Makalah Isolasi Dari Daun Belimbing Wuluh

LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP PRAKTIKUM ISOLASI SENYAWA BIOAKTIF ISOLASI FLAVONOID DAUN BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi)

OLEH

KELOMPOK V (LIMA) GOLONGAN JUMAT SORE 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

MARDIA SASKIAH VYNZZIE GUNANANDA MULIYATI NUR ALFONS YAHYA I AGUSTINA WAN NOR FADZLINA

N11107016 N11107020 N11107035 N11107057 N11107062 N11107077 N11107083

ASISTEN ICHSAN SAID, S.Si. MAKASSAR 2009

1

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .................................................................................. i DAFTAR ISI ............................................................................................ ii BAB I LATAR BELAKANG ...................................................................... 1 I.1 I.2 I.3

Pendahuluan ................................................................................ 1 Maksud dan Tujuan Percobaan ................................................... 3 Prinsip Percobaan ....................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 6 II.1 Uraian Tumbuhan ........................................................................ 6 II.2 Ekstraksi ...................................................................................... 9 II.3 Metode Pemisahan ...................................................................... 30 BAB III METODE KERJA ........................................................................ 45 III.1 III.2 III.3 III.4 III.5 III.6

Alat dan Bahan ............................................................................ Penyiapan Sampel ...................................................................... Ekstraksi dan Partisi Sampel ....................................................... Isolasi dengan Kromatografi Kolom Konvensional ....................... Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ...................... KLT Dua Dimensi dan Multi Eluen ...............................................

45 45 46 47 50 50

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 52 BAB V KESIMPULAN ............................................................................. 61 V.1 Kesimpulan .................................................................................. 61 V.2 Saran dan Kritik ........................................................................... 61 DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................

61

LAMPIRAN .............................................................................................

iii

GAMBAR ............................................................................................

iv

SKEMA KERJA ...................................................................................

vii

HASIL DISKUSI ……………………………………………………………. xiii

2

BAB I LATAR BELAKANG

1.1 Pendahuluan Indonesia memiliki kekayaan alam yang sangat melimpah, baik kekayaan fauna maupun kekayaan floranya. Tidak salah lagi bahwa di Indonesia terdapat banyak tumbuhan yang beraneka ragam lengkap dengan ciri khasnya masing-masing. Hal ini disebabkan Indonesia terletak di garis khatulistiwa dengan iklim tropis sehingga tanahnya subur dan cocok untuk berbagai macam jenis tanaman. Berbicara mengenai obat, sumber penggunaannya dapat ditelusuri dari budaya dan konsep kesehetan dari beberapa prinsip pandang. Di Indonesia sendiri,

landasan

ilmiah

konsep

pengobatan

tradisional

belum

di

dokumentasikan secara sistematis, namun manfaatnya telah dirasakan terutama oleh masyarakat yang hidupnya jauh dari fasilitas modern. Di Indonesia penggunaan obat tradisional yang lebih dikenal sebagai jamu, telah meluas sejak zaman nenek moyang hingga kini dan terus dilestarikan sebagai warisan budaya. Bangsa Indonesia yang terdiri dari berbagai suku bangsa, memiliki keanekaragaman obat tradisional yang dibuat dari bahan-bahan alami bumi Indonesia, termasuk tanaman obat. Tidak sedikit masyarakat mengalihkan kepercayaan kepada produkproduk kecantikan dan kesehatan dari bahan-bahan tradisional yang banyak diproduksi. Apalagi fenomena ini didukung oleh banyaknya warisan resep

3

dari nenek moyang kita yang teruji khasiatnya dan kenyataan bahwa Indonesia memiliki keanekaragaman hayati jenis tumbuhan obat. Manfaat keanekaragaman hayati tersebut bagi manusia sangat beragam seperti sebagai obat, kosmetik, pengharum, penyegar, pewarna, dan penghasil senyawa organik yang jenisnya dan jumlahnya tak terhingga. Salah satunya adalah tanaman belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi). Belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) merupakan tanaman yang memiliki banyak kegunaan hampir disemua bagiannya karena memiliki banyak kandungan komponen kimia seperti saponin, tanin, glukosida, kalsium oksalat, sulfur, asam format, peroksidase pada batangnya, serta tannin, sulfur, asam format, peroksidase, kalsium oksalat, kalium sitrat, flavonoid pada daunnya, dimana diketahui bahwa komponen-komponen kimia tersebut memiliki khasiat masing-masing. Oleh karena itu, dilakukanlah percobaan isolasi senyawa bioaktif. Pada praktikum ini, akan dilakukan pengisolasian senyawa flavonoid dari daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi). Percobaan ini dilakukan atas dasar telah diketahuinya kandungan senyawa flavonoid pada tanaman ini dan tujuan untuk menentukan metode ekstrasi, isolasi dan pengidentifikasian pada simplisia ini.

4

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1. Maksud Percobaan Mengetahui dan memahami cara-cara mengekstraksi, mengisolasi, dan mengidentifikasi komponen kimia dari suatu tanaman atau bahan alam. 1.2.2. Tujuan Percobaan 1.

Menentukan

metode

ekstraksi

simplisia

daun

belimbing

wuluh

(Averrhoa bilimbi). 2.

Menentukan metode pemisahan atau isolasi komponen kimia dari simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi).

3.

Menentukan metode identifikasi komponen kimia dari simplisia daun belimbing wuluh belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi).

1.3 Prinsip Percobaan 1.3.1 Maserasi pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik tersebut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam sel dan diluar sel.

1.3.2 Ekstraksi Cair-Padat Memisahkan satu atau lebih senyawa dengan menggunakan satu pelarut dimana senyawa tersebut akan terdistribusi menurut tingkat

5

kepolarannya menggunakan magnetik stirrer atau sentrifus, dan yang tidak larut akan membentuk endapan.

1.3.3 Kromatografi Lapis Tipis Adsorpsi yaitu pemisahan daya serap komponen kimia terhadap adsorben (fase diam). Dan partisi yaitu komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak (eluen) dengan kecepatan yang berbeda tingkat kepolarannya, hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

1.3.4 Kromatografi Kolom Konvensional Pemisahan suatu senyawa dari senyawa lain dalam suatu ekstrak, dimana senyawa-senyawa itu akan terpartisi sesuai tingkat kepolarannya, dimana fase diam yang digunakan adalah bubur silika kasar yang dimampatkan pada kolom yang terlebih dahulu dimasukkan kapas untuk mencegah silikanya turun, dan digunakan kertas saring agar proses partisi dapat berjalan baik dan lebih selektif karena lewat pori-pori penggunaan perbandingan eluen tertentu berguna untuk mempartisi ekstrak dan digunakan dari yang paling nonpolar lalu paling polar agar proses pemisahan lebih baik dan dibantu dengan bantuan gaya gravitasi.

1.3.5 Kromatografi Lapis TIpis Preparatif Adsorpsi dan partisi berdasarkan pada jumlah dan cara penotolan cuplikan yang berkesinambungan yang memberikan hasil elusi berupa pita.

6

1.3.6 Multi Eluen dan KLT Dua Dimensi Prinsip

dari

multi

eluen

yaitu

adsorpsi

dan

partisi

dengan

menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dan beberapa perbandingan eluen dengan tingkat kepolaran tertentu untuk mempertegas dan memastikan adanya senyawa tunggal. Sedangkan prinsip dari KLT dua dimensi adalah adsorpsi dan partisi dengan

menggunakan

lempeng

GF

254

sebagai

fase

diam

dan

perbandingan eluen pada profil KLT dimana akan memperpanjang lintasan noda (Rf) oleh menunjukkan senyawa tunggal.

7

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Tumbuhan II.1.1 Klasifikasi Tumbuhan (1) Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi) Kingdom

:

Plantae

Divisio

:

Mlyophyta

Subdivisio

:

Angiospermae

Class

:

Magnoliopsida

Ordo

:

Oxalidales

Family

:

Oxalidaceae

Genus

:

Averrhoa

Spesies

:

Averrhoa bilimbi

II.1.2 Nama Lain Limeng, selimeng, thlimeng (Aceh), selemeng (Gayo),; Asom, belimbing, balimbingan (Batak), malimbi (Nias),; balimbieng (Minangkabau), belimbing asam (Melayu),; Balimbing (Lampung). calincing, balingbing (Sunda),; Balimbing wuluh (Jawa), bhalingbhing bulu (Madura).; Blingbing buloh (Bali), limbi (Bima), balimbeng (Flores),; Libi (Sawu), belerang (Sangi). (1)

8

II.1.3 Morfologi Tumbuhan Pohon kecil, tinggi mencapai 10 m dengan batang yang tidak begitu besar dan mempunyai garis tengah hanya sekitar 30 cm. Ditanam sebagai pohon buah, kadang tumbuh liar dan ditemukan dari dataran rendah sampai 500 m dpi. (2) Pohon yang berasal dari Amerika tropis ini menghendaki tempat tumbuh tidak ternaungi dan cukup lembab. Belimbing wuluh mempunyai batang kasar berbenjol-benjol, percabangan sedikit, arahnya condong ke atas. Cabang muda berambut halus seperti beludru, warnanya coklat muda. Daun berupa daun majemuk menyirip ganjil dengan 21-45 pasang anak daun. Anak daun bertangkai pendek, bentuknya bulat telur sampai jorong, ujung runcing, pangkal membundar, tepi rata, panjang 2-10 cm, lebar 1-3 cm, warnanya hijau, permukaan bawah hijau muda. Perbungaan berupa malai, berkelompok, keluar dari batang atau percabangan yang besar, bunga kecilkecil berbentuk bintang warnanya ungu kemerahan. (2) Bentuk buahnya bulat lonjong bersegi, panjang 4-6,5 ern, warnanya hijau kekuningan, bila masak berair banyak, rasanya asam. Biji bentuknya bulat telur, gepeng. Rasa buahnya asam, digunakan sebagai sirop penyegar, bahan penyedap masakan, membersihkan noda pada kain, mengkilapkan barang-barang yang terbuat dari kuningan, membersihkan tangan yang kotor atau sebagai bahan obat tradisional. Perbanyakan dengan biji dan cangkok. (2)

9

II.1.4 Kandungan Kimia Batang belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) mengandung saponin, tanin, glukosida, kalsium oksalat, sulfur, asam format, peroksidase. (2) Daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) mengandung tannin, sulfur, asam format, peroksidase, kalsium oksalat, kalium sitrat, flavonoid. (2) Buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) mengandung flavonoid dan saponin. (3) Bunga belimbing wuluh (Averhoa bilimbi) mengandung alkaloida dan polifenol. (3)

II.1.5 Kegunaan Bunga belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) berguna untuk pengobatan batuk dan sariawan (sotamatitis). Sedangkan daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) memiliki kegunaan untuk menyembuhkan sakit perut, gondongan (parotitis), dan rematik. Untuk buah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) dapat berguna sebagai obat untuk menyembuhkan batuk rejan, gusi berdarah, sariawan, sakit gigi berlubang, jerawat, panu, tekanan darah tinggi, kelumpuhan,

memperbaiki

fungsi

pencernaan,

dan

radang

rektum.

