pada kolom search. pilih nucleotida pada pilihan alldatabes. Tekan tombol search Dipilih complete genome

Diklik Fasta, akan muncul tampilannya 2. Mencari primer Dibuka kembali situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov di tab yang berbeda Diklik DNA & RNA

Diklik Primer-BLAST salin semua CDS gen yang dimaksud pada kolom enter accesoris gi or FASTA sequence. pilih genome (all organism) sebagai pilihan database, lalu klik get primer tunggu hingga hasil get primer keluar

6

3. Menentukan spesifisitas primer

Dibuka kembali situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov di tab yang berbeda

Dipilih BLAST

Dipilih nucleotide blast

Dimasukkan primer yang ingin dicetak pada kolom enter accesoris number (s), gis(s), or FASTA sequence. pilih nucleotide pada pilihan database. lalu klik BLAST

Ditunggu beberapa saat, akan diperoleh prosentase kesamaannya

7

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Primer a. Tampilan hasil get primer

8

HASIL BLAST PRIMER 1 a. Forward primer 1

b. Reverse primer 1

HASIL BLAST PRIMER 2 a. Forward primer 2

9

b. Reverse Primer 2

HASIL BLAST PRIMER 3 a. Forward Primer 3

10

c. Reserve Primer 3

4.2 Pembahasan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal untuk urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vitro yang bersifat konservatif. Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction) merupakan suatu

teknik

atau

metode

perbanyakan

(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa

menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer 11

(annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. PCR memungkinkan adanya perbanyaka DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reakasi, tanpa perlu memasukkanya ke dalam sel (in vitro). Pada proses mengandung DNA untai yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase komplemen dengan urutan nukleotida template. DNA polimerase mengkatalisis dNTP yang ditambahkan. Sehingga prosesdengan arah 5’ ke 3’ dan disebut reaksi polimerisasi. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan permanjangan (extension) polimerisasi oleh DNA polimerase. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Persyaratan primer yang baik adalah sebagai berikut a. Panjang primer 18-24 nukleotida. Jika kurang dari 15 akan menurunkan spesifikasi hibridisasi dengan DNA target, jika lebih dari 40 menurunkan aktivitas DNA polymerase b. Suhu leleh (Tm) primer 50-60̊ C dengan selidih Tm anta primer kurang dari 5̊ C c. Urutan nukleotida yang sama tidak boleh lebih dari 4 karena akan menurunkan spesifitas d. Kandungan GC sebaiknya 40-60% e. Ujung 3’ kedua primer tidak saling berkomplemen

12

Pemilihan primer

Primer yang saya pilih yaitu primer pair 1,2 dan 3, karena primer pada nomor tersebut telah memenuhi persyaratan atau kriteria primer yang baik, meliputi: memiliki panjang primer 18-24 nukleotida, suhu leleh (Tm) primer 50-60̊ C dengan selisih Tm antara primer kurang dari 5̊C, memiliki urutan nukleotida yang sama tidak lebih dari 4, selain itu juga memiliki kandungan GC 40-60%, sehigga dapat disimpulkan bahwa primer pada nomor tersebut merupakan primer yang baik. 4.3 Hasil data pengamatan No

Primer

F 1 R

F 2 R

3

F

TGCTCTGGAACAAGA AGCGG TCTATGCGGTCTCTC CTGGG TGCTCTGGAACAAGA AGCGG AAGCTCTATGAGCGG TGGAG CTAAAGAGTCGCCGC AGACA

Panjang Panjang

Hasil

GC

Tm

Dimer

55%

60.60

-

100%

20

60%

60.47

-

100%

20

55%

60.60

-

100%

55%

59.25

-

100%

55%

60.11

-

100%

Primer

Produk

20

Blast

218

289 20

20

495

13

R

GTACCCTGCGTCTCT GACCA

20

60%

61.33

-

100%

Dari data hasil diatas dapat diketahui bahwa: 

Fordward primer dan Reserve primer secara keseluruhan mengandung GC pada rentang 50-60%



Forward primer dan Reserve primer secara keseluruhan memiliki panjang primer 20 nukleotida (sesuai dengan persyaratan panjang primer yaitu 18-24 nukleotida).



Suhu leleh (Tm) pada forward maupun reserve primer terdapat kesesuaiaan dengan persyaratan yaitu 50-60oC.



Forward primer dan protein primer secara keseluruhan memiliki hasil 100% sehingga dapat dikatakan baik. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa para primer pair nomor 1,2 dan 3

merupakan primer dari protein NFAT-2 yang dapat dikategorikan baik, karena telah memenuhi persyaratan pemilihan primer yang baik serta memiliki persentase kesamaan 100%.

14

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (polymerase chain reaction)

merupakan

suatu

teknik

atau

metode

perbanyakan

(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Dari tabel hasil pengamatan didapatkan Forward primer dan Reserve primer secara keseluruhan mengandung GC pada rentang 50-60%. Forward primer dan Reverse secara keseluruhan memiliki panjang primer 20 nukleotida. (sesuai dengan persyaratan primer yaitu 18-24 nukleotida). Suhu leleh (Tm) pada fordward primer dan Reserve primer terdapat kesesuaian dengan persyaratan yang ditentukan antara 50-60˚ C. Forward primer dan Reserve primer secara keseluruhan memiliki hasil blast 100% sehingga dapat dikatakan baik

5.2 Saran Pada saat praktikum sebaiknya instruksi mengenai langkah kerja yang harus dilakukan lebih diperjelas lagi, agar praktikan tidak merasa bingung mengenai praktikum yang sedang berlangsung karena penelusuran menggunakan website sangatlah sulit dan membingungkan serta perangkat komputer dan koneksi internet harus dalam keadaan baik

15

DAFTAR PUSTAKA

Carson S, Robertson D (2006). Manipulation and Expression of Recombinant DNA: A Laboratory Manual. Elsevier, Burlington. Elrod, S, 2007. Genetika Edisi Keempat. Jakarta: Erlangga. Sudjadi, 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius http://ncbi.nlm.nih.gov https://id.wikipedia.org/wiki/Primer_DNA https://robbyprada.wordpress.com/2014/03/11/pcr-polymerase-chain-reaction/

16

LAMPIRAN

1. Mencari CDS gen target pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov a. dibuka situs tersebut

b. diketik NFAT-2 complete cds dan dipilih nucleotide pada pilihan all databases

c. dipilih complete cds dan diklik FASTA

17

2. Mencari primer a. dibuka situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

18

b. Diklik DNA & RNA

c. Diklik primer BLAST dan disalin semua CDS gen pada kolom accession gi or FASTA sequence

19

d. Tampilan hasil Get Primer

20

3. Menentukan spesifisitas primer a. dibuka situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov

b. dipilih BLAST lalu dipilih nucleotide blast, dimasukkan primer yang ingin dicek pada kolom enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence, klik BLAST maka akan muncul persentase kesamaannya

21

22

23