Lvt Tesis Oscar Josimar Sotelo Lic Qbp Correciones.docx

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Evaluación de la actividad antifúngica de bacterias endófitas aisladas del maíz (Zea mays raza. Jala) PROYECTO DE INVESTIGACIÓN QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTERNER EL TÍTULO DE

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO PRESENTA:

OSCAR JOSIMAR SOTELO AGUILAR DIRECTOR DE TESIS

DR. CÉSAR HUGO HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ M. EN. C. JOSSUE MIZAEL ORTIZ ALVAREZ

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Lugar de realización, dirección y apoyos recibidos (SIP 2018 y 2019)

2

El índice, ponerlo como una tabla con las celdas ocultas, para que todo quede justificado…. Índice Índice de figuras .................................................................................................................................... 54 Índice de tablas ..................................................................................................................................... 76 Resumen ............................................................................................................................................... 87 1.

Introducción .................................................................................................................................. 98 1.1. 1.1.2.

Enfermedades del maíz causadas por hongos .................................................................... 109 Historial epidemiológico de Fusarium en cultivos de cereales ..................................... 1110

1.2.

Generalidades de F. culmorum, F. oxysporum, F. equiseti y F. fujikuroi ........................... 1211

1.3.

Estrategias de control contra hongos en cereales ............................................................ 1615

1.4.

Microorganismos endófitos .............................................................................................. 1817

1.4.1. 1.5.

Metabolitos secundarios, bacteriocinas y sideróforos de bacterias endófitas ............ 2019 El maíz (Zea mays) como cultivo agrícola ......................................................................... 2221

1.5.1.

El maíz raza Jala ............................................................................................................ 2322

1.5.2.

El maíz raza Conejo ....................................................................................................... 2423

2.

Antecedentes ............................................................................................................................ 2524

3.

Justificación ............................................................................................................................... 2625

4.

Hipótesis.................................................................................................................................... 2726

5.

Objetivos ................................................................................................................................... 2827

6.

Material y métodos ................................................................................................................... 2928

7.

6.1.

Material biológico ............................................................................................................. 3029

6.2.

Evaluación cualitativa de la producción de celulasas ....................................................... 3130

6.3.

Evaluación cualitativa de producción de proteasas.......................................................... 3231

6.4.

Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de quitinasas ................................. 3231

6.5.

Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de sideróforos. .............................. 3332

6.6.

Prueba de inhibición en placa en hongos filamentosos ................................................... 3433

6.7.

Estimación de producción de ácido cianhídrico ............................................................... 3433

6.8.

Prueba de protección de la germinación en semillas de maíz in vitro ............................. 3533

6.9.

Prueba de protección por infección de Fusarium en planta de maíz a nivel invernadero3635

Resultados ................................................................................................................................. 3837 7.1.

Evaluación cualitativa de producción de celulasas ........................................................... 3837

7.2.

Evaluación cualitativa de producción de proteasas.......................................................... 4038

7.3.

Valoración cualitativa y cuantitativa de producción de quitinasas .................................. 4140

7.1.

Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de sideróforos. .............................. 4342 3

7.2.

Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de sideróforos. .............................. 4443

7.3.

Estimación cuantitativa de producción de sideróforos .................................................... 4544

7.4.

Prueba de inhibición en placa en hongos filamentosos ................................................... 4746

7.5.

Estimación cualitativa de la producción de ácido cianhídrico ......................................... 4948

7.6. Ensayo de protección de semillas de maíz raza Conejo infectadas con conidios de especies fitopatógenas del género Fusarium por Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum antrophi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160. ........................................................................................................ 5049 7.7.

Prueba de protección por infección de Fusarium en planta de maíz a nivel invernadero5352

8.

Discusión ................................................................................................................................... 5958

9.

Conclusiones ............................................................................................................................. 6463

10.

Bibliografía ............................................................................................................................ 6564

4

Índice de figuras Figura 1. Marchitez de la raíz del maíz causada por Fusarium graminearum Figura 2. Mazorcas infectadas con Fusarium gramniearum produciendo micelio blanquecino y una pigmentación púrpura. Figura 3. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium culmorum en medio PDA Figura 4. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium oxysporum en medio PDA Figura 5. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium equiseti en medio PDA Figura 6. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium fujikuroi en medio PDA Figura 7. Figura 7. Rotación de cultivos en parcelas Figura 8. Inhibición en placa de Curvularia oryzae por Trichoderma harzianum en medio PDA Figura 9. Localización de microorganismos rizosféricos, del rizoplano y endófitos en la raíz de una planta Figura 10. Diversidad química de metabolitos secundarios y compuestos volátiles. Figura 11. Cultivo de maíz en Tizimín Yuc. México Figura 12. Planta y mazorca de maíz raza Jala Figura 13. Mazorca de maíz raza Conejo Figura 14. Halos de hidrólisis de celulosa en medio CMC-rojo Congo de las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160 Figura 15. Índices de hidrólisis de la celulosa en placa de las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. Figura 16. Halos de proteólisis de la caseína en medio SM de las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. Figura 17. Índices de hidrólisis de la caseína en placa de las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. Figura 18. Halos de hidróolisis de quitina coloidal en agar QC de las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. Figura 19. Curva tipo de NAG determinada por el método Miller

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Figura 20. Cinética enzimática de quitinasas de cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160 Figura 21. Halos de quelación de iones divalentes Zn, Co, Mg, Cu, Ca mediante la producción de sideróforos en medio CAS producidos por bacterias Figura 22. Gráafica de índices de quelación de iones divalentes Zn, Co, Mg, Cu, Ca mediante la producción de sideróforos en medio CAS producidos por bacterias Figura 23. Placa de 96 pozos inoculadas con sobrenadantes bacterianos suplementados con medio líquido CAS y calcio, magnesio, cobalto, zinc y cobre. Figura 24. Índices de quelación de los iones divalentes calcio, magenesio, zinc, cobalto y cobre en medio CASde las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. Figura 25. Inhibición de especies fitopatógenas del género Fusarium por bacterias endófitas en medio PDA