Sedangkan untuk batangnya, belum ditemukan penggunaannya dalam masyarakat dikarenakan sifatnya yang keras. (2&3)

10

II.1.6 Data Ekologi Frekuensi

: Frekuensi pertumbuhan belimbing wuluh dari tahun ke tahun cukup cepat. Hal ini dikarenakan tanaman belimbing wuluh tumbuh diberbagai iklim tertentu khususnya di daerah iklim tropis. (1)

Habitat

: tumbuhan belimbing wuluh biasanya dapat tumbuh dimana saja tanpa perlu adanya populasi sendiri. (1)

Keadaan tanah

: tumbuh di tanah yang subur dan kaya unsur hara. (1)

Tempat tumbuh

: Iklim yang cocok adalah iklim tropis, dengan curah hujan yang cukup tinggi. Ketinggian tempat adalah 200-450 m di atas permukaan laut. (1)

Lokasi

: India, Myanmar, Laos, Kamboja, Thailand, Indonesia, china.

Menyebar

juga

ke

Semenanjung

India,

Muangthai, dan Filipina. (1)

II.2 Ekstraksi II.2.1 Definisi Ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisisa nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. (4)

11

II.2.2 Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya. (4) Pelarut organik yang paling sering digunakan dalam mengekstraksi zat aktif dari sel tanaman adalah metanol, etanol, kloroform, hexan, aseton, benzen dan etil asetat. (4) Proses terekstraksinya zat aktif dalam sel tanaman adalah : pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik tersebut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam sel dan diluar sel. (4) Ekstraksi padat cair atau leaching adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen terlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dari bahan padat dapat dilakukan jika bahan yang diinginkan dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi berkelanjutan diperlukan apabila padatan hanya sedikit larut dalam pelarut. Namun sering juga digunakan pada padatan yang

12

larut karena efektivitasnya. [Lucas, Howard J, David Pressman. Principles and Practice In Organic Chemistry] Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah: (4) -

Tipe persiapan sampel

-

Waktu ekstraksi

-

Kuantitas pelarut

-

Suhu pelarut

-

Tipe pelarut Minyak dapat diekstraksi dengan perkolasi, imersi, dan gabungan

perkolasi-imersi. Dengan metode perkolasi, pelarut jatuh membasahi bahan tanpa merendam dan berkontak dengan seluruh spasi diantara partikel. Sementara imersi terjadi saat bahan benar-benar terendam oleh pelarut yang bersirkulasi di dalam ekstraktor. Sehingga dapat disimpulkan: (4) -

Dalam proses perkolasi, laju di saat pelarut berkontak dengan

permukaan bahan selalu tinggi dan pelarut mengalir dengan cepat membasahi bahan karena pengaruh gravitasi. -

Dalam proses imersi, bahan berkontak dengan pelarut secara

periodeik sampai bahan benar-banar terendam oleh pelarut. Oleh karena itu pelarut mengalir perlahan pada permukaan bahan, bahkan saat sirkulasinya cepat. -

Untuk perkolasi yang baik, partikel bahan harus sama besar untuk

mempermudah pelarut bergerak melalui bahan.

13

-

Dalam kedua prosedur, pelarut disirkulasikan secara counter-current

terhadap bahan. Sehingga bahan dengan kandungan minyak paling sedikit harus berkontak dengan pelarut yang kosentrasinya paling rendah. Metode perkolasi biasa digunakan untuk mengekstraksi bahan yang kandungan minyaknya lebih mudah terekstraksi. Sementara metode imersi lebih cocok digunakan untuk mengekstraksi minyak yang berdifusi lambat. (4) Ekstraksi adalah teknik yang sering digunakan bila senyawa organik (sebagian besar hidrofob) dilarutkan atau didispersikan dalam air. Pelarut yang tepat (cukup untuk melarutkan senyawa organik; seharusnya tidak hidrofob) ditambahkan pada fase larutan dalam airnya, campuran kemudian diaduk dengan baik sehingga senyawa organik diekstraksi dengan baik. Lapisan organik dan air akan dapat dipisahkan dengan corong pisah, dan senyawa organik dapat diambil ulang dari lapisan organik dengan menyingkirkan pelarutnya. Pelarut yang paling sering digunakan adalah dietil eter (C2H5OC2H5), yang memiliki titik didih rendah (sehingga mudah disingkirkan) dan dapat melarutkan berbagai senyawa organik. (4) Ekstraksi bermanfaat untuk memisahkan campuran senyawa dengan berbagai sifat kimia yang berbeda. Contoh yang baik adalah campuran fenol (C6H5OH), anilin (C6H5NH2) dan toluen (C6H5CH3), yang semuanya larut dalam dietil eter. Pertama anilin diekstraksi dengan asam encer. Kemudian fenol diekstraksi dengan basa encer. Toluen dapat dipisahkan dengan menguapkan pelarutnya. Asam yang digunakan untuk mengekstrak anilin

14

ditambahi basa untuk mendapatkan kembali anilinnya, dan alkali yang digunakan mengekstrak fenol diasamkan untuk mendapatkan kembali fenolnya. (4) Bila senyawa organik tidak larut sama sekali dalam air, pemisahannya akan lengkap. Namun, nyatanya, banyak senyawa organik, khususnya asam dan basa organik dalam derajat tertentu larut juga dalam air. Hal ini merupakan masalah dalam ekstraksi. Untuk memperkecil kehilangan yang disebabkan gejala pelarutan ini, disarankan untuk dilakukan ekstraksi berulang. Daripada anda menggunakan keseluruhan pelarut itu untuk satu kali ekstraksi, lebih baik menggunakan sebagian-sebagian pelarut untuk beberapa kali ekstraksi. Kemudian akhirnya menggabungkan bagian-bagian pelarut tadi. Dengan cara ini senyawa akan terekstraksi dengan lebih baik. Alasannya dapat diberikan di bawah ini dengan menggunakan hukum partisi. (4) Perhatikan senyawa organik yang larut baik dalam air dan dalam dietil eter ditambahkan pada campuran dua pelarut yang tak saling campur ini. Rasio senyawa organik yang larut dalam masing-masing pelarut adalah konstan. Jadi, (4) Ceter / Cair = k (konstan) Ceter dan Cair adalah konsentrasi zat terlarut dalam dietil eter dan di air. k adalah sejenis konstanta kesetimbangan dan disebut koefisien partisi. Nilai k bergantung pada suhu. (4)

15

II.2.3 Pengertian Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya. (4)

II.2.4 Tujuan Ekstraksi Untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Proses ekstraksi ini didasarkan atas perpindahan massa komponen zat padat yang ada dalam simplisia ke dalam pelarut organik. Setelah pelarut menembus lapisan permukaan, dinding sel zat padat yang terlarut, berdifusi karena faktor perbedaan konsentrasi dalam sel dan pelarut organik di luar sel, proses ini berselang terus-menerus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel. (5) Pembuatan sediaan ekstrak dimaksudkan agar zat berkhasiat yang terdapat disimplisia terdapat dalam bentuk yang mempunyai kadar yang tinggi dan hal ini memudahkan zat berkhasiat dapat diatur dosisnya. Dalam sediaan ekstrak yang dapat distandarisasikan kadar zat berkhasiat di dalamnya sukar untuk diperoleh hasil yang sama. (5)

16

II.2.5 Jenis-Jenis Ekstraksi Metode Ekstraksi secara Dingin A.

Maserasi Metode maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, yang

dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya. Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung komponen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, tiraks dan lilin. (6)

Keterangan: A = Bejana untuk maserasi berisi bahan yang sedang dimaserasi B = Tutup C = Pengaduk yang digerakkan secara mekanik Maserasi umumnya dilakukan dengan cara : memasukkan simplisia yang sudah diserbukkan dengan derajat halus tertentu sebanyak 10 bagian

17

ke dalam bejana maserasi yang dilengkapi pengaduk mekanik, kemudian ditambahkan 75 bagian cairan penyari ditutup dan dibiarkan selama 5 hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 5 hari, disaring kedalam dalam bejana penampung, kemudian ampasnya diperas dan ditambah cairan penyari lagi secukupnya dan diaduk kemudian disaring lagi hingga diperoleh sari 100 bagian. Sari yang diperoleh ditutup dan disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya selama 2 hari, endapan yang terbentuk dipisahkan dan filtratnya dipekatkan. (6) Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna. (6) Maserasi dapat dilakukan modifikasi misalnya : (6) Digesti, adalah cara maserasi dengan menggunakan

1.

pemanasan lemah, yaitu pada suhu 40 – 50oC. Cara maserasi ini hanya dapat dilakukan untuk simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap pemanasan. Dengan pemanasan akan diperoleh keuntungan antara lain : (6) a.

Kekentalan

pelarut

berkurang,

yang

dapat

mengakibatkan berkurangnya lapisan-lapisan batas. b.

Daya melarutkan cairan penyari akan meningkat, sehingga pemanasan tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan.

18

c.

Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu absolut dan berbanding terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif akan meningkat bila suhu dinaikkan. Maserasi dengan mesin pengaduk, Penggunaan

2.

mesin pengaduk yang berputar terus-menerus, waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam. (6) Remaserasi, Cairan penyari dibagi dua, Seluruh

3.

serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan

dan

diperas,

ampas

dimaserasi

lagi

dengan

cairanpenyari yang kedua. (6) Maserasi

4.

melingkar,

Maserasi

dapat

diperbaiki

dengan mengusahakan agar cairan penyari selalu bergerak dan menyebar. Dengan cara ini penyari selalu mengalir kembali secara berkesinambungan melalui serbuk simplisia dan melarutkan zat aktifnya. Keuntungan cara ini : (6) a.

Aliran cairan penyari mengurangi lapisan batas.

b.

Cairan

penyari

akan

didistribusikan

secara

seragam, sehingga akan memperkecil kepekatan setempat. c. 5.

Waktu yang diperlukan lebih pendek. Maserasi melingkar bertingkat, Pada maserasi

melingkar penyarian tidak dapat dilaksanakan secara sempurna, karena

19

pemindahan massa akan berhenti bila keseimbangan telah terjadi. Masalah ini dapat diatas dengan maserasi melingkar bertingkat. (6) B.

Perkolasi Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Kekuatan yang berperan pada perkolasi antara lain : gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, adesi, daya kapiler dan daya gesekan (friksi). (6) Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari /perkolat, sedang sisa setelah dilakukannnya penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi. (6) Keterangan: A = Perkolator B= Botol Cairanpenyari C = Keran D = Tutup karet E = Gabus F = Sarangan G = Botol

20

Kecuali dinyatakan lain, perkolasi dilakukan sebagai berikut : 10 bagian simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus yang cocok dibasahi dengan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari, lalu dimasukkan ke dalam

bejana

tertutup

sekurang-kurangnya

selama

3

jam.

Massa

dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam percolator sambil tiapkali ditekan hati-hati, dituangi dengan cairan penyari secukupnya sambil cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari. Lalu perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. (6) Cara perkolator lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi karena: (6) a. Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang

terjadi dengan larutan yang konsentasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi. (6) b. Ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran

tempat mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler tersebut, maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan batas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi. (6) Untuk menghindari kehilangan minyak atsiri pada pembuatan sari, maka cara perkolasi diganti dengan cara reperkolasi. Dalam proses perkolasi biasa, perkolat yang dihasilkan tidak dalam kadar yang maksimal. (6)

Metode Ekstraksi secara Panas A.

Refluks

21

Metode refluks merupakan metode berkesinambungan dimana cairan penyari secara kontinu akan menyari zat aktif di dalam simplisia. Cairan penyari dipanaskan sehingga menguap dan uap tersebut dikondensasikan oleh pendingin balik, sehingga mengalami kondensasi menjadi molekulmolekul cairan dan jatuh kembali ke dalam labu alas bulat sambil menyari simplisia, proses ini berlangsung secara berkesinambungan dan dilakukan 3 kali dalam waktu 4 jam. (7)

d

Keterangan :

c

a. Labu alas bulat b. Slang air masuk b

c. Kondensor bola d. Slang air keluar

a

Alat Refluks Keuntungan metode refluks : (7) -

Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dan secara

langsung diperoleh hasil yang lebih pekat. -

Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni,

sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak.

22

Simplisia yang biasa diekstraksi dengan cara ini adalah simplisia yang mempunyai komponen kimia yang tahan terhadap pemanasan dan mempunyai tekstur yang keras seperti akar, batang, buah/biji dan herba. (7) Serbuk simplisia atau bahan yang akan diekstraksi secara refluks ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam labu alas bulat dan ditambahkan pelarut organik misalnya methanol sampai serbuk simplisia terendam kurang lebih 2 cm diatas permukaan simplisia, atau 2/3 dari volume labu kemudian labu alas bulat dipasang kuat pada statif pada heating mantel lalu kondensor dipasang pada labu alas bulat yang dikuatkan dengan klem pada statif. (8) Aliran air dan pemanasan dijalankan sesuai dengan suhu pelarut yang digunakan. Setelah 4 jam dilakukan penyaringan filtratnya ditampung dalam wadah penampung dan ampasnya ditambah lagi pelarut dan dikerjakan seperti semula, ekstraksi dilakukan sebanyak 3 – 4 jam. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan alat rotavapor, kemudian dilakukan pengujian selanjutnya. (8)

B.

Soxhletasi Soxhletasi merupakan penyarian simplisia secara berkesinambungan,

cairan

penyari

dipanaskan

hingga

menguap,

uap

cairan

penyari

terkondensasi menjadi molekul cairan oleh pendingin balik dan turun menyari simplisia di dalam klonsong dan selanjutnya masuk kebali ke dalam labu alas bulat setelah melewati pipa siphon, proses ini berlangsung hingga proses penyarian zat aktif sempurna yang ditandai dengan beningnya cairan penyari

23

yang melalui pipa siphon tersebut atau jika diidentifikasi dengan KLT tidak memberikan noda lagi. (5)

Keterangan a = Pendingin b = mantel c = Pipa samping d = sifon e = labu alas bulat

Keuntungannya : cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dan lebih pekat. Penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan, tanpa menambah volume cairan penyari. Kerugiannya : larutan dipanaskan terusmenerus, sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang cocok. Metode soxhlet bila dilihat secara keseluruhan termasuk cara panas namun

24

proses ekstraksinya secara dingin, sehingga metode soxhlet digolongkan dalam cara dingin. (5) Sampel atau bahan yang akan diekstraksi terlebih dahulu diserbukkan dan ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa (tinggi sampel dalam klonsong tidak boleh lebih dari pipa sifon). Selanjutnya labu alas bulat diisi dengan cairan penyari yang sesuai kemudian ditempatkan di atas water bath atau heating mantel dan diklem dengan kuat kemudian klonsong yang telah diisi sampel dipasang pada labu alas bulat yang dikuatkan dengan klem dan cairan penyari ditambahkan untuk membasahkan sample yang ada dalam klonsong (diusahakan tidak tejadi sirkulasi). (6) Setelah itu kondensor dipasang tegak lurus dan diklem pada statif dengan kuat. Aliran air dan pemanas dilanjutkan hingga terjadi proses ekstraksi zat aktif sampai sempurna (biasanya 20 – 25 kali sirkulasi). Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan pada alat rotavapor. (8)

C.

Metode Infus Merupakan metode ekstraksi panas yang dilakukan dengan merendam

sampel tanaman dalam pelarut dengan suhu 90ºC selama 15 menit. Hal ini sesuai dengan teori bahwa peningkatan suhu berlangsung paling sedikit 15 menit hingga 30 menit. Jika dilakukan selama 30 menit maka metode ekstraksinya disebut dekok. Biasanya alat yang digunakan disebut panci infus. Jika tidak dinyatakan lain prosedur kerja infus dengan merendam

25

sampel dalam pelarut yang bersuhu 90ºC selama 15 menit setelah itu didinginkan dan disaring. (8)

Keterangan: A = Panci berisi bahan dan air B = Tangas air D.

Metode Destilasi Destilasi atau penyulingan adalah suatu metode pemisahan bahan

kimia berdasarkan perbedaan kecepatan atau kemudahan menguap (volatilitas) bahan. Dalam penyulingan, campuran zat dididihkan sehingga menguap, dan uap ini kemudian didinginkan kembali ke dalam bentuk cairan. Zat yang memiliki titik didih lebih rendah akan menguap lebih dulu. Jadi ada perbedaan komposisi antara fase cair dan fase uap, dan hal ini merupakan syarat utama supaya pemisahan dengan distilasi dapat dilakukan. (6) Kalau komposisi fase uap sama dengan komposisi fase cair, maka pemisahan

dengan

jalan

destilasi

tidak

dapat

dilakukan.

Metode ini merupakan termasuk unit operasi kimia jenis perpindahan massa. Penerapan proses ini didasarkan pada teori bahwa pada suatu larutan, masing-masing komponen akan menguap pada titik didihnya. Model ideal distilasi didasarkan pada Hukum Raoult dan Hukum Dalton. (6)

26

1: Heat source 2: Still pot 3: Still head 4: Thermometer 5: Condenser 6: Cooling water in 7: Cooling water out Alat Destilasi 8: Distillate/receiving flask 9: Vacuum/gas inlet 10: Still receiver 11: Heat control 12: Stirrer speed control 13: Stirrer/heat plate 14: Heating (Oil/sand) bath

27

15: Stirrer bar/anti-bumping granules 16: Cooling bath. Ini adalah gambaran destilasi yang sangat sederhana ditemukan. Namun konsep dasar destilasi tersebut seperti gambar di atas. Tujuan destilasi umumnya antara lain : (6) a. Untuk memisahkan dan sekaligus menurunkan suatu zat (zat padat maupun zat cair) dari suatu campuran yang mempunyai titik didih berbeda. b. Untuk mengetahui titik didih suatu zat Destilasi uap dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia yang mengandung komponen yang mempunyai tititk didih tinggi pada tekanan udara normal. Pada pemanasan biasa terjadi kemungkinan kerusakan zat aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut maka dilakukan dengan destilasi uap. Dengan adanya uap air yang masuk, maka tekanan kesetimbangan uap zat kandungan akan diturunkan menjadi sama dengantekanan bagian di adlam suatu system, sehingga produk akan terdestilasi dan terbawa oleh uap air yang mengalir. Destilasi uap bukan semata-mata suatu proses penguapan pada titik didihnya, tetapi suatu proses perpindahan massa kesuatu media yang bergerak. (6)

28

Uap jenuh akan membasahi permukaan bahan, melunakkan jaringan dan menembus ke dalam melalui dinding sel, dan zat aktif akan pindah ke rongga uap air yang aktif dan selanjutnya akan pindah ke rongga uap yang bergerak melalui antar fase. Proses ini disebut hidrofusi. Di bawah ini contoh alat dan fungsi bagian-bagiannya : (6) Alat Destilasi (6) 1. Labu destilasi, berfungsi sebagai wadah atau tempat suatu campuran zat cair yang akan di destilasi. Terdiri dari : a. Labu dasar bulat. b. Labu erlenmeyer khusus untuk destilasi atau refluks. 2. Steel Head, berfungsi sebagai penyalur uap atau gas yang akan masuk ke alat pendingin (kondensor), dan biasanya labu destilasinya sudah dilengkapi dengan leher yang berfungsi sebagai steel head.

