Ma 2016 61-66 (ot).docx

UJI ANGKA KAPANG KHAMIR DALAM OBAT TRADISIONAL MA PPOMN-61/MI/16

Tujuan

:

Ruang lingkup

: Metode ini digunakan untuk menetapkan Angka Kapang Khamir dalam Obat Tradisional.

Pustaka

: 1. WHO 2011, Quality Control Methods for Herbal Materials. Hal. 76 2. Badan Standardisasi Nasional. SNI ISO 7218:2012. Mikrobiologi Bahan Pangan dan Pakan-Persyaratan Umum dan Pedoman untuk Pengujian Mikrobiologi.

Prinsip

: Menumbuhkan kapang dan khamir setelah cuplikan diinokulasikan pada media yang sesuai dan diinkubasi pada 20-25 °C selama 5 hari.

Peralatan khusus : Inkubator 20-25°C; Alat penghitung koloni (colony counter). Media

: Larutan Dapat Fosfat (LDF) Ph 7,2 atau Letheen Broth, Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung kloramfenikol 100 mg/L (b/v)

Pereaksi khusus

:

Prosedur

:

1. Homogenisasi sampel Sampel secara aseptic dipipet sebanyak 10 mL atau ditimbang sebanyak 10 g ke dalam wadah sterol yang sesuai, kemudian ditambahkan 90 mL LDF pH 7,2 atau Letheen Broth, dihomogenkan hingga diperoleh suspense dengan pengenceran 101. 2. Pengenceran Disiapkan 3 tabung atau lebih yang masing-masing telah diisi dengan 9 mL LDF pH 7,2 atau Letheen Broth. Suspensi pengenceran 10-1 dipipet sebanyak 1 mL ke dalam tabung berisi LDF pH 7,2 atau Letheen Broth, dikocok homogeny sehingga diperoleh pengenceran10-2. Selanjutnya dibuat pengenceran berseri hingga 10 -3 atau sesuai dengan pengenceran yang diperlukan. 3. Inokulasi dan inkubasi Dari setiap pengenceran dipipet 1 mL ke dalam cawan petri (duplo), lalu dituangkan media PDA (suhu ±45°C), segera digoyang sambil diputar hingga suspense tersebar merata. Uji blanko dilakukan untuk mengetahui sterilitas pengencer dan media. Uji

sterilitas pengencer dilakukan dengan cara 1mL pengencer dipipet kedalam satu cawan Petri lalu dituangkan PDA (suhu ±45°C), segera digoyang sambil diputar hingga suspensi tersebar merata. Uji sterilitas media digunakan dengan menggunakan satu lempeng PDA tanpa suspensi. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-25 °C. Dan diamati pada hari ke-3 sampai hari ke-5. Koloni kapang seperti kapas atau bulat dengan berbagai warna dan permukaan kasar. Koloni khamir memiliki bentuk bulat kecil, putih, hamper menyerupai bakteri. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. 4. Pengamatan

Perhitungan

:

a. Dipilih cawan petri dari dua pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni ≤100 per cawan (Ɵ= 90 mm). Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang Khamir dalam tiap gram atau tiap mL sampel. 𝑁= N ƩC V n1 n2 d

∑𝐶 (𝑉(𝑛1 +0,1 𝑛2 )𝑥 𝑑)

rumus 1

: Angka Kapang Khamir dalam sampel : Jumlah kooni pada cawan Petri dari pengenceran yang memenuhi rentang perhitungan. : Volume inoculum yang dimasukkan ke dalam masing-masing cawan Petri (V = 1 mL) : Jumlah cawan petri yang digunakan pada pengenceran pertama yang dihitung. : Jumlah cawan Petri yang digunakan pada pengenceran kedua yang dihitung. : Pengenceran yang berhubungan dengan pengenceran pertama yang dihitung

Contoh 1 : Hitungan yang diperoleh untuk pengenceran 10 -1 adalah 66 dan 70, sedangkan pengenceran 10-2 adalah 4 dan 5. Untuk rumus 1. 𝑁=