Figura 26. Estimación cualitativa de la producción de ácido cianhídrico de Pseudomonas protegens E1BL2 y Ochrobactrum anthropi en medio TSA-glicina. Figura 27. Ensayo de protección de semillas de maíz raza Conejo infectadas con conidios de especies fitopatógenas del género Fusarium por Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum antrophi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160. Figura 28. Ensayo de protección de semillas de maíz raza Conejo infectadas con conidios de especies fitopatógenas del género Fusarium por Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum antrophi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160. Figura 29. Prueba a nivel invernadero de protección con bacterias endófitas de maíz raza Jala a plantas de maíz raza Conejo infectadas con Fusarium culmorum. Figura 30. Raíz sana sin presencia de signos o síntomas de infección por Fusarium culmorum protegida por P. protegens E1BL2. Figura 31. Raíz enferma con presencia de micelio y síntomas de infección y necrosis tratada con solución salina y Fusarium culmorum. Figura 32. Síntomas de enfermedad fúngica por necrosamiento en entrenudo del tallo (a) y marchitez foliar temprana (b). Figura 36. La longitud del tallo en plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero. El asterisco (*) sobre las barras representa la diferencia significativa en comparación con el testigo. Figura 33. Peso húmedo de las plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero. Figura 34. Peso seco de las plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero. Figura 35. La longitud de raíz en plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero. 6

Figura 36. La longitud del tallo en plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero.

Índice de tablas Tabla 1. Linaje taxonómico de Fusarium como organismos celulares eucariotes.

Tabla 2. Selección de bacterias con potencial antagónico contra especies fitopatógenas del género Fusarium se empleó a B. subtilllis 160 como control positivo. Tabla 3. Puntaje de protección de Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum anthropi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160 a semillas infectadas con especies fitopatógenas del género Fusarium

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Formatted: Font: 12 pt

Resumen La aplicación de fungicidas químicos altera la estabilidad microbiana de los suelos agrícolas, lo que puede promover su erosión y pérdida de fertilidad. Las capacidades antagónicas de algunos microorganismos pueden ser utilizadas para el control biológico de hongos fitopatógenos. En este trabajo se llevó a cabo la evaluación de la actividad antifúngica de bacterias endófitas del maíz raza Jala contra Fusarium culmorum y Fusarium oxysporum, hongos fitopatógenos causantes de la pudrición de tallo y mazorca. Asiímismo, se evaluaron Fusarium equiseti causante de la pudrición en pinos o plantas frutales y Fusarium fujikuroi causante de la enfermedad de bakanae en cultivos de arroz, pero que también ocasionalmente producen la pudrición de la raíz del maíz en etapas tempranas del desarrollo vegetal. Las bacterias XXXX mostraron diferentes grados de antagonismo in vitro contra las especies de Fusarium. Por otro ladoAsimismo, los experimentos a nivel de invernadero mostraron que Pseudomonas protegens E1BL2 fue capaz de prevenir al maíz X de la infección fúngica con F. culmorum, F. oxysporum, F. equiseti, F. fujikuroi en experimentos realizados a nivel de invernadero.

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1. Introducción La fitopatología estudia las enfermedades en las plantas, las cuales pueden ser causadas por hongos, bacterias, micoplasmas, protozoarios, nemátodos y virus. En particular las enfermedades fúngicas son de gran importancia en la agricultura debido al impacto negativo que genera en la producción y su alta persistencia en las plantaciones, lo cual es consecuencia de que muchos hongos tienen un estadio esporulado de criptobiosis (Agrios, 1998). Muchos hongos fitopatógenos tienen un alto grado de virulencia, lo cual dificulta su control. La aplicación de fungicidas sistémicos a la larga provoca la erosión y pérdida de fertilidad del suelo, pero también afecta a las comunidades microbianas asociadas a la planta, cuyas especies

promueven

el

crecimiento

vegetal

e

inhiben

microorganismos

fitopatógenos (Choudhary et al., 2007). En México, el maíz es el cultivo agrícola más importante, el cual abarca aproximadamente 7 millones de hectáreas de superficies cultivadas. El maíz es el principal alimento de la cultura alimenticia en México y América Central, pero su consumo para alimentación animal y humana se ha extendido por todo el mundo. En el municipio de Jala en Nayarit de encuentra una raza de maíz con características sobresalientes, entre las que se encuentran una altura de más de 6 metros y la producción de mazorcas con más de 30 cm de largo. Este crecimiento se ha asociado a las propiedades que contiene el suelo donde es sembrado (Rice, 2007). Revisa todas la s referencias, aquí dice 2007 y en la bibliografía 2004, cuál es la correcta?

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Cómo es que la prodedumbre de raiz s e puede presentar en la parte aérea de la planta?