29

3. Thermometer, biasanya digunkan untuk mengukur suhu uap zat cair yang didestilasi

selama

proses

destilasi

berlangsung,

dan

seringnya

thermometer yang digunakan harus, a. Berskala suhu tinggi yang diatas titik didih zat cair yang akan didestilasi. b. Ditempatkan pada labu destilasi atau steel head dengan ujung atas reservoir HE sejajar dengan pipa penyalur uap ke kondensor. 4. Kondensor, memiliki 2 celah, yaitu celah masuk dan celah keluar, untuk aliran uap hasil reaksi dan untuk aliran air keran. Pendingin yang digunakan biasanya adalah air yang dialirkan dari dasar pipa,tujuannya adalah agar bagian dari dalam pipa lebih lama mengalami kontak dengan air sehingga pendinginan lebih sempurna dan hasil yang dihasilkan lebih sempurna. 5. Labu didih, biasanya selalu berasa atau keset, yang berfungsi untuk sebagai wadah sampel. Contohnya untuk memisahkan alkohol dan air. 6. Pipa dalam = pipa destilasi, berfungsi sebagai tempat mengalirnya uap air yang telah didinginkan oleh pendingin pada bagian luarnya. 7. Adaptor (Recervoir Adaptor), berfungsi untuk menyalurkan hasil destilasi yang sudah terkondisi untuk disalurkan ke penampung yang telah tersedia. Minyak

Menguap

merupakan

subtansi

yang

menyebabkan/

menimbulkan bau dari bemacam-macam tanaman. Sifat-sifat Umumnya tidak berwarna dan tidak bercampur dengan air. Sumber-sumber simplisia

30

terutama dari tumbuh-tumbuhan, mineral, dan

mikroorganisme. Cara

memperoleh Minyak Menguap antara lain : (6) -

Penyulingan dengan uap air, dengan memanaskan atau menguapkan

zat cair lalu uap tersebut didinginkan kembali supaya jadi cair dengan bantuan kondensor. -

Hidrolisa

enzimatik,

pemecahan

ikatan

glikosidisterhadap

glikosidayang dilakukan dengan enzim tertentu yang disebut glikosidase. -

Dekstruksi (Penyulingan biasa), merupakan metode yang sangat

penting dari dalam menganalisis suatu bahan yang bertujuan untuk merubah sampel menjadi bahan yang dapat diukur. -

Pengurangan tekanan, beberapa minyak menguap dapat disuling

dengan pengurangan tekanan atmosfer. -

Pemerasan, atau pengempaan dilakukan untuk mendapatkan

berbagai minyak jeruk dengan menggunakan alat pemeras. -

Enfleurage, merupakan ekstraksi menggunakanpelaut cara kuno

yang sampe sekarang digunakan. Bahan pelarut yang digunakan adalah minyak murni. Lemak murni biasanya dengan bahan-bahan lain dioleskan pada permukaan kaca tipis. Lembaran kaca yang telah dioles lemak disusun dalam rak secara teratur. Kemudian ditempeli dengan bungabunga, setelah dua atau tiga hari, bunga-bunga yang layu dibuang diganti dengan segar, dilakukan berulang, sampai lemak benar-benar telah jenuh dengan minyak bunga.

31

Kegunaan minyak menguap antara lain sebagai korigensia odoris, karminatifum, makanan, dan antiseptik. Untuk klasifikasi minyak menguap antara lain : (6) - Hidrokarbon : Terpen-terpen/Siskuiterpen - Alkohol : Ester dan alkohol - Aldehid - Keton - Fenol - Ester Fenolik : Ester dan Fenol - Oksida-oksida : Peroksida - Ester-ester : Ester-ester dan Alkohol II.3 Metode Pemisahan II.3.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT), zat penjerap merupakan lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik ataulogam secara merata. Dengan memakai KLT, pemisahan

senyawa yang amat

berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik-anorganik dan bahan ion anorganik dapat dilakukan beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal. (9) Pada kromatografi kolom merupakan proses yang lambat, yang membutuhkan penyerap relatif dalam jumlah yang besar demikian pula cuplikan yang digunakan, sedangkan dalam kromatografi lapis tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam jumlah yang sedikit dan noda-

32

noda yang terpisahkan dilokalisir pada plat seperti pada lembaran kertas. Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawa – senyawa yang terpisah secara individu yaitu dengan jalan menggeruknya dan mengumpulkan tiaptiap lapisan dalam mana lap[isan tersebut dirap. (9) Adsorben yang paling anyak digunakan dalam KLT adalah silikagel dan aluminium oksida. Silika gel umumnya mengandung zat tambahan kalsium sulfat untuk mempertinggi daya lekatnya. Zat ini digunakan untuk adsorben universal untuk kromatografi senyawa netral, asam dan basa. (10) Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan kecepatan perpindahanyang berbeda-beda. Perbandingan kecepatan bergeraknya komponen terlarut dalam fase gerak (pelarut) adakah dasar untuk mengidentifikasi komponen yang dipisahkan, perbandingan kecepatan ini dinyatakan dalam Rf (Rate of Flow), dengan persamaan : (11) Jarak yang ditempuh senyawa terlarut Rf = Jarak yang ditempuh pelarut Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa

33

cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya lebih lanjut. (12) Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. (12)

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk. (12)

34

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. (12)

Gambar : menunjukkan lempengan setelah pelarut bergerak setengah dari lempengan.

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. (12) Jika anda ingin mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, anda dapat berhenti pada bahasan

35

sebelumnya. Namun, sering kali pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. (12) Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran berlangsung sebagai berikut: (13)

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi: (13)

Jika mengulang percobaan ini pada kondisi yang tepat sama, nilai R f yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat

36

perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah.

Anda

mengidentifikasi

harus

tetap

pewarna

mengingat

yang

tertentu.

teknik

ini

jika

Mari

kita

lihat

anda

ingin

bagaimana

menggunakan kromatografi lapis tipis untuk menganalisis pada bagian selanjutnya. (13) Beberapa faktor yang mempengaruhi nilai Rf adalah : (13) -

Pelarut

-

Bahan penmgambang (jenis dan ketebalan lapisan)

-

Kejenuhan ruangan akan pelarut

-

Kelembaban udara

-

Konsentrasi

-

Komposisi larutan diperiksa

-

Panjang trayek migrasi

-

Senyawa asing

-

Ketidak homogenan kertas

-

Arah serabut kertas

-

Mutu dan sifat dari lapisan adsorbsi dan kertas

-

Derajat kejenuhan bejana pemisah.

II.3.2 Kromatografi Kolom Konvensional dan Kromatografi Vakum Cair Kromatografi Kolom Konvensional Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan

37

partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam : (14) a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi. b.

cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan

cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Pelaksanaan kromatografi kolom Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silika atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal. (14) Dalam laboratorium, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa sebagai kromatografi kolom. (14)

38

Penggunaan kolom Anggaplah akan dilakukan pemisahan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau. Larutan jenuh dibuat dari campuran dengan menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom. (14) Pertama kran penutup dibuka untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar dibawah ini: (14)

39

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering. (14) Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan dengan perubahan waktu. (14)

40

Penjelasan tentang apa yang terjadi Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Hal ini dikarenakan senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa senyawa biru harus dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina dibanding dengan senyawa kuning. Karena kurang polar, senyawa kuning menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat. (14) Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi. Pelarut disebut sebagai eluen. (14) Bila yang diinginkan adalah senyawa biru saja

41

Setelah seluruh senyawa kuning selesai terkumpulkan, Pelarut yang telah digunakan diganti dengan pelarut yang lebih polar. Ini akan mempunyai dua pengaruh, keduanya akan mempercepat senyawa biru melalui kolom. (14) •

Pelarut polar akan bersaing untuk mendapatkan ruang pada jel silika atau alumina dengan senyawa biru. Beberapa ruang untuk sementara dipergunakan oleh molekul-molekul pelarut pada permukaan fase diam, tidak menyediakan molekul-molekul biru untuk melekat dan ini akan cenderung menjaga pergerakannya dalam pelarut.

•

Akan ada atraksi yang lebih besar antara molekul-molekul pelarut polar dan molekul biru yang polar. Kecenderungan ini akan menarik molekul-molekul biru menempel pada fase diam kembali pada larutan. Pengaruh total yaitu dengan bertambahnya kepolaran pelarut, senyawa

biru akan menghabiskan waktu dalam larutan dan karenanya akan bergerak lebih cepat. (14) Jika Campuran yang Dimiliki Tidak Berwarna Jika menggunakan kromatografi kolom untuk memurnikan produk organik, mungkin produk yang diharapkan akan menjadi produk yang tidak berwarna, meskipun satu atau lebih dari pengotor berwarna. Anggaplah segala sesuatunya tidak berwarna. (14) Ini bukan merupakan pekerjaan yang cepat dan mudah. Apa yang akan dikumpulkan dan apa yang keluar dari bawah kolom dalam seluruh rangkaian pipa yang berlabel. Bagaimana besar setiap sampel akan jelas

42

tergantung pada bagaimana besar kolom yaitu mungkin akan terkumpul 1cm3 atau 5cm3 sampel atau apapun itu besarnya yang sesuai. (14) Maka kemudian akan dilakukan pengambilan setetes dari setiap larutan dan membuatnya ke dalam kromatografi lapis tipis. Tetesan pada garis dasar ditempatkan bersama dengan setetes senyawa murni dari senyawa yang sementara dibuat. Dengan mengulangi pekerjaan ini, sampel dapat diidentifikasi yang mana yang dikumpulkan pada bawah kolom yang mengandung produk yang diinginkan dan hanya dibutuhkan. (14)

II.3.3 Fraksinasi Prinsip dari fraksinasi adalah penggabungan senyawa berdasarkan bercak noda pada lempeng dengan pengamatan pada UV 254 nm dan 366. Tujuan dilakukan penggabungan adalah untuk memisahkan dan memperoleh senyawa dalam jumlah yang maksimal, di mana penggabungannya didasarkan pada nilai Rf yang sama dan penampakan warna yang ditunjukkna itu sama.