∑𝐶 (𝑉(𝑛1 +0,1 𝑛2 )𝑥 𝑑) 66+70

= (1𝑥(2+(0,1𝑥0))𝑥 10−1 ) 136

= 2,0 𝑥 10−1 = 68 x 101 = 6,8 x 102 per mL atau gram sampel

Angka Kapang Khamir adalah 6,8 x 102 per mL atau dram sampel.

b. Perhitungan untuk jumlah koloni yang rendah Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Angka Kapang Khamir dinyatakan sebagai kurang dari 1/d per mL sampel. Contoh : Hitungan yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 0 dan 0 N < 1/d) < 1/ (10-1) < 1/0,1 < 10 koloni/mL c. Pembulatan angka Dalam melaporkan jumlah koloni atau koloni perkiraan hanya 2 angka penting yang digunakan yaitu angka pertama dan kedua. Sedangkan angka ketiga dibulatkan. Untuk ini, jika angka ketiga adalah dibawah 5, angka sebelumnya tidak diubah. Jika angka ketiga adalah 5 atau lebih, angka sebelumnya dinaikkan satu unit dan jika angka didepannya genap maka diturunkan. Teruskan sampai diperoleh 2 angka yang signifikan. Catat jumlah N yang didapat. Contoh : 12,7 x 104 = 13 x 104 = 1,3 x 105 12,4 x 104 = 12 x 104 = 1,2 x 105 15,5 x 104 = 16 x 104 = 1,6 x 105 14,5 x 104 = 14 x 104 = 1,4 x 105

Persyaratan

: Angka Kapang Khamir pada Obat Tradisional dinyatakan dalam koloni/mL atau koloni/g sampel sesuai dengan persyaratan yang berlaku.

Riwayat perubahan Terb/Rev

: Perubahan

Tanggal Efektif

UJI ANGKA LEMPENG TOTAL DALAM OBAT TRADISIONAL BENTUK CAIR MA PPOMN – 62/MI/16 Ruanglingkup

: Metode ini digunakan untuk menetapkan angka mikroba (Angka Lempeng Total) yang terdapat dalam obat tradisional bentuk cair.

Pustaka

: 1. WHO 2011, Quality Control Methods for Herbal Mterials. Hal 76 2. Badan Standarisasi Nasional. SNI ISO 7218:2012 Mikrobiologi Badan Pangan dan Pakan-Persyaratan Umum dan Pedoman untuk Pengujian Mikrobiologi

Prinsip

: Menumbuhkan dan menghitung koloni mikroba setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai.

Media/Mikroba Baku: 1. Media Larutan dapar 2. Mikroba Baku Pustaka

: 1. WHO 2011, Quality Control Methods for Herbal Mterials. Hal 76 2. Badan Standarisasi Nasional. SNI ISO 7218:2012 Mikrobiologi Badan Pangan dan Pakan-Persyaratan Umum dan Pedoman untuk Pengujian Mikrobiologi

Peralatan khusus : Inkubator 30-35 °C, alat penghitung koloni (colony counter) Pereaksi khusus : Larutan Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) 0,5% (b/v) (Lampiran 1) Prosedur

:

1. Homogenisasi sampel Sampel dipipet sebanyak 10 mL ke dalam wadah steril yang sesuai, kemudian masing-masing ditambahkan 90 mL LDF pH 7,2 atau Letheen Broth sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1 dan diaduk homogen.

2. Pengenceran Siapkan tabung yang masing-masing telah diisi dengan 9 mL LDF pH 7,2 atau Letheen Broth. Hasil dari homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 10-1 dipipet sebanyak 1 mL ke dalam tabung LDF pH 7,2 atau Letheen Broth pertama, dkocok homogen hingga diperoleh pengenceran 10 -2 kemudian dibuat pengenceran selanjutnya hingga tingkat pengenceran yang diperlukan. 3. Inokulasi dan inkubasi Dari setiap pengenceran dipipet 1 mL ke dalam cawan Petri dan dibuat duplo. Ke dalam setiap cawan Petri dituangkan 15-20 mL media SCDA/TSA + 1% TTC (suhu ±45 °C). Cawan Petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol (blanko). Pada satu cawan diisi 1 mL pengencer dan media agar, pada cawan yang lain diisi media SCDA/TSA + 1% TTC. Diamkan cawan sampai memadat tidak lebih dari 10 menit. Setelah media memadat, cawan diinkubasi pada 30-35 °C selama 4872 jam dengan posisi dibalik. Jumlah jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. 4. Perhitungan a. Dipilih cawan Petri dari dua pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni maksimum 300 per cawan (Ѳ= 90 mm). Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram atau tiap mL sampel.