1.1. Enfermedades del maíz causadas por hongos La mayoría de las enfermedades fúngicas como las royas, tizones, podredumbres de raíz y tallo se presentan en la parte aérea de la planta, la cual tiene un mayor

Formatted: Highlight

riesgo de susceptibilidad en los primeros 40 días del plantío. Las condiciones

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ambientales que promueven el desarrollo de los hongos fitopatógenos incluyen temperaturas entre 16ºC a 23ºC así como una elevada humedad. Es importante reconocer qué tipo de enfermedad fúngica está presente en la planta, para lo cual es necesario reconocer los síntomas y signos como el manchado foliar, la presencia de micelio, la pudrición de la raíz, mazorca y tallo. Entre los agentes causantes de pudrición del tallo se encuentran los hongos del género Fusarium, entre las cuales se destacan las causadas por Fusarium moniliforme o Fusarium verticilloides por su amplia distribución geográfica y climática. Estos hongos se internalizan en el floema marchitando el áarea foliar, por lo que la planta pierde su firmeza e inicia la necrosis del tallo y aparecen entrenudos de color negro. Otra pudrición del tallo del maíz es producida por Colletotrichum graminicola, hongo que ocasiona los siguientes síntomas: lesiones negras, alargadas y angostas a lo largo del tallo. Una vez infectada la planta, sufre un marchitamiento prematuro y desgarramiento de los haces vasculares, los cuales adquieren una coloracion café oscuro (Alberts et al., 2016). La pudrición de la mazorca es una de las infecciones más importantes en la agricultura, la cual se produce al final del ciclo de cosecha, lo quecual impacta en la inversión de tiempo y dinero de los agricultores. Entre los principaes agentes 10

etiológicos se encuentran Paenecillium spp. Aspergillus flavus, Aspergillus niger o Fusarium graminearum. F. graminearum los cuales provocan pudricion de tallo, mazorca y tizones en las pláantulas como se observa en la Figura 1. La pudrición por F. moniliforme es probablemente la más comúun en la mazorca del maíz en todo el mundo, la cual se manifiesta principalmente en los granos individualmente cubriéndolos de micelio o rayas blancas en el pericarpio y germinando estando aún

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en el olote. (CIMMYT, 2004 )

Commented [JMOA1]: Así no se citan libros en el texto. Revisa.

Figura 1. Marchitez del maíz causada por Fusarium graminearum. (Schwartz, 2010).

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

Para que no se confundan con el texto, reducir el interlinedo de todos los pies de figura a 1,15 por ejemplo.

1.1.2. Historial epidemiológico de Fusarium en cultivos de cereales

Los primeros reportes de marchitez y pudrición en trigo datan de 1884 en Inglaterra (FAO, 2012). El control de estas infecciones depende del control de la humedad excesiva, las buenas prácticas de labranza y la apropiada rotación de cultivos. Como se muestra en la Figura, el maíz también es susceptible a la infección. En E.U.A se perdieron más de 1 millón de dólares en 1993 y 500 millones de dólares en 1994 por los daños ocasionados por la marchitez del maíz (FAO, 2005).

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La epidemia en Yangtze River Valley China en 1950, afectó a más de 7 millones de hectáreas de trigo. La persistencia en México por Fusarium en los cultivos afecta en localidades como Toluca, Pátzcuaro Michoacán, Jalisco (Rajaram,. 1996).

Figura 2. Mazorcas infectadas con Fusarium graminearum. Las plantas de maíz muestran micelio blanquecino característico de la infección causada por F. gramineraum (Mente, 2012). Por qué aquí el título de la figura está en negritas y en la fif 1, no lo está? Hay que homogeneizar

1.2. Generalidades de F. culmorum, F. oxysporum, F. equiseti y F. fujikuroi

Los hongos del género Fusarium se encuentran como saprófitos en el suelo y son capaces de causar la pudrición de raíces, tallos y mazorca. En la Tabla 1 se muestra el linaje taxonómico de este género. Estos hongos producen micotoxinas como zearalenona, fumonisina, y nivalenol, los cuales se pueden acumular en la semilla. Estos granos contaminados con micotoxinas pueden ocasionar patologías severas después de ser consumidos (Awad et al., 2013). F. culmorum es aislado frecuentemente del suelo o de granos de maíz infestados, y puede estar viable en el suelo entre 2-4 años formando estructuras de latencia como las clamidiosporas. Cuando la semilla del maíz germina pueden generarse lesiones a través de la cuales penetran los macroconidios que son el estadio infectante. También el hongo puede ingresar a través de los estomas con ayuda de su 12

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

maquinaria enzimática extracelular, la cual hidroliza la lámina basal foliar hasta el tallo. Una vez dentro del endosperma, el hongo puede desarrollar una breve fase biotrófica en la planta, para posteriormente desencadenar una fase necrótica que provoca los síntomas del blanqueamiento de las espigas y mazorcas. Como consecuencia de esto una masa blanca-rosácea donde están presentes los macroconidios se estructura. Los macroconidios serán dispersados a nuevas plántulas a través del viento o la lluvia o por insectos, aves y objetos de labranza ( Oldenburg et al., 2015).

Todas tus tablas tienen diferentes formatos, sombraedos y colores, hay que homogeneizar Tabla 1. Linaje taxonómico de Fusarium como organismos celulares eucariotes.

Reino Subreino Phylum Subphylum Clase Subclase Orden Familia Género

Fungi Dikarya Ascomycota Pezizomycotina Sordariomycetes Hypocreomycetidae Hypocreales Nectriaceae Fusarium

La identificación morfológica de F. culmorum y de otros hongos emparentados se basa en la forma de los macroconidios los cuales son relativamente cortos y sólidos, monofilíados, ramificados, cortos y anchos. Los macroconidios tienen paredes gruesas y curvadas y de 3 a 5 septos, y miden entre 30 a 50 µm de largo por 5.07.5 µm en su parte mas ancha. No se desarrollan microconidios, pero si se forman clamidosporas ovales a globosas, intercalares en las hifas, solitarias, en cadenas o en grupos. En medios de cultivo sólidos, como por ejemplo el Agar Papa Dextrosa (PDA) la colonia crece muy rápidamente (1.6-2.2 cm/día) a se temperatura óptima de 25°C. Como se observa en la Figura 3, el color del micelio en PDA es blanquecino, amarillo claro o rojo (Sherm et al., 2013). 13

a)

b)

Figura 3. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium culmorum. a) Placa de PDA con crecimiento algodonoso y de color rosáceo de F. culmorum, b) Macroconidios septados de forma fusiforme (Pancaldi, 2010). Por otra parte, cepas fitopatógenas y no fitopatógenas de F. oxysporum se a)

b)