II.3.4 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Absorbsi dan partisi berdasarkan pada jumlah dan cara penotolan cuplikan yang berkesinambungan dengan hasil akhir membentuk pita. Kromatografi lapis tipis preparative merupakan metode isolasi dari suatu simplisia untuk mendapatkan senyawa tunggal. (15: 54) Lapusan preparatif normalnya adalah lapisan KLT yang lebih tebal dari 0,5. Seperti aturan umumnya dimana ketebalan maksimumnya adalah 2

43

mm meskipun beberapa pengerjaan melibatkan penggunaan lempeng yang tebalnya mencapai 10 mm. Pembuatan lempeng KLTP haruslah resisten terhadap abrasi. KLTP dibahas dalam beberapa literatur dimana metode ini masih menjadi metode yang populer. Ada perbedaan utama antara KLTP dan KLT konvensional : (15: 54) 1. Sampel ditotolkan berupa pita, biasanya bila memungkinkan ditotolkan selebar lempeng. 2. Deteksi dari pemisahan senyawa biasanya dilakukan dengan absorbansi UV atau flouresensi. 3. Biasanya multi elusi diperlukan untuk memperoleh resolusi pemisahan yang baik dari komponen sampel. Karena besarnya volume yang diaplikasikan pada KLTP bila dibandingkan dengan KLT, penggunaan alat penotolan seperti yang dibicarakan nanti diperlukan untuk keakuratan. Larutan sampel dapat ditotolkan sepanjang lempeng KLTP. Ini memungkinkan jumlah maksimum volume yang ditotolkan (volume hingga 500 ml larutan dapat dicapai dengan penggunaan alat). Bagaimanapun juga sangat penting untuk membiarkan sekitar 2 cm dari ujung pita dengan tepi lempeng. Ini dapat menghindarkan efek tepi yang dapat terjadi selama pengembangan karena perbedaan ketebalan sorben pada tepi lempeng. Ketebalan dari lapisan dan kemampuan sampel untuk melintasi jarak dari lempeng menyebabkan miligram samapi satu berat yang sangat rendah dapat diaplikasikan tetapi

44

sayangnya waktu pengembangan yang panjang tidak dapat dihindarkan dari penggunaan gaya kapilaritas normal. Biasanya pemisahan yang memakan waktu 30-60 menit pada KLT akan memakan waktu beberapa jam pada KLTP dengan lapisan setebal 2 mm. Ini tidak serta merta menjadi kerugian dari KLTP karena pemisahan dapat dilakukan semalaman dan kromatografer tidak perlu melakukan banyak hal selama pengembangan. Biasanya pemilihan eluen ditentukan berdasarkan percobaan KLT sebelumnya. (15: 55) Pengembangan dari lempeng KLTP dapat dilakukan beberapa kali ( biasanya 3 sampai 5 kali) jika diperlukan dengan pengeringan bersalang. Resolusi biasanya ditingkatkan dengan cara ini. Sering digunakan campuran pelarut sebagai fas gerak yang memiliki kepolaran di bawah profil KLTnya. Pada pengembangan pertama senyawa dipisahkan sampai bergerak kurang lebih 2 cm. Pengembangan kedua dan selanjutnya, polaritas dari fase gerak dapat ditingkatkan sedikit untuk menaikkan resolusi. Dalam KLPT, selanjutnya akan dipindahkan senyawa yang akan dipakai untuk analisis lebih lanjut atau penggunaan lain. Suatu lempeng kecil yang tajam dapat digunakan untuk menandai posis lapisan. Selalu diingat bahwa penandaan dilakukan agak di bawah zona pemisahan. Zona ini dapat dikerok dengan spatula besi atau alat lain yang cocok. Sejumlah pelarut diperlukan untuk melarutkan analit. Sorben dapat dipisahkan dengan penyaringan dan pelarut dapat diuapkan untuk memperoleh senyawa yang diinginkan. (15: 55)

II.3.5 KLT Dua Dimensi dan Multi Eluen

45

KLT dua dimensi dan multieluen memiliki prinsip yang sama yaitu adsorbsi dan partisi tetapi yang membedakannya pada KLT 2 dimensi didasarkan pada proses elusi yang bertujuan untuk memperpanjang jarak lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada multieluen jumlah totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi berupa pita. Kromatografi planar adalah satu-satunya teknik kromatografo dimana kromatografi dua dimensi dapat dilakukan. Ini merupakan alat pemisahan yang baik dan cukup sering dilirik sebagai suatu prosedur untuk dilakukan. Sayangnya kebanyakan pemisahan dua dimensi dahulunya telah melibatkan pemisahan kurang lebih 20 jenis asam amino pada selulosa atau silika gel, dimana prosedurnya memakan waktu seharian untuk dilakukan dan hanya satu sampel per lempeng yang bisa di analisa dalam satu waktu. Hasilnya adalah suatu kromatogram seperti cetakan jari, mengidentifikasi noda dengan membandingkannya dengan standar sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama . Bagaimanapun juga, suatu metode telah dikembangkan. Dulunya asam amino telah dipisahkan dengan cara ini selama berabad-abad. (15:115) Dalam hal untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama ini cukup sulit tetapi penting. (15:115)

46

Gambar mekanisme KLT 2 dimensi

BAB III METODE KERJA

47

III.1 Alat dan Bahan Adapun alat-alat yang digunakan antara lain: Batang pengaduk, bejana maserasi, botol penampung, botol semprot, buret, cawan porselin, chamber, corong pisah, kaca ukuran 20x20 cm, gegep kayu, gelas piala, gelas ukur, gunting, kipas angin, lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm, labu Erlenmeyer, lempeng kromatografi, lumpang dan mortir, oven, penggaris, pensil, pipa kapiler, pipet tetes, seperangkat alat sentrifuge, seperangkat alat kromatografi kolom, statif dan klem, tabung reaksi, timbangan ohaus, dan vial. Adapun bahan-bahan yang digunakan antara lain:

Aquadest,

aluminium foil, etanol, etil asetat, H2SO4 10%, hexan, kapas, kertas label, kertas timbang, kertas saring, kloroform, lem, lempeng KLT, metanol, sampel tanaman belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi), silika halus, silika kasar.

III.2 Penyiapan Sampel III.2.1 Pengambilan Sampel Simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) diambil dari pekarangan rumah di Jl.Perintis Kemerdekaan IV No.58, Makassar. Menggunakan pisau atau gunting atau dipetik secara langsung dengan jari pada bagian tangkai daunnya, dimasukkan dalam plastik. Kemudian dicuci bersih dengan air, diangin-anginkan hingga agak kering. III.2.2 Pengolahan Sampel

48

Daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) yang telah diambil, dicuci hingga bersih dengan air mengalir lalu ditiriskan lalu sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan

di atas kertas koran pada tempat yang

terlindung dari sinar matahari langsung. Setelah kering digunting-gunting hingga kecil-kecil lalu dikeringkan sampai kering betul.

III.3 Ekstraksi dan Partisi Sampel III.3.1 Ekstraksi Sampel Ekstraksi dengan Pelarut Metanol (Metode Maserasi) Disiapkan alat dan bahan ; Simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) yang telah kering dan halus ditimbang sebanyak 100 g ; Dimasukkan ke dalam toples kemudian ditambahkan dengan cairan penyari (metanol) hingga sampel terendam dengan cairan penyari volumenya lebih tinggi 2 cm. Toples ditutup erat dan diberi plester untuk menghindari menguapnya cairan penyari ; Dibiarkan selama 3 hari terlindung dari cahaya, kemudian disaring hasil ekstraksi dan diperas ampasnya ; Hasil ekstraksi dimasukkan ke dalam wadah (yang telah ditarer) dan dibiarkan menguap dengan bantuan kipas angin ; Ditimbang bobot ekstrak, diberi label dan disimpan dalam eksikator.

II.3.2 Partisi Ekstrak Ekstraksi Cair – Padat Karena ketidaktersediaan alat-alat yang dibutuhkan untuk percobaan ECP ini seperti magnetik stirer ataupun sentrifuge, maka yang digunakan adalah lumpang dan mortirnya dimana ekstrak nanti akan dimasukkan ke

49

dalam lumpang dan digerus dengan mortir sebagai pengganti magnetik stirer. Sejumlah ekstrak metanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) dilarutkan dalam etil asetat sedikit demi sedikit dalam wadah ; Kemudian ekstrak tersebut dimasukkan dan digerus sampai homogen ; Setelah homogen, didiamkan sebentar sehingga terlihat ada yang larut dan tidak larut berupa endapan ; Ambil bagian yang larut dan pindahkan ke dalam wadah lain dengan menggunakan pipet tetes ; Sisa ekstrak berupa endapan yang tidak larut dipindahkan ke wadah lain ; Ulangi prosedur ini hingga dua kali (hingga jernih)

III.4 Isolasi dengan Kromatografi Kolom Konvensional II.4.1 Penyiapan Kolom Kromatografi Kolom Konvensional Penyiapan Alat-alat Perangkat Kromatografi Kolom Konvensional Alat-alat perangkat kromatografi kolom dicuci dengan metanol dan dikeringkan ; Dirangkai alat kolom berdasarkan petunjuk yang ada ; Rangkaian tersebut ditegakkan dengan bantuan statif dan klem

II.4.2 Penyiapan Sampel Penyiapan Bubur Silika Ditimbang silika kasar dan ekstrak ; Diperoleh bobot silika yaitu 100x dari ekstrak ; Silika dibagi dalam dua bagian ; Bagian pertama yang bobotnya lebih besar dimasukkan ke dalam cawan porselen, sedangkan sisanya untuk penyiapan ekstrak ; Silika yang ada di cawan porselen