𝑁=

Ʃ𝐶 (𝑉(𝑛1 +0,1 𝑛2 ) 𝑥 𝑑)

Rumus 1

N : Angka Lempeng Total dalam sampel ƩC : Jumlah koloni pada cawan Petri dari pengenceran yang memnuhi rentang perhitungan. V : Volume inokulum yang dimasukkan ke dalam masing-masing cawan Petri (V = 1 mL) n1 : Jumlah cawan Petri yang digunakan pada pengenceran pertama yang dihitung. n2 : Jumlah cawan Petri yang digunakan pada pengenceran kedua yang dihitung. d : Pengenceran yang berhubungan dengan pengenceran pertama yang dihitung. Contoh 1: Hitungan yang diperoleh untuk pengenceran 10 -1 adalah 66 dan 70. Sedangkan pengenceran 10-2 adalah 4 dan 5. Untuk rumus 1

N= (𝑉(𝑛

1

Ʃ𝐶 +0,1 𝑛2 ) 𝑥 𝑑)

66 + 70 (1𝑥(2 + (0,1 𝑥0))𝑥 10−1 ) 136 = 2,0 𝑥 10−1 = 68 + 101 = 6,8 + 102 per mL atau gram sampel =

Angka Lempeng Total adalah 6,8 x 102 per mL atau gram sampel. b. Perhitungan untuk jumlah koloni yang rendah Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan mangka Angka Lempeng Total dinyatakan sebagai kurang dari 1/d per mL sampel. Contoh: Hitungan yang diperoleh pada pengenceran 10-1 adalah 0 dan 0 N < 1/d < 1/(10-1) < 1/ 0,1 < 10 koloni/mL c. Pembulatan angka Dalam melaporkan jumlah koloni atau koloni perkiraan hanya 2 angka penting yang digunakan yaitu angka pertama dan kedua. Sedangkan angka yang ketiga dibulatkan. Untuk ini, jika angka ketiga adalah di bawah 5, angka sebelumnya tidak diubah. Jika ketiga adalah 5 atau lebih, angka sebelumnya dinaikkan satu unit. Apabila angka didepannya ganjil maka dinaikkan satu unit dan jika angka didepannya genap makan diturunkan. Teruskan sampai diperoleh 2 angka yang signifikan. Catat jumlah N yang didapat. Contoh: 12,7 x 104 = 13 x 104 = 1,3 x 105 12,4 x 104 = 12 x 104 = 1,2 x 105 15,5 x 104 = 16 x 104 = 1,6 x 105 14,5 x 104 = 14 x 104 = 1,4 x 105 Persyaratan

: Angka Lempeng Total Obat Tradisional bentuk cair dinyatakan dalam koloni/mL sampel sesuai dengan persyaratan yang berlaku.

Riwayat perubahan Terb/Rev

: Perubahan

Tanggal Efektif

UJI Salmonella spp DALAM OBAT TRADISIONAL BENTUK CAIR MA PPOMN – 63/MI/16

Ruang lingkup

: Metode ini digunakan untuk menetapkan ada atau tidaknya Salmonella spp dalam sediaan obat tradisional bentuk cair.

Pustaka

: WHO 2011. Quality Control Methods for Herbal Materials. Hal. 80.

Prinsip

: Menumbuhkan bakteri Salmonella spp setelah cuplikan dan homogenisasi, diinokulasikan pada media cair yang sesuai (Lactose Broth), pengkayaan selektif (Tetrathionate Bile Brilliant Green Broth) dan pada media lempeng selektif (BGA dan XLD) kemudian dilanjutkan konfirmasi dengan menggunakan uji biokimia.