Figura 4. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium oxysporum a) Placa de PDA con crecimiento algodonoso púrpura de F. oxysporum, b) Macroconidios septados de forma fusiforme y microconidios. (Sogra Fathima Musavi, 2013). encuentran en suelos de todos los continentes. Las cepas patógenas causan marchitez y pudrición en raíces en diferentes especies de plantas de importancia agrícolas siendo las cucurbitáceas, tomate y plátano los mayormente afectados, aunque también puede infectar cereales (Dam et al., 2017). Este hongo produce conidióforos cortos con crecimiento lateral al micelio. Como se observa en la Figura 4, los macroconidios son fusiformes levemente curveados, miden entre 23 y 54 µm de largo por 3 a 4.5 µm en su parte más ancha y comúnmente están septados en 14

tres secciones. Los microconidios son abundantes, nunca se encuentran en cadenas, comúnmente no se encuentran septados, cilíndricos o elipsoides, derechos o curveados miden entre 5 y 12 µm de largo x entre 2.3 y 3.5 µm de ancho. Las clamidiosporas son terminales, intercalares, hialinas, pared rugosa o lisa. La temperatura óptima crecimiento del hongo oscila entre 28 y 30°C, no obstante, también es capaz de crecer e infectar a temperaturas de 14°C ( Durbin et al., 1988). Las colonias del hongo presentan crecimiento radial en forma de micelio algodonoso blanquecino en los primeros estadios de crecimiento y posteriormente produce una coloración púrpura. F. equiseti es un hongo saprofito, ubicuo en suelos con climas subtropicales o tropicales, se relaciona con muerte o marchitez en raíces de plantas frutales. También afecta a un rango muy amplio de plantas de uso agrícola, pero también se ha encontrado en cereales durante el invierno en Europa y Norteamérica. Los metabolitos secundarios y micotoxinas producidos por F. equiseti varían en concentración de su toxicidad. Como se observa en la Figura 5, los macroconidios de esta especie son cortos usualmente, pero pueden presentar en la parte apical del macroconidio un corto o largo desarrollo. Cuando las cepas crecen en plantas de arroz producen tricotecenos, nivalenol, zearelona y equisetina. Sus colonias son algodonosas y tienen un rango gradual de colores desde blanco o cremoso hasta amarillas y color durazno que cambian conforme transcurre el tiempo del cultivo. En el anverso de la placa presenta una coloración amarilla (Kosiak et al., 2004).

a)

b)

15

Formatted: Highlight

Figura 5. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium equiseti a) Placa de medio PDA con crecimiento algodonoso naranja de F. equiseti, b) Macroconidios septados de forma fusiforme ( Elzbieta Kosiak, 2004).

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

F. fujikuroi es un hongo saprófito que comúnmente se asocia a la enfermedad del “bakanae del arroz”. El hongo produce ácido gibeirélico, una fitohormona que deforma el grano de arroz. Además del arroz, el hongo se ha encontrado en la caña de azúcar y el maíz. Como la mayoría de los hongos filamentosos, en medio de cultivo sólido su crecimiento es radial, exhibe una textura algodonosa cuyo color varía con la edad del cultivo, iniciando con una coloración blanquecina hasta terminar con un color púrpura o rosa. Los macroconidios son rectos o curveados, con entre 3 y 7 septos, los cuales algunas veces tienen estrechamientos dorsiventrales en ambos extremos miden de 25 a 60 µm de largo por entre 2.5 y 4 µm de ancho. También desarrolla microconidios de 5 a 12 µm de largo por 1.5 a 2.5 µm de ancho organizados en cadenas moniliformes sobre monofiálides (Mousa et al., 2017). a)

b)

Figura 6. Morfología macroscópica y microscópica de Fusarium fujikuroi a) Placa de medio PDA con crecimiento algodonoso morado de F. fujikuroi, b) Macroconidios septados de forma fusiforme (Mousa et al., 2017). La fuente de este pie de figura es tamaño 11 y las otras están de 12, hay que homogeneizar!!!

1.3. Estrategias de control contra hongos en cereales La producción de cereales pretende limitar el deterioro o pérdida total del producto a causa de las infecciones mediadas por hongos fitopatógenos. Se han implementado centros de monitoreo que cuentan con bancos de germoplasma con ejemplares de

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Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

plantas que expresan diferentes niveles de resistencia hacia las enfermedades. Los análisis QTL (Quantitative Trait Loci) buscan reconocer los genes implicados en la resistencia a la infección con el propósito de transferirlos a variedades sensibles que tienen características comerciales relevantes (Buerstmayr et al., 2009). El rastrojo de trigo que se queda como un subproducto de la actividad agrícola incrementa la prevalencia de formas infectivas de hongos. Por este motivo, la rotación de cultivos apropiada, como la que se ilustra en la Figura 7, es recomendable. De esta manera, cultivos de leguminosas como los chícharos pueden ser sembrados inmediatamente después de una temporada se siembra de trigo, sobre todo si se detectaron infecciones de las plantas por Fusarium. Por esta misma lógica, no es conveniente cultivar maíz seguido de una cosecha previa de trigo debido a que esta gramínea también es susceptible al hongo (Fernández et al., 2007; Krebs et al., 2005). Los fungicidas químicos foliares son comúnmente usados de manera preventiva cuando existe un riesgo de infección por Fusarium, es decir cuando existen condiciones climáticas con temperaturas y humedad elevadas. Entre los fungicidas químicos comerciales disponibles para el control de la enfermedad se encuentran Caramba®, Folicur®, Proline®, Prosaro® (Jeannie et al., 2011).

Commented [Office2]: Esta figura me parece irrelevante ya que no se me hace informativa.