50

dibasahkan dengan pelarut hexan ; Diaduk-aduk hingga terbasahi semuanya ; Didiamkan beberapa saat (sesekali diaduk) ; Silika siap digunakan Penyiapan Ekstrak (Metode Kering) Disiapkan alat dan bahan ; Ekstrak ditimbang ; Kemudian ekstrak dilarutkan dengan kloroform ; Ekstrak dikeringkan dengan penambahan sisa silika yang tadi sedikit demi sedikit ; Kemudian digerus di dalam lumpang kecil ; Sisa silika disimpan ; Ekstrak siap digunakan Pengerjaan Partisi Disiapkan alat dan bahan ; Alat kolom yang telah dipasang dimasukkan kapas pada ujung kolom (dasar kolom) ; Dimasukkan bubur silika yang telah disiapkan secara perlahan-lahan ; Ditunggu beberapa saat sehingga mampat atau dipukul dengan karet pipet tetes ; Dimasukkan sampel perlahan-lahan ; Ditunggu beberapa saat ; Dimasukkan sisa silika dari pengeringan ekstrak sebagai pengganti kertas saring ; Dimasukkan perbandingan

eluen

satu-satu

mulai

dari

non-polar

hingga

polar,

perbandingannya yaitu: Hexan : Etil = 1 : 0 (100ml : 0ml), Hexan : Etil = 10 : 0 (45ml : 5ml), Hexan : Etil = 5 : 1 (42ml : 8 ml), Hexan : Etil = 1 : 1 (25 ml : 25ml), Metanol = 100% (25 ml) ; Ditampung dalam vial hingga mencapai volume 5 ml dan dibiarkan menguap.

III.4.3 Fraksinasi Komponen Kimia

51

Disiapkan alat dan bahan ; 49 vial yang tersedia dari hasil pemisahan dengan metode kromatografi kolom dipilih dengan range tertentu. Vial yang dipilih adalah vial ke 1, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, dan 49 ; Terdapat 13 vial yang telah dipilih kemudian dilarutkan dengan kloroform ; Ditambahkan dengan 1 vial yang berisi ekstrak hexan dan kemudian dilarutkan ; Totolkan ke-14 vial di atas lempeng silika ukuran 10 x 7 cm, dimana vialnya telah diberi batas atas 0,5 cm, batas bawah 1 cm, jarak antara tepi silika dengan noda pertama dan terakhir 0,4 cm, jarak antara nodanya yaitu 0,7 cm ; Dielusi dengan eluen yang paling baik pemisahannya dengan KLT yaitu eluen hexan : etil asetat (3 : 1) di dalam chamber yang telah dijenuhkan ; Setelah terelusi sampai batas atas kemudian didiamkan atau dikeringkan ; Dilihat penampakannya pada lampu UV 366 nm dan UV 254 nm serta penyemprotan H2SO4 ; Digabungkan noda-noda yang sama penampakannya dalam beberapa fraksi, terdapat 4 fraksi yang telah digabungkan. Antara lain: 1 – 14  fraksi I, 15 – 30  fraksi II, 31 – 42  fraksi III, 43 – 49  fraksi IV ; Ke-4 fraksi ini dimasukkan ke dalam vial dengan cara dilarutkan dengan kloroform ; Fraksi di dalam vial ini dibiarkan menguap.

III.5 Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

52

III.5.1 Penyiapan Lempeng KLTP Lempeng kaca 20x20 cm dibilas dengan alkohol ; Ditimbang silika halus 7 gram untuk satu lempeng ; Disiapkan sejumlah air yaitu 2 kali dari bobot silika ; Dilarutkan silikanya dalam air hingga terbasahi ; Alat pembuat lempeng kaca silika dirangkai ; Ditaburkan silika di atas lempeng kaca ; Diratakan dengan gabus hingga rata ; Dikeluarkan dari alat dan diratakan dengan bantuan tangan dengan cara ditepuk-tepuk dari belakang ; Dikeringkan.

III.5.2 Isolasi Komponen Kimia Disiapkan lempeng dan ekstrak (fraksi III) ; Dilarutkan ekstrak dengan kloroform ; Dibuat batas tanda pada lempeng ; Ditotolkan ekstrak secara berkesinambungan ; Dibuat eluen hexan : etil (4 : 1) sebanyak 25 ml ; Chamber dijenuhkan ; Dimasukkan lempeng pada chamber dan dibiarkan terelusi ; Setelah terelusi, lempeng dikeluarkan dari chamber ; Dilihat pitanya pada lampu UV 254 nm dan UV 366 nm ; Dikerok semua pita yang tampak ; Diperoleh 6 hasil pita KLTP

III.6 KLT Dua Dimensi dan Multi Eluen Multi Eluen Disiapkan alat dan bahan ; Hasil kerukan KLTP disentrifuge dalam tabung sentrifus sebanyak 3 kali dengan metanol ; Diuapkan dan setelah itu dilarutkan dengan kloroform (ada 6 vial) ; Disediakan lempeng yang sudah diaktifkan ; Masing-masing vial ditotolkan pada lempeng yang berbeda ;

53

Disiapkan

perbandingan

eluen

dari

yang

non-polar

hingga

polar

(hexan:kloroform=3:1 ; hexan:etil=4:1 ; hexan:etil=1:1) ; Setelah di elusi dengan tiga eluen, dilihat penampakannya di lampu UV.254 nm dan UV 366 nm. KLT Dua Dimensi Disiapkan alat dan bahan ; Dilarutkan ekstrak dengan kloroform ; Ditotolkan pada lempeng yang telah diaktifkan ; Dibuat perbandingan eluen hexan : etil = 4 : 1 ; Dimasukkan ke dalam chamber dan dielusi ; Setelah mencapai batas atas, diputar 90o, lalu dielusi lagi ; Setelah di elusi ke-2 mencapai batas atas, dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan ; Dilihat penampakan nodanya pada UV.254 nm dan UV.366 nm.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

54

Pada praktikum isolasi senyawa bioaktif ini dilakukan proses ekstraksi, identifikasi, dan isolasi komponen kimia yang terdapat dalam daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi). Pengerjaan awal pada praktikum ini yaitu pengambilan sampel daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) di lokasi. Simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) diambil menggunakan pisau atau gunting atau dipetik secara langsung dengan jari pada bagian tangkai daunnya, dimasukkan dalam plastik. Kemudian dicuci bersih dengan air, diangin-anginkan hingga agak kering. Setelah itu, daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) yang telah diambil, dicuci hingga bersih dengan air mengalir lalu ditiriskan lalu sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di atas kertas koran pada tempat yang terlindung dari sinar matahari langsung. Setelah kering diguntinggunting hingga kecil-kecil lalu dikeringkan sampai kering betul. Kemudian, sampel yang telah kering tersebut di ekstraksi dengan metode maserasi dengan menggunakan pelarut metanol. Metode maserasi ini dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya. Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung komponen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari. Prinsip dari maserasi itu sendiri yaitu pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik tersebut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi

55

antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam sel dan diluar sel. Setelah diekstraksi, selanjutnya dilakukan partisi ekstrak dengan metode ekstraksi cair-padat. Namun, Karena ketidaktersediaan alat-alat yang dibutuhkan untuk percobaan ECP ini seperti magnetik stirer ataupun sentrifuge, maka yang digunakan adalah lumpang dan mortirnya dimana ekstrak nanti akan dimasukkan ke dalam lumpang dan digerus dengan mortir sebagai pengganti magnetik stirer. Pengerjaannya yaitu sejumlah ekstrak metanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) dilarutkan dalam etil asetat sedikit demi sedikit dalam wadah. Kemudian ekstrak tersebut dimasukkan dan digerus sampai homogen. Setelah homogen, didiamkan sebentar sehingga terlihat ada yang larut dan tidak larut berupa endapan. Ambil bagian yang larut dan pindahkan ke dalam wadah lain dengan menggunakan pipet tetes. Sisa ekstrak berupa endapan yang tidak larut dipindahkan ke wadah lain. Ulangi prosedur ini hingga dua kali (hingga jernih) Selanjutnya yaitu isolasi dengan kromatografi kolom konvensional. Metode kolom konvensional ini dibantu dengan gaya gravitasi dan oleh karena hanya bantuan ini sehingga prosesnya memakan waktu yang lama. Langkah awal dari metode ini adalah semua alat dibersihkan dan dicuci dengan metanol, termasuk vial dan kolom. Setelah itu disiapkan bubur silikanya. Dimana proses penyiapan bubur silika itu, silika kasar saja yang

56

digunakan, meskipun sebenarnya silika haluspun juga bisa digunakan. Namun, penggunaan silika halus harus dibarengi dengan penambahan silika kasar dengan konsistensi atau bobot yang lebih besar dibandingkan silika halus. Hal ini dikarenakan bila hanya menggunakan silika halus akan menyebabkan silika tersebut terlalu mampat ketika berada di dalam kolom karena rongga-rongga antar partikel terlalu kecil sehingga menyulitkan eluen untuk mempartisi ekstrak sebab kromatografi kolom ini hanya dibantu dengan gaya gravitasi. Silika kasar direndam dengan hexan dalam suatu wadah sambil diaduk-aduk dengan maksud membasahinya sehingga membuatnya bisa memadat. Jumlah silika kasar yang digunakan untuk pembuatan bubur silika kasar adalah 100 kali dari jumlah bobot ekstrak yang digunakan. Sisa bobot silika dari yang telah dipersiapkan digunakan untuk mengeringkan ekstrak pada saat penyiapan sampel dengan metode kering. Prosesnya yaitu ekstrak dilarutkan dengan kloroform hingga larut, dan ditambahkan sisa silika tadi, digerus hingga kering dan sisa silika yang tidak dipakai disimpan sebagai pengganti kertas saring di atas sampel dan dibawah eluen. Setelah penyiapan ekstrak selesai, rangkai alat kolom. Setelah terangkai, dimasukkan sedikit kapas untuk menahan atau menyumbat sedikit ujung kolom, dan biarkan memadat terlebih dahulu dan dimampatkan dengan cara memukul-mukul buret kolom dengan karet pipet tetes. Setelah itu ditambahkan sampel tadi yang sudah disiapkan lalu dimasukkan sisa silika kasar tadi sebagai pengganti kertas saring (sehingga

57

proses partisi lebih maksimal), setelah itu dimasukkan perbandingan eluen satu per satu, dimulai dari eluen yang paling non-polar hingga ke yang polar. Maksud dari kenapa eluen yang digunakan haruslah dari non-polar terlebih dahulu ke yang polar adalah agar senyawa-senyawa yang ada didalam simplisia tersebut terpartisi menurut tingkat kepolarannya masing-masing karena apabila yang digunakan eluen polar terlebih dahulu maka akan menyebabkan senyawa polar dan non-polar akan ikut tertarik oleh eluen polar tersebut sehingga hasil partisinya pun menjadi kacau. Jadi harus digunakan eluen non-polar terlebih dahulu agar senyawa yang mula-mula tertarik lebih dulu adalah senyawa-senyawa non-polar dan saat digunakan eluen polar, senyawa yang tertarikpun hanya senyawa-senyawa polar saja, sebab tidak ada lagi senyawa non-polar yang tersisa, sehingga hasil partisinya pun menjadi bagus. Perbandingan eluen yang digunakan adalah hexan : etil asetat = 1 : 0 (100ml) ; 10 : 1 (50ml) ; 5 : 1 (50ml) ; 1 : 1 (50ml) ; metanol : hexan = 1 : 0 (25ml). Hasil partisi ditampung di dalam vial dan diuapkan hingga kering. Jumlah vial yang digunakan adalah 49 buah vial. Setelah itu, dilakukan fraksinasi atau penggabungan vial-vial yang sama penampakan nodanya setelah ditotolkan kembali di atas lempeng silika. Langkah awal dari fraksinasi adalah pemilihan dari hasil partisi metode kolom konvensional berdasarkan pemilihan secara acak dimana pada umumnya dipilih range 10. Hal ini disesuaikan dengan kondisi hasil partisi

58

(jumlah vial yang digunakan). Semakin kecil range vial semakin tampak hasil partisinya jika ada senyawa yang sama dari tiap perwakilan vial. Setelah terpilih sejumlah vial perwakilan (13 vial ditambah 1 vial ekstrak hexan), ekstraknya dilarutkan dengan kloroform hingga larut. Dibuatlah perbandingan eluen dimana yang digunakan adalah perbandingan hexan : etil asetat (3 : 1) sebanyak 20 ml. Setelah itu dimasukkan ke dalam chamber dan ditunggu hingga jenuh dengan cara memasukkan kertas saring. Sambil menunggu chamber jenuh, ke-14 vial itu ditotolkan pada lempeng yang seolah-olah sudah diaktifkan dan setelah ditotol dan chamber dijenuh, lempeng dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan terelusi hingga batas atas setelah itu dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan dan dilihat penampakan nodanya pada lampu UV.254 nm dan UV.366 nm serta penyemprotan dengan H2SO4. Dari penampakan noda, bisa dilakukan fraksinasi atau penggabungan noda-noda

menjadi

beberapa

fraksi.

Penggabungan

fraksi-fraksi

ini

didasarkan pada penampakan nodanya yang hampir sama. Didapat 4 fraksi dimana fraksi I merupakan penggabungan vial 1-14, fraksi II yang merupakan penggabungan vial 15-30, fraksi III yang merupakan penggabungan dari vial 31-42, dan fraksi IV yang merupakan penggabungan dari vial 43-49. Selanjutnya dilakukan KLTP. Pada Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) untuk skala praktikum, penyiapan lempeng sangat sederhana sekali. Dimana ditimbang 7 gram silika halus untuk 1 lempeng dan sejumlah air yang digunakan adalah

59

dua kali bobot silika. Dilarutkan silika tadi dalam air di stock erlenmeyer hingga larut. Dipasang kaca 20x20 cm pada alat dan diratakan posisinya. Ditaburkan silika tadi di atas kaca yang sudah dibersihkan dengan etanol untuk membebaslemakkannya. Diratakan dengan gabus. Dikeluarkan dari alat dan diratakan lagi bagian yang belum rata dengan tangan sambil ditepuk-tepuk. Dikeringkan di oven. Disiapkan ekstrak dan lempeng yang telah dibuat tadi. Ekstrak yang dipilih adalah ekstrak pada fraksi III. Hal ini berdasarkan penampakan noda pada percobaan fraksinasi yang telah dilakukan sebelumnya, karena noda yang warnanya paling menonjol yaitu ungu kehijauan (vial ke-31) berada pada fraksi III. Dilarutkan ekstrak dengan kloroform hingga larut. Diberi tanda pada lempeng. Ditotolkan ekstrak pada lempeng secara berkesinambungan. Dibuat perbandingan eluen hexan : etil (4 : 1) sebanyak 25 ml. Dijenuhkan chamber dengan memasukkan eluen tadi dan ditutup (bila perlu dengan pengocokan). Setelah jenuh dimasukkan lempeng tadi dan dibiarkan terelusi hingga batas atas. Dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Dilihat penampakan pitanya pada UV 254 nm dan 366 nm. Dikerok sejumlah pita sesuai pita yang tampak. Diperoleh 6 pita. Yang terakhir, dilakukan multi eluen dan KLT dua dimensi. Mula-mula, 6 hasil KLTP disentrifus terpisah, dengan menggunakan metanol sebanyak 3 kali lalu ditampung di vial lalu diuapkan. Metanol digunakan berdasarkan pemilihan fraksi untuk penotolan KLTP yang telah dilakukan sebelumnya. Karena fraksi yang dipilih adalah fraksi III, maka pelarut yang digunakan

60

untuk melarutkan ekstrak didalam vial adalah metanol. Karena seperti yang telah diketahui metanol bersifat semi-polar berarti kepolarannya berada di tengah-tengah dan fraksi yang dipilih adalah fraksi III yang diketahui mengandung ekstrak yang kepolarannya berada ditengah-tengah pula dimana fraksi III ada penggabungan noda-noda pada vial 31 – 42 dari 49 vial hasil kromatografi kolom. Jadi pelarut yang digunakan pun bersifat hampir sama dengan ekstrak pada vial-vial tersebut, dipilihlah metanol. Setelah disentrifus dengan menggunakan pelarut metanol, hasil sentrifus kemudian dipisahkan dan ditampung di dalam vial. Setelah itu vial tersebut didiamkan hingga metanolnya menguap. Untuk pengerjaan multieluen, ekstrak yang telah disentrifus tersebut dilarutkan dengan kloroform. Digunakan kloroform karena pelarut tersebut baik untuk penotolan pada lempeng sebab memenuhi syarat pelarut yang bisa digunakan untuk penotolan pada lempeng yaitu dapat melarutkan ekstrak dan mudah menguap. Meskipun sebenarnya pelarut lain bisa juga digunakan asalkan memenuhi syarat tersebut. Kloroform tidak spesifik atau harus digunakan untuk melarutkan ekstrak pada percobaan ini. Setelah ekstrak dilarutkan dengan kloroform, ditotolkan pada lempeng yang sudah diaktifkan. Ditotolkan pada lempeng secara terpisah. Eluen yang digunakan adalah mulai dari perbandingan eluen yang nonpolar ke polar, tetapi perbedaan tingkat kepolarannya hanya sedikit antara satu dengan yang lainnya yaitu hexan : CHCl3 = 3 : 1 ; hexan : etil = 4 : 1 ; dan hexan : etil = 1 : 1. Digunakan ketiga eluen yang perbedaan tingkat kepolarannya berbeda

61

sedikit ini agar bisa dilihat pergerakan noda atau hasil dari elusinya, apakah noda yang ingin dibuktikan tunggal atau tidak bisa dilihat kenaikannya sedikit demi sedikit sehingga jelas hasilnya, karena itu dipilih dari non-polar ke polar. Eluen yang dipilih tidak boleh memiliki perbedaan tingkat kepolaran yang jauh apa lagi kalau eluen kedua atau ketiga melebihi kepolaran dari eluen yang digunakan pada KLTP. Eluen-eluen tersebut tidak boleh memiliki kepolaran yang lebih tinggi dari KLTP, harus berdekatan sehingga kenaikan noda pun terlihat jelas. Setelah terelusi dengan menggunakan ketiga eluen dari non-polar hingga polar, dilihat penampakan atau kenaikan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm. Namun, pada percobaan ini tidak didapatkan hasil yang diinginkan. Setelah dilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm, noda yang telah ditotolkan justru melayang atau menumpuk di atas hingga batas elusi. Untuk KLT dua dimensi, disiapkan semua alat dan bahannya. Dilarutkan ekstrak dengan kloroform, lalu ditotokan pada lempeng yang sudah diaktifkan dibuat perbandingan eluen hexan : etil = 4 : 1. Dielusi hingga batas atas. Setelah mencapai batas atas, diputar 90o untuk memperpanjang jarak lintasannya, lalu dielusi lagi. Setelah dielusi ke dua mencapai batas atas dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Dilihat penampakan atau kenaikan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm. Namun pada percobaan KLT dua dimensi ini pun tidak didapatkan senyawa tunggal seperti halnya pada multi eluen.