Media

: Lactose Broth; Tetrathionate Bile Brilliant Green Broth (TBBGB); Brilliant Green Agar (BGA); Xylose Lysine Deosycholate (XLD) Agar; Nutrient Agar (NA) atau Tryptic Soy Agar (TSA), Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

Mikroba baku

: Salmonella Typhimurium ATCC 14028

Pereaksi

: Satu set pewarna Gram; kit API 20E atau RapID ONE

Peralatan Khusus : Inkubator 35-37 °C, incubator 42-43 °C. Prosedur

:

1. Homogenisasi Sampel Dengan cara aseptic dipipet 10 mL cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai, ditambahkan 90 mL Lactose Brothlalu dihomogenkan, diinkubasi pada 30-37 °C selama 2-5 jam. 2. Pengkayaan Selektif Suspense hasil homogenisasi sampel dipipet 10 mL ke dalam 100 mL TBBGB, diinkubasi pada 42-43 °C selama 18-24 jam. 3. Isolasi Satu sengkelit suspense biakan pengkayaan selektif digoreskan pada permukaan media lempeng BGA dan XLD dan diinkubasi pada 35-37 °C selama 24-48 jam dengan posisi lempeng dibalik. Biakan diduga Salmonella spp jika pada : Media BGA tumbuh koloni berukuran kecil, tidak berwarna, merah muda hingga merah dan translusen hingga keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah, atau Media XLD tumbuh koloni berwarna merah dengan atau tanpa bitnik warna hitam di bagian tengah.

4. Konfirmasi Dua atau lebih koloni spesifik pada media BGA dan XLD diinokulasikan ke media NA/TSA miring, inkubasi pada 35-37 °C selama 24 jam. Uji konfirmasi dilakukan dengan cara biokimia konvensional atau menggunakan kit API 20 E atau RapID ONE a. Konfirmasi biokimia konvensional I. TSIA Biakan dari NA/TSA miring diinokulasikan dengan cara gores dan tusuk ke media TSIA, diinkubasi pada 35-37 °C selama 18-24 jam. Perubahan warna yang terjadi diamati. Bakteri Salmonella spp memberikan hasil warna merah pada permukaan dan kuning pada dasar tabung, dengan atau tanpa pembentukan H 2S. II.

Pewarnaan Gram Satu sengkelit biakan dari NA/TSA miring dilakukan pewarnaan Gram dan diamati dibawah mikroskop. Bakteri Salmonella spp merupakan Gram negative, bentuk batang.

b. Konfirmasi biokimia menggunakan kit API 20 E atau RapID ONE Dilakukan sesuai petunjuk dalam kit. 5. Interpretaasi Hasil Salmonella spp dinyatakan positif jika memberikan hasil sebagai berikut : a. Uji biokimia konfensional Salmonella spp dinyatakan positif dalam sampel bila semua hasil konfirmasi dengan uji biokimia konvensional menunjukkan positif Salmonella spp b. Uji biokimia dengan kit i. Uji biokimia dengan kit API 20 E: Salmonella spp dinyatakan positif apabila diperoleh hasil Excellent Identification/very good ID / Good/Acceptable ID ii. Uji biokimia dengan kit RapID ONE : Salmonella spp dinyatakan positif apabila hasil probability level : Satisfactory dengan tingkat probability ≥95%. Bila tidak ada isolate yang memberikan hasil seperti berikut diatas, maka dinyatakan sebagai Salmonella spp negative/mL.

6. Pengamatan

Persyaratan

: Obat tradisional bentuk cair tidak boleh mengandung Salmonella spp (Negatif /mL).

Riwayat perubahan Terb/Rev

: Perubahan

Tanggal Efektif

UJI Eschericia coli DALAM OBAT TRADISIONAL BENTUK CAIR MA PPOMN – 64/MI/16

Tujuan

: Untuk menetapkan ada atau tidaknya Escherichia coli dalam sediaan obat tradisional bentuk cair.

Ruanglingkup

: Metode ini digunakan untuk menetapkan ada atau tidaknya Escherichia coli dalam sediaan obat tradisional bentuk cair.

Pustaka

: WHO. 2011. Quality Control Methods for Herbal Materials. Hal. 79

Peralatan

: Inkubator 35-37 °C, inkubator 43-45 °C.

Pereaksi

: Pereaksi Kovac’s, Alfa naphtol, KaOH 40% satu ser perawatan Gram, kit API 20 E, kit RapID ONE.