Figura 7. Rotación de cultivos en parcelas. (Tomada de Larson, 2017). 17

La alternativa al uso de fungicidas químicos más viable y amable con el ambiente es el biocontrol utilizado microorganismos antagónicos de los fitopatógenos que no afecten a la planta (Figura 8) (Inch and Gilbert et al., 2007). Trichoderma harzianum o Clonostachys rosea es el hongo antagonista más estudiado y utilizado para el biocontrol de enfermedades causadas por Fusarium. Este hongo ha sido sido la utilización de que ha sido capaz de reducir las infecciones en planta, mazorca y redujo niveles de deoxynivalenol (DON), aunque no fue mayor con respecto el fungicida tebuconazol (Xue et al., 2009). No se

a)

b)

entendía tu súper oración, dime si no cambié la idea.

Figura 8. Biocontrol de Curvularia oryzae por Trichoderma harzianum. a) C. oryzae b) C. oryzae (izquierda) con T. harzianum (derecha) donde se observa la disminución del crecimiento del hongo (Sunpapao, 2018).

1.4. Microorganismos endófitos Las plantas establecen con los microorganismos de su entorno asociaciones mutualistas, comensales o antagonistas. Como ilustra la Figura 9, estas asociaciones pueden ubicarse en la rizosfera o área de influencia de la raíz; en el rizoplano o superficie de la raíz; o dentro de los tejidos de la planta, en cuyo caso hablamos de organismos endófitos. Desde que el botánico alemán Heinrich Friedrich Link descubrió a los hongos endófitos en 1809, esta asociación plantamicroorganismos se ha estudiado buscando cuál es la contribución de cada participante en la simbiosis. El término endófito se refiere a todo aquel organismo que es capaz de vivir dentro de los tejidos de una planta sin causar daño alguno

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aparente. Entre los endófitos se encuentran bacterias, hongos y nemátodos (Singh et al., 2019). Algunas bacterias endófitas juegan un papel importante promoviendo el crecimiento de las plantas a través de hormonas como el AIA (Ácido Indol Acético), fijación de nitrógeno, entre otros mecanismos (Cho et al., 2007). Varias especies de hongos endófitos se asocian con la raíz de las plantas formando micorrizas, esta simbiosis amplía significativamente el área radicular y superficie de contacto de la planta con el suelo y ayuda a la adquisición de nutrientes como el fosfato, un elemento que frecuentemente es escaso o se encuentra inaccesible formado sales inorgánicas insolubles (Hardoim et al., 2015).

Figura 9. Localización de microorganismos rizosféricos, del rizoplano y endófitos en la raíz de una planta. (Tomada de Hardoim et al., 2008). Modifica la figura poniendo flechas y títulos en español!!! Los endófitos se han clasificado como obligados si estos requieren el tejido de la planta para completar su ciclo de vida. Por otra parte, los microorganismos oportunistas o “epifitos” viven en la superficie de la planta y esporádicamente entran 19

a ella. En los polos podemos descubrir una brecha donde se alojan los facultativos encargados de consumir los nutrientes que les proveen las plantas. La relación que guardan los endófitos en el control de fitopatógenos se debe a los mecanismos que ostentan como: producción de sideróforos, producción de enzimas líticas, producción de compuestos volátiles, producción de ácido cianhídrico, así como síntesis de antibióticos (Hardoim et al., 2015). 1.4.1. Metabolitos secundarios, bacteriocinas y sideróforos de bacterias endófitas

La biosíntesis de diferentes metabolitos secundarios depende de las condiciones ambientales bióticas y abióticas a las que el microorganismo productor está expuesto. Así por ejemplo la biosíntesis de metabolitos suele estar asociada a la fase estacionaria de crecimiento cuando los nutrientes empiezan a escasear (Meyer et al., 2016). Una gran diversidad de metabolitos secundarios con diversas actividades biológicas ha sido descubierta (Figura 10). Sin embargo, el papel que juegan los metabolitos secundarios con capacidad antimicrobiana no está claro aún. Aunque parece evidente que podrían conferir ventajas competitivas al microorganismo productor, esta antibiosis no ha sido demostrada claramente que ocurra en el suelo ya que no se alcanza a acumular la concentración mínima inhibitoria. Además, fenómenos de adsorción de las moléculas a sustratos inertes del suelo disminuyen la concentración efectiva (Bacon et al., 2015). Recientemente, se ha destacado el papel antibióticos en fenómenos de comunicación química entre microorganismos (Romero et al., 2011). Muchos microorganismos rizosféricos y endófitos tienen la capacidad de sintetizar metabolitos con actividad antimicrobiana. Algunas especies de Pseudomonas como Pseudomonas protegens y Pseudomonas fluorescens producen metabolitos con actividad antifúngica como el DAPG (2,4-diacetypholoroglucinol) y el pyoluteorina (Yan et al., 2017). También especies endófitas de Bacillus y Paenibacillus producen lipopéptidos con capacidad antifúngica (Gond et al., 2015; Zhao et al., 2015). El antagonismo entre bacterias también puede ocurrir a través de bacteriocinas, que son péptidos antimicrobianos que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. 20

Se cree que la capacidad para sintetizar bacteriocinas le confiere una ventaja selectiva al microorganismo productor, quien si inhibe a otros organismos competiría favorablemente para ocupar el nicho ecológico. Se ha estimado que el 99% de las bacterias cuentan con bacteriocinas. También podrían tener un papel en la protección en plantas. Así por ejemplo, Pseudomonas putida BW11M1, proveniente de la raíz de una planta de plátano, produce una bacteriocina ( putadicin T01) la cual inhibe a la bacteria patógena P. putida GR-12-2R3. Otro ejemplo es la bacteriocina BAC14B producida por Bacillus subtilis 14B que es eficiente combatiendo a Agrobacterium tumefaciens, agente etiológico de la “corona de las agallas”. También la bacteriocina (Bac GM17 ) de Bacillus clausii posee actividad antibacteriana y antifúngica (Tyc et al., 2017).