62

BAB V KESIMPULAN

63

V.1 Kesimpulan Dari semua hasil percobaan yang dilakukan, dapat ditarik kesimpulan: 1. Metode ekstraksi yang digunakan untuk simplisia daun belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi) adalah metode dengan berat simplisia 100 gram dan volume menstrum metanol 3 liter. 2. Metode partisi yaitu ekstraksi cair padat dengan menggunakan pelarut

etil asetat 25 ml dan hasil partisi larut etil asetat 1,6 gram dan yang tidak larut etil 0,75 gram. 3. Metode kromatografi lapis tipis tipis dengan menggunakan eluen

heksan : etil 3 ; 1 sebanyak 5 ml dan diperoleh profil KLT. 4. Kromatografi kolom dengan menggunakan berat simplisia sebanyak 0,42

gram, berat silica 42 gram dan perbandingan eluen heksan : etil ( 1:0 = 100 ml ; 10:0 = 50 ml ; 5:1 = 50 ml ; 1:1 = 50 ml ; dan methanol 25 ml ) dan diperoleh 49 vial. 5. Fraksinasi dengan perbandingan eluen heksan : etil = 3 : 1 sebanyak 20

ml dan diperoleh hasil fraksi 4 fraksi. 6. Fraksi ketiga dilanjutkan ke kromatografi lapis tipis preparatif dengan

perbandingan eluen heksan : etil = 4 : 1 sebanyak 25 ml dan diperoleh hasil sebanyak 6 pita. 7. Semua pita dikeruk dan dilanjutkan ke KLT 2 dimensi dan multieluen

dengan perbandingan eluen untuk multieluen heksan : kloroform = 3 ; 1 (5 ml), heksan : etil = 4:1 (5ml) dan heksan : etil asetat = 1 : 1 (5ml) serta untuk KLT 2 dimensi menggunakan eluen heksan : etil = 4 ; 1 ( 25 ml).

64

8. Hasil pengisolasian menunjukkan bahwa belimbing wuluh tidak diperoleh senyawa tunggal.

V.2 Saran dan Kritik Cara kakak membimbing praktikan sudah cukup baik, dan perlu ditingkatkan sedikit lagi, serta metode diskusinya tetap dipertahankan.

DAFTAR PUSTAKA 1. Http://www.rizkytrondol.wordpress.com/belimbing-wuluh//

65

2. Http://www.tubuhsehat.com/tanaman-obat-dilingkungan-sendiri/averrhoa-

bilimbi// 3. Http://www.tanamanObat.org/BelimbingWuluh// 4. Dirjen POM. 1995. Farmakope Indonesia. Jakarta : Depkes RI. 7. 5. Anief, Moh. 1995. Ilmu Meracik Obat : Teori Dan Praktik. Gadjah Mada

University Press : Yogyakarta. 165-166. 6. DEPKES RI. 1989. Sediaan Galenik. Jakarta : Dirjen POM. 10-28. 7. Sudjadi. 1994. Metode Pemisahan. Yogyakarta : Kanisius. 63-66. 8. Darise, dkk. 1997. Komponen Kimia dalam Praktek Phytochemistry.

Makassar : Fakultas Farmasi. 1-10, 24 9. Gritter J.R, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB: Bandung. 6,

83, 107, 109. 10. Sastrohamidjojo. 1985. Kromatografi. Penerbit Liberty : Yogyakarta, 27. 11. Roth, H.J., Blaaschke, G. 1988. Analisis Farmasi. Penerjemah Sarjono

Kisman. Universitas Gadjah Mada Press : Yogyakarta. 374 12. Http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/

kromatografi_kolom/ 13. Http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/

kromatografi_lapis_tipis/ 14. Http://www.chemistry.org/SitusKimiaIndonesia/Kromatograf-Kolom//

15. Thin-Layer Chromatography. E-book. 16. Tjitrosoepomo,

G. 1994. Taksonomi Yogyakarta : UGM Press.

Tumbuhan

Obat-Obatan.

17. Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern

Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB : Bandung. 4-7, 19-30. LAMPIRAN

66

GAMBAR A.

Ekstraksi Cair Padat

Ekstrak tidak larut etil asetat

B.

Ekstrak larut etil asetat

Kromatografi Lapis Tipis

UV 254 nm

UV 366 nm

Eluen = Hexan : Etil ( 3 : 1 )

C.

Kromatografi Kolom Konvensional

67

Eluen = Heksan : etil asetat = 1 : 0 Heksan : etil asetat = 10 : 1 Heksan : etil asetat = 5 : 1 Heksan : etil asetat = 1 : 1 Metanol : etil asetat = 1 : 0

D.

Fraksinasi

UV 254 nm

UV 366 nm

Eluen = Hexan : Etil ( 3 : 1 )

E.

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

68

H2SO4

UV 366 nm

UV 254 nm

Eluen = Hexan : Etil ( 4 : 1 )

F.

KLT 2 Dimensi dan Multieluen

UV 254 nm

UV 366 nm

69

UV 254 nm Eluen =

UV 366 nm

Hexan : CHCl3 ( 3 : 1 ) Hexan : Etil ( 4 : 1 ) Hexan : Etil ( 1 : 1 )

70

B.

SKEMA KERJA A.

Ekstraksi Cair Padat Ekstrak MeOH Dilarutkan dengan etil asetat Digerus dalam lumpang Diamkan beberapa saat

Larut etil asetat (diambil)

tidak larut etil asetat(disimpan)

Dilakukan sebanyak 3 kali Diuapkan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak awal

ekstrak larut etil asetat

ekstrak tidak larut etil

Dilarutkan dengan kloroform Ditotolkan pada lempeng Dielusi dengan eluen hexan : etil = 3 :1 Dilihat penampakannya di UV 254 dan 366 nm

71

C.

Kromatografi Kolom Konvensional Penyiapan Bubur Silika Ditimbang silika kasar dan ekstrak Diperoleh bobot silika kasar 100x dari ekstrak Dibagi menjadi 2 bagian Bagian pertama dimasukkan di cawan porselen Bagian kedua untuk penyiapan sampel Dibasahkan dengan pelarut hexan Diaduk-aduk hingga terbasahi semuanya Diamkan beberapa saat (sekali-sekali diaduk) Silika siap digunakan Penyiapan Ekstrak Ekstrak ditimbang Dilarutkan dengan CHCl3 Penyiapan dengan metode kering Ekstrak dikeringkan dengan penambahan sisa silika tadi Sedikit demi sedikit Digerus hingga kering

72

Sisa silika disimpan Ekstrak siap digunakan Proses Partisi Dirangkai alat kolom Dimasukkan kapas pada buret kolom Dimasukkan bubur silika mampatkan Dimasukkan sampel Dimasukkan sisa silika Dimasukkan perbandingan eluen Ditampung di vial Diuapkan

D.

Fraksinasi Diambil 13 perwakilan vial + pembanding Ditotolkan pada lempeng Dielusi dengan eluen heksan : etil (4:1) Dilihat pada UV 254 , 366 , & H2SO4 Digabung noda yang sama

73

E.

Diperoleh 4 fraksi

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Penyiapan Lempeng KLTP Lempeng kaca 20x20 yang telah dibilas dengan alkohol Ditimbang silika halus 7 gram tiap lempeng Disiapkan sejumlah air yaitu 2x dari bobot silika Dilarutkan silikanya dalam air hingga larut Dipasang alatnya Ditaburkan silika di atas lempeng Diratakan dengan gabus hingga rata Dikeluarkan dari alat dan diratakan dengan bantuan tangan dikeringkan Proses KLTP Dilarutkan ekstrak fraksi ke 3 dengan kloroform Ditotolkan pada lempeng secara berkesinambungan Dielusi dengan eluen heksan : etil (4:1)

74

F.

Dilihat pita yang terbentuk pada UV 254 dan 366 Dikerok pita yang terbentuk Diperoleh 6 hasil pita KLTP

Multi Eluen dan KLT Dua Dimensi Multi Eluen 6 vial (ekstrak) Dilarutkan dengan CHCl3 Disiapkan perbandingan eluen Hexan : CHCl3 = 3 : 1 Hexan : Etil = 4 : 1 Hexan : Etil = 1 : 1 Ditotolkan pada lempeng Dielusi dengan ketiga eluen yang telah disiapkan Dilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm KLT Dua Dimensi Ekstrak Dilarutkan dalam CHCl3 Disiapkan eluen hexan : etil = 4 : 1 Ditotolkan pada lempeng

75

Dielusi hingga batas atas Diputar 90o Dielusi lagi hingga batas atas Dikeluarkan dari chamber Dikeringkan Dilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm

76

HASIL DISKUSI

Digunakan penyari etil asetat karena menurut jurnal yang diperoleh dikatakan bahwa senyawa flavonoid larut dalam etil asetat. Dan alasan mengapa eluaen yang digunakan pada proses KLT adalah heksan : etil asetat 3 : 1 karena belum tentu senyawa yang ditarik dengan etil asetat hanya bisa menarik senyawa-senyawa yang memiliki tingkat kepolaran sama atau dibawah etil asetat, tetapi adapun senyawa walaupun dengan konsentrasi yang sedikit bisa ikut tertarik dalam etil asetat. Sehingga hasil yang diperoleh ada senyawa yang tertinggal di bawah dan adapula yang terelusi. Alas an mengapa eluen yang digunakan kelompok lima berbeda dengan kelompok lain yang sama-sama memiliki tujuan untuk mengisolasi flavonoid karena senyawa flavonoid yang ditarik oleh kelompok lima berbeda dengan flavonoid yang ditarik oleh kelompok lain. Setiap jenis flavonoid memiliki cirri-ciri yang berbeda termasuk pelarut yang bias menaikkan nodanya. Alasan mengapa pada hasil KLT muleluen dan 2 dimensi tidak menampakkan noda karena mungkin senyawa flavonoidnya sangat mudah terhidrolisis oleh pemaparan cahaya yang terlalu lama, yang mengakibatkan senyawa tersebut pada waktu dielusi tidak naik atau dengan kata lain oleh karena

terhidrolisisnya

menyebabkan

kepolarannya.

77

senyawa

tersebut

bertambah

Alasan mengapa menggunakan metode partisi padat karena sebenarnya tidak terlalu bermasalah pada metode apa yang digunakan. Hal ini didasarkan pada jurnal yang diperoleh, dikatakan bahwa dengan metode partisi cair maupun padat, senyawa flavonoid bisa ditarik dari suatu simplisia. Hal ini terbukti juga dengan kelompok lain yang juga menarik flavonoid dengan metode partisi cair, tetap juga mendapatkan senyawa tunggal dari flavonoid. Alasan mengapa semua pita diambil karena merupakan kesalahan dari kelompok yang tidak melakukan uji pendahuluan dengan menggunakan pereaksi spesifik untuk menentukan ada tidaknya senyawa flavonoid di dalam suatu simplisia.

78