Prosedur

:

1. Homogenisasi sampel Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 g di dalam wadah steril yang sesuai, selanjutnya ditambahkan 90 mL. Letheen Broth atau Lactose Broth, dihomogenisasi kemudian inkubasi pada 30-37 °C selama 2-5 jam. 2. Pengkayaan Dari hasil homogenisasi dipipet 10 mL ke dalam 100 mL MCB kemudian diinkubasi pada 43-45 °C selama 18-24 jam. 3. Isolasi Biakan hasil pengkayaan diinokulasikan dengan menggunakan sengkelit pada permukaan media lempeng MCA, diinkubasi pada 43-45 °C selama 18-24 jam. Diamati adanya koloni spesifik yang tumbuh. Biakan diduga positif E coli jika ada pertumbuhan koloni berwarna merah, umumnya tidak berlendir dan kadang-kadang dikelilingi zona kemerahan. Bila tidak ada koloni dengan ciri-ciri seperti tersebut di atas nyatakan sebagai E. Coli negatif/g. Bila ada koloni terduga, dilakukan uji konfirmasi 4. Konfirmasi biokimia Sedikitnya 2-3 koloni dari media lempeng MCA diinokulasikan pada media TSA/NA, diinkubasi pada 35-37 °C selama 24 jam. Konfirmasi biokimia dapat dilakukan dengan memilih salah satu uji sebagai berikut.

a. Uji Biokimia Konvensional i. Pemeriksan mikroskopis Dari biakan TSA/NA dilakukan pewarnaan Gram dan diamati dengan mikroskop, E. Coli merupakan bakteri Gram negatif, bentuk batang. ii. Uji Indol Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada media Trytone Broth dan diinkubasikan pada 43,5-44,5 °C selama 24-48 jam. Kemudian biakan ditambahkan 1 mL pereaksi Indol (Kovac’s) dikocok dan didiamkan beberapa menit. Warna merah Cherry yang berbentuk cincin pada permukaan biakan menunjukkan reaksi indol positif. E. coli memberikan warna merah cherry. b. Uji biokimia dengan kit API 20E atau RapID ONE atau kit identifikasi lain yang sesuai Dilakukan sesuai petunjuk dalam kit. 5. Interpretasi hasil a. Uji biokimia konvensional Escheria coli dinyatakan positif dalam sampel bila semua hasil konfirmasi dengan uji biokimia konvensional menunjukkan positif E. Coli. b. Uji biokimia dengan kit i. Uji biokimia dengan kit API 20 E : Escheria coli dinyatakan positif apabila diperoleh identification/ Very good ID/ Good ID/ Acceptable ID. ii.

hasil

Excellent

Uji biokimia dengan kit RapID ONE : Escheria coli dinyatakan positif apabila hasil probability level satisfactory dengan tingkat probability ≥ 95%.

Persyaratan

: Obat tradisional bentuk cair tidak boleh mengandung Escheria coli (Negatif/mL).

Riwaya tperubahan Terb/Rev

: Perubahan

TanggalEfektif

UJI Staphylococcus aureus DALAM OBAT TRADISIONAL MA PPOMN – 65/MI/16 Tujuan

:

Ruanglingkup

: Metode ini digunakan untuk menetapkan ada atau tidaknya Staphylococcus aureus dalam sediaan obat tradisional

Pustaka

: WHO 2011 Quality Control Methods for Herbal Materials. Hal. 81

Prinsip

: Menumbuhkan bakteri Staphylococcus aureus setelah cuplikan dan homogenisasi, diinokulasikan pada media pre-treatment yang sesuai (LDPS pH 7,0 atau LDF pH 7,2), pengkayaan (Trpticase Soy Broth) dan pada media lempeng selektif (BPA) kemudian dilanjutkan konfirmasi dengan menggunkana uji biokimia.

Media

: Larutan Dapar Pepton Salin (LDPS) pH 7,0 atau Larutan Dapar Fosfat (LDF) pH 7,2; Trpticase Soy Broth (TSB); Baird Parker Agar (BPA).

Mikroba baku

: Staphylococcus aureus ATCC 25923

Peralatan

: Inkubator suhu 36±1 °C

Pereaksi

: Pereaksi katalase; plasma kelinci atau kuda; satu set pewarnaan Gram; kit API Staph atau RapID STAPH Plus System.

Prosedur

:

1. Homogenisasi sampel Dengan cara aseptik ditimbang 10 g atau dipipet 10 mL cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai, ditambahkan 90 mL LDPS pH 7,0 atau LDF pH 7,2 lalu dihomogenkan, kemudian diinkubasi pada 30-37 selama 2-5 jam. 2. Pengkayaan Suspensi hasil homogenisasi sampel dipipet 10 mL ke dalam 100 mL TSB, diinkubasi pada 35-37 °C selama 24-48 jam. 3. Isolasi Satu sengkelit suspensi biakan media lempeng BPA dan diinkubasi pada 35-37 °C selama 24-48 jam. Koloni yang tumbuh diamati. Biakan diduga Staphylococcus aureus positif jika koloni berwarna abu-abu hingga hitam mengkilat dikelilingi dengan zona jernih. 4. Konfirmasi biokimia Dua atau lebih koloni spesifik pada media BPA diinokulasikan ke media NA/TSA miring, inkubasi pada 35-37 °C selama 24 jam.

a. Konfirmasi biokimia konvensional i. Uji katalase Larutan hidrogen peroksida 3% atau yang tersedia komersil diteteskan diatas permukaan gelas obyek. Satu sengkelit koloni spesifik yang tumbuh pada BPA diambil menggunakan sengkelit, kemudian diletakkan diatas larutanhidrogen peroksida. Diamati pembentukan gelembung gas. Bila terbentuk gelembung gas, maka uji katalase positif. Bakteri Staphylococcus aureus merupakan katalase positif. ii. Uji koagulase Satu sengkelit koloni spesifik yang tumbuh pada BPA diinokulasikan kedalam tabung yang berisi 0,5 mL plasma kelinci atau kuda. Kemudian diinkubasi pada 35-37 °C selama 24-48 jam. Bila terjadi penjendalan, maka uji koagulase positif. Bakteri Staphylococcus aureus memberikan hasil koagulase positif. iii. Pewarnaan gram Satu sengkelit biakan dari NA/TSA miring dilakukan pewarnaan Gram dan diamati dibawah mikroskop. Bakteri Staphylococcus aureus merupakan Gram positif bentuk anggur. b. Konfirmasi biokimia menggunakan kit API Staph atau RapID STAPH Plus System Dilakukan sesuai petunjuk dalam kit. 5. Interpretasi hasil Staphylococcus aureus dinyatakan positif jika memberikan hasil sebagai berikut: a. Uji biokimia konvensional Staphylococcus aureus dinyatakan positif dalam sampel bila semua hasil konfirmasi dengan uji biokimia konvensional menunjukkan positif Staphylococcus aureus. b. Uji biokimia dengan kit i. Uji biokimia dengan kit API Staph Staphylococcus aureus dinyatakan positif apabila diperoleh hasil : Excelent identification/ very good ID/ Good ID/ Acceptable ID. ii. Uji biokimia dengan kit RapID STAPH Plus System Staphylococcus aureus dinyatakan positif apabila diperoleh hasil probability level : satisfactory dengan tingkat probability ≥95%.

Bila tidak ada isolat yang memberikan hasil seperti tersebut diatas, maka dinyatakan sebagai Staphylococcus aureus negatif/g atau negatif/mL.

Persyaratan

:

Riwaya tperubahan Terb/Rev

Obat tradisional bentuk cair tidak Staphylococcus aureus (Negatif/mL).

boleh

: Perubahan

TanggalEfektif

mengandung

UJI Pseudomonas aeruginosa DALAM OBAT TRADISIONAL MA PPOMN – 66/MI/16 Tujuan

:

Ruang lingkup

: Metode ini digunakan untuk menetapkan ada atau tidaknya Pseudomonas aeruginosa dalam sediaan obat tradisional.

Puataka

: WHO. 2011. Quality Control Methods for Herbal Materials.Hal. 80.

Prinsip

: Menumbuhkan bakteri Pseudomonas aeruginosam setelah cuplikan dan homogenisasi, diinokulasikan pada media pretreatment yang sesuai (LDPS pH 7,0 atau LDF pH 7,2) pengkayaan (Tryptocase Soy Broth) dan pada media lempeng selektif (CETA) kemudian dilanjutkan konfirmasi dengan menggunakan uji bio kimia.