Figura 10. Diversidad química de metabolitos secundarios y compuestos volátiles. (Tomada de Tyc et al., 2017).

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Por otra parte, los sideróforos son moléculas quelantes de bajo peso molecular y que poseen una alta afinidad a iones metálicos. Estas moléculas solubilizan, transportan y almacenan al ion, limitando la disponibilidad del ion Fe+2 a otros microorganismos que lo requieran como cofactor para sus funciones enzimáticas. Asimismo, la pioverdina de Pseudomonas flourescens es un sideróforo que tiene utilidad para el biocontrol de hongos fitopatógenos (Santacruz et al., 2012). 1.5. El maíz (Zea mays) como cultivo agrícola

El maíz es un grano básico que se cultiva en la mayor parte del territorio nacional, se utiliza para consumo humano y también para alimentar animales, ya sea directamente o como parte de la formulación de productos (CONABIO, 2010). El maíz es un cultivo de crecimiento rápido cuya temperatura ideal de crecimiento oscila entre 24°C a 30°C. La preparación de suelos es primordial ya que el maíz se puede adaptar a una amplia variedad de suelos donde puede producir buenas cosechas empleando variedades adecuadas del maíz y técnicas de cultivos apropiadas (Figura 11). En comparación con otros cultivos, el maíz se adapta bastante bien a la acidez o alcalinidad del terreno. Puede cultivarse con buenos resultados entre pH 5.5 y 7.0 aunque el óptimo corresponde a una ligera acidez (pH entre 5.5 y 6.5) (CONABIO 2010).

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Figura 11. Cultivo de maíz en Tizimín Yucatán México. (Tomada de Orduña, 2014).

1.5.1. El maíz raza Jala Esta variedad de maíz se da en el municipio de Jala, Nayarit, México, se caracteriza por tener mazorcas mayores a 45 cm, la planta se desarrolla con una altura en promedio de 6 metros y cada mazorca contiene entre 700 y 1000 granos (Figura 12). La conservación de esta raza de maíz entre los pobladores se debe a la mezcla de variedades de germoplasmas criollos (Elizabeth et al., 2016). Actualmente es sembrada en pequeñas superficies en el Valle de Jala, donde se ha

estado ampliando también el uso de variedades mejoradas. Se considera que la persistencia de su cultivo ha sido favorecida por una mezcla de orgullo y pragmatismo. Esta raza está adaptada para crecer en condiciones de suelos fértiles, humedad relativa, temperaturas elevadas por largo tiempo, sin embargo, si es plantada en otros lugares que no son el valle de Jala, no expresa todas sus características. El maíz Jala no es un criollo común y corriente, está catalogado como una raza porqué sólo se da en este territorio del valle de Jala, que por su suelo volcánico tiene propiedades distintas a otras regiones y esta inadaptabilidad es desfavorable; su principal aportación es la característica para el consumo elotero, es de sabor dulce y mazorcas grandes, estas miden entre 50-60 cm de longitud. (Kempton et al., 1994).

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Figura 12. Planta y mazorca de maíz raza Jala. (Tomada de Prensa CONACyT, 2016).

1.5.2. El maíz raza Conejo

El maíz raza Conejo es autóctono de algunos estados de México (Oaxaca, Guerrero, Michoacán) se caracteriza por su tamaño y su tiempo de maduración es corto. Las mazorcas son delgadas y semicilíndricas (Figura 13), de diferentes colores, pero principalmente blanquecino (Benz ,1986). Debido a su precocidad es de los primeros que producen elotes y grano, y por lo tanto su producción permite esperar otras variantes de maíces tardíos en las regiones donde se cultiva (CONABIO 2010).

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Figura 13. Mazorca de maíz raza Conejo su tamaño varía entre los 18-20 cm presenta un color blanquecino (CONABIO, 2010).

2. Antecedentes 

En 2014 Vivian Jawsky Szilagyi-Zecchin et al. aislaron bacterias endófitas provenientes de raíces de (Zea mays L.) identificando a Enterobacter asburie. y Bacillus pumilus, estas bacterias presentaron características como capacidad para fijar nitrógeno molecular, producción de sideróforos, AIA y enzimas líticas. Bacillus pumilus presentó antagonismo contra hongos fitopatógenos.



En 2015 Walaa K. Mousa et al. buscaron endófitos en teosinte (maíz ancestral) debido a su resistencia a enfermedades fúngicas comparadas con el (maíz hibrido común), obteniendo 215 aislados de los cuales destacaron Paenibacillus polymyxa y Citrobacter sp. los cuales mostraron reducción a la producción de micotoxinas producidas por Fusarium graminearum.



En 2016 Alejandro Miguel Figueroa-López et al. aislaron 11,520 bacterias nativas de (Zea mays L). y exploraron su capacidad de antagonizar a Fusarium verticilloides que causa daño al maíz. Encontraron 42 cepas bacterianas de los género Bacillus, Pseudomonas y Paenibacillus que redujeron hasta un 45% la infección causada por F. verticilloides. La actividad 25

antagónica de las cepas fue derivada de su producción de glucanasas, quitinasas, proteasas, sideróforos y auxinas. 