Media

: Larutan Dapar Pepton Salin (LDPS) pH 7,0 atau Larutan Dapar Fosfat (LDF) pH 7,2; Trypticase Soy Broth (TSB), Cetrimide Agar (CETA).

Mikroba baku

: Pseudomonas aeruginosa ATTC 9027.

Pereaksi

: Pereaksi oksidase, satu set pewarnaan Gram, kit API 20NE atau RapID NF Plus.

Peralatan khusus : Inkubator suhu 36±1⁰C, incubator suhu 42±1⁰C. Prosedur

:

1. Homogenisasi Sampel Dengan cara aseptic ditimbang 10 g atau dipipet 10mL cuplikan kedalam wadah steil yang sesuai, ditambahkan 90mL, LDPS pH 7,0 atau LDF pH 7,2 lalu dihomogenkan, diinkubasi pada 36±1⁰C selama 2-5 jam. 2. Pengayakan Suspensi hasil homogenisasi sampel dipipet 10mL, ke dalam 100mL TBS, diinkubasi pada 36±1⁰C selama 24-48 jam. 3. Isolasi Satu sengkelit suspensi biakan pengkayaan digoreskan pada permukaan media lempeng CETA dan inkubasi pada 36±1⁰C selama 24-48 jam. Koloni yang tumbuh diamati. Biakan diduga P aeruginosa positif jika koloni berwarna kehijauan. 4. Konfirmasi Dua atau lebih koloni spesifik pada media CETA diinokulasikan ke media NA/TSA miring, inkubasi pada 35-37⁰C selama 24 jam.

Uji konfirmasi dilakukan dengan cara uji biokimia konvensional atau menggunakan kit API 20 NE atau RapID NF Plus. a. Knfirmasi biokimia konvensional i. Uji oksidase Satu sengkelit kiloni spesifik yang tumbuh pada CETA diambil menggunakan sengkelit platina atau batang kaca. Kemudian ditotolkan pada pereaksi oksidase. Pertumbuhan warna ungu pada bekas totolan dalam waktu 5-10 detik menunjukan uji oksidase positif. Bakteri P aureginosa memberikan hasil oksidase positif. ii. Uji pertumbuhan pada 42°C Satu sengkelit kiloni spesifik yang tumbuh pada CETA diinokulasikan pada 10mL media TSB, diinkubasi pada 42⁰C selama 24 jam. Inkubasi dilanjutkan sampai 48 jam bila belum ada pertumbuhan. Pertumbuhan positif ditunjukkan dengan terjadi kekeruhan. Bakteri P aureginosa dapat tumbuh pada suhu 42⁰C. iii. Pewarnaan gram Satu sengkelit biakan dari NA/TSA miring dilakukan pewarnaan Gram dan diamati di bawah mikroskop. Bakteri P aeruginosa merupakan Gram negative bentuk batang. b. Konfirmasi biokimia menggunakan kit API 20 NE atau RapID NF Plus Dilakukan sesuai petunjuk dalam kit. 5. Interpretasi hasil Pseudomonas aeruginosa dinyatakan positif jika memberikan hasil sebagai beriku: a. Uji biokimia konvensional Pseudomonas aeruginosa dinyatakan positif dalam sampel bila semua hasil konfirmasi dengan uji biokimia konvensional menunjukan positif P aeruginosa. b. Uji biokimia dengan kit 1. Uji biokimia dengan kit API 20NE Pseudomonas aeruginosa dinyatakan positif apabila diperoleh hasil : Excellent identification/ Very good ID/ Good ID/ Acceptable ID 2. Uji niokimia dengan kit RapID NF PLUS Pseudomonas aeruginosa dinyatakan positif apabila hasil probability level : satisfactory dengan tingkat probability ≥ 95%

Bila tidak ada isolate yang memberikan hasil seperti tersebut di atas, maka dinyatakan sebagai Pseudomonas aeruginosa negative/g atau negative/ml.

Persyaratan

: Obat tradisional tidak boleh mengandung aeruginosa (Negatif/g atau Negatif/ml).

Riwaya tperubahan Terb/Rev

Pseudomonas

: Perubahan

TanggalEfektif