En los años 2015 y 2016, Guerra-Camacho y, Villagómez-Garfias, respectivamente, aislaron, caracterizaron e identificaron una colección de bacterias endófitas y rizosféricas de diferentes razas de maíces nativos de México, mismas que fueron clasificadas como PGP

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3. Justificación

Las enfermedades fúngicas en plantas ocasionan graves pérdidas económicas a nivel mundial, la manera de combatir este daño es por medio de la aplicación de fungicidas químicos de alto costo y que alteran las comunidades microbianas del suelo, así como modifican la estabilidad del suelo fértil llegando a provocar erosiones irreversibles. Por esto se pretende buscar nuevos mecanismos de protección para las plantas evitando la perturbación de las comunidades microbianas autóctonas que por sí mismas fungen un papel importante en la inhibición de estos antagonistas, se pretende maximizar estos mecanismos bloqueando los factores de patogenicidad y estructuras de reproducción ya que están involucrados en las principales vías de infección. En la actualidad se han investigado nuevas alternativas que mejoren la producción agrícola como lo son biofertilizantes, modificación genética de plantas resistentes a enfermedades, nuevas metodologías en la siembra-cosecha que disminuyan las

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péerdidas por malas labranzas o mediante el estudio de microorganismos autóctonos que por sí solos muestran la destreza de inhibir microorganismos fitopatógenos.

4. Hipótesis La aplicación de bacterias endófitas provenientes del entorno del maíz raza Jala al modelo Zea mays raza Conejo potenciará la capacidad de la planta de protegerse contra hongos fitopatógenos necrotróficos del género Fusarium, permitiéndonos predecir que las cepas mas eficientes tendrán los siguientes rasgos fenotípicos: 

La producción de celulasas, quitinasas y proteasas



La producción de sideróforos, ácido cianhídrico



Inhibirán el crecimiento de hongos fitopatógenos



Protegerán a nivel semilla y planta del ataque de hongos fitopatógenos

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5. Objetivos Objetivo general Diseñar una alternativa de control de enfermedades fúngicas en maíz con bacterias endófitas provenientes del maíz raza Jala

Objetivos particulares



Determinar la actividad antifúngica, inhibición del crecimiento, producción de celulasas, producción de proteasas y producción de ácido cianhídrico de cepas bacterianas aisladas de la rizosfera del maíz raza Jala.



Evaluar la producción y cuantificación de quitinasas y sideróforos en una colección de cepas aisladas de la rizosfera del maíz raza Jala.

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

Estimar el grado de protección fúngica in vitro e invernadero bajo condiciones controladas.

6. Material y métodos Esquema general de trabajo Material biológico Cepas bacterianas endófitas del maíz raza Jala Cepas fúngicas fitopatógenas aisladas de tejido vegetal infectado

Pruebas fenotípicas bacterianas Pruebas de inhibición Inhibición placa bacterias contra hongos fitopatógenos Producción de en celulasas y Producción de quitinasa, proteasas sideróforos y HCN Pruebas a nivel in vitro e in vivo Control fúngico a nivel planta Control fúngico a nivel semilla

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6.1. Material biológico Microorganismos

Clave

Rhizobium pusense

Z3HL3

Stenotrophomonas maltophiia

E2BL4

Crysobacterium gleum

Z1HL3

Achromobacter xilosoxidans

Z3AD5a

Serratia marcescens

Z1AD10

Pseudomonas protegens

E1BL2

Ochrobactrum anthropi anthropi

Z1AD1

Ochrobactrum anthropi

Z1AD2

Bacillus subtilis

160

Las cepas bacterianas provinieron de la colección microbiana del laboratorio de Biología Molecular de Bacte rias y Levaduras de la ENCB-IPN. Esta colección fue aislada a partir de los tejidos del maíz raza Jala e identificadas mediante la amplificación y secuenciación del gen 16SrRNA previamente por Guerra-Camacho (2015); Villagómez-Garfias (2016) y Ríos-Galicia (2017). La primera letra del código de la cepa corresponde al tipo de muestra de donde se aisló (E, endófito de grano; Z, endófito de raíz; R, rizósfera). El número siguiente corresponde al número de muestra. La tercera letra corresponde al medio en donde fue aislada (A, Haahtela; B, Bridges; K, Baz; W, Winogradsky; H, Haathela). La cuarta identifica la estrategia de aislamiento (D, directo; L, enriquecimiento) y la última posición corresponde al número del aislado. Se proporcionó una cepa con actividad

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antagónica proveniente de la Benemérita Universidad de Puebla (BUAP) . La cepa de Bacillus subtilis 160 fue gentilmente proporcionada por la Dra. Yuridia Mercado Flores y la ¿??

Formatted: Highlight

Las cepas fueron recuperadas mediante siembra en medio LB y se incubaron a 28ºC por 48 h y posteriormente se ajustaron a una D.O a 600 nm de 0.8 para experimentos posteriores.

Microorganismos

Clave

Fusarium oxysporum

4HT04

Fusarium fujikuroi

10HCH3

Fusarium equiseti

Fusarium culmorum

2HCH5

AIRB1

Las cepas F. oxysporum, F. equiseti, F. fujikuroi provienen de la colección microbiana del Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG) ubicado en Tepatitlán Jalisco y fueron gentilmente proporcionadas por le Dr. Ramón Ignacio Arteaga Garibay. Las cepas fueron identificadas previamente por criterios fenotípicos y mediante la amplificación del gen 18SrRNA. La cepa F. culmorum proviene de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP) y fue gentilmente proporcionada por la Dra. Yuridia Mercado Flores.

Yuridia está en la Universidad Politécnica de Pachuca, pero dona cepas de la BUAP? Es correcto? Los hongos filamentosos fueron recuperados mediante siembra en placas de PDA e incubados a 28ºC por 48 h y ajustados a 106 conidios/mL de PBS al 4% para experimentos posteriores.

6.2. Evaluación cualitativa de la producción de celulasas

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Formatted: Indent: First line: 0.49"

La actividad fue evaluada utilizando el protocolo descrito por Kasana y colaboradores (2008), mediante la observación de la formación de halos de hidrólisis en medio CMC-Rojo Congo (carboximetilcelulosa-agar). A partir de una suspensión celular ajustada a una D. O. a 600 nm de 0.8, se inocularonóculo 5 µL de las cepas bacterianas a probar en el medio CMC-rojo Congo y se incubaron a 28ºC por 48 h. La visualización de los halos de hidrólisis se llevó a cabo mediante la adición de NaCl 1M al medio y se adicionaron 5 gotas (aproximadamente 200 µL) de ácido acético 3%. La hidrólisis de la celulosa fue detectada mediante la formación de halo de hidrólisis de color púrpura. El índice de hidrólisis de la celulosa fue determinado mediante la siguiente fórmula:

Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = 𝐷𝐶 − 𝐷𝐻 Donde DC es diámetro de la colonia y DH es diámetro de halo.

6.3. Evaluación cualitativa de producción de proteasas

La actividad fue evaluada utilizando el protocolo descrito por Chu y colaboradores (2007). Mediante la observación de la formación de halos de proteólisis de la caseína en medio SM (Skim Milk). A partir de una suspensión celular ajustada a una D. O. a 600 nm de 0.8, se inocularon 5 µL de las cepas bacterianas a probar en medio SM y se incubaron a 28ºC por 48 h. La visualización de proteólisis de la caseína se evaluó mediante la formación de halos claros. Para calcular el índice de proteólisis de la caseína se efectuó la siguiente fórmula :

Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = 𝐷𝐶 − 𝐷𝐻 Donde DC es diámetro de la colonia y DH es diámetro de halo.

6.4. Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de quitinasas La actividad quitinolítica se llevó a cabo mediante el protocolo descrito por Kuddus y colaboradores (2013). Se preparó medio QC (Quitina Coloidal) para bacterias, posteriormente se inocularon 5 µL de una suspensión de bacterias ajustadas a una 32

D.O a 600 nm de 0.8 y se incubaron a 28ºC por 4 días. La actividad enzimática se observó como halos de hidróolisis de la quitina. Asimismo, matraces con medio

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mineral más QC y se inocularon con 500 µL de la suspensión de bacterias y se dejó

Formatted: Highlight

en agitación a 120 rmp a 28ºC por 6 días. Después, se tomó una alícuota de 1 mL del sobrenadante se tomó y se le añadió 1 mL de quitina coloidal al 10% suspendida en regulador de fosfatos 0.2 M, pH 6.5. La mezcla se dejó incubar a 50ºC durante 1 h en un baño metabólico para que el polisacárido fuera degradado. La reacción se detuvo con 1 mL de NaOH al 1%. La muestra anterior sDespués se centrifugó a 7000 rmp durante 10 min para separar la quitina remanente y se tomó 1 mL del sobrenadante para determinar los azúcares reductores formados. Para ello se mezcló el sobrenadante con 1 mL de DNS (3,5-dinitrosalicíilico) y luego se colocaron en ebullición por 5 min para desarrollar el color. Por último se enfrió al chorro de la llave y se diluyóo con 2 mL de agua destilada y se midió la absorbancia a 535 nm en un espectrofotómetro (Varian Cary 50). Los resultados se interpolaron en una curva tipo preparada con N-acetil-D-glucosamina (0-7.5 mM). La actividad fue expresada en unidades de quitinasa, siendo una unidad la cantidad de enzima que produce un µmol de NAG bajo las condiciones experimentales utilizadas. En algún lugar describes cómo se preapar el medio mineral de QC? 6.5. Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de sideróforos. Se estimó la producción extracelular de sideróforos mediante el protocolo de Chavan y colaboradores (2013) utilizando el medio Cromo Azurol S (CAS). Se inocularon 5 µL de las cepas bacterianas ajustadas a una D. O. a 600 nm de 0.8 en medio Cromo Azurol S. Las placas se incubaron a 28°C por 48 h y se determinó el diámetro del halo de quelación de los metales calcio, cobalto, magnesio, cobre y zinc. El desarrollo de un halo color amarillo muestra la producción de sideróforos. El índice de quelación se calculó utilizando la misma fórmula que para la evaluación cualitativa de quitinasas (sección 6.3). Posteriormente, en microplacas de 96 pozos se cuantificó la producción de sideróforos mediante el protocolo de Payne y colaboradores (1994) utilizando medio CAS líquido. Las cepas bacterianas fueron cultivadas en medio LB sin extracto de levadura por 48 h a 28°C. Después de la incubación, se tomaron alícuotas de 1 mL y se centrifugaron a 13,000 rpm por 15 min. Un total de 100 µL del sobrenadante se 33

mezclaron con 100 µL de la solución de CAS y se dejó reaccionar por 20 min a temperatura ambiente (24°C aproximadamente). Posteriormente se leyó la absorbancia a 630 nm. Para las determinaciones se empleó el medio de cultivo como blanco y las unidades del porcentaje de quelación fueron calculadas mediante la siguiente fórmula: Porcentaje de quelación (%) = [(Ar-Am) /Ar] x 100 Dónde Ar= Absorbancia de referencia (Medio CAS sin inocular), Am (absorbancia de la muestra problema).

6.6. Prueba en placa de inhibición del crecimiento en placa deen hongos filamentosos La capacidad de las bacterias aisladas para inhibir el desarrollo fúngico se realizó siguiendo el protocolo descrito por El-Sayed y colaboradores (2014). Se inocularon 5 µL de una suspensión de bacterias ajustadas a una D. O. a 600 nm de 0.8 en medio PDA (papa dextrosa agar) colocando el inóculo bacteriano en la periferia de un bocado de micelio de los siguientes hongos: Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, y Fusarium fujikuroi. Las placas sSe incubaron las placas a 28ºC por 5 días. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se observaron los efectos inhibitorios del crecimiento fúngico micelial de las bacterias.

6.7. Estimación de producción de ácido cianhídrico La capacidad de producción de ácido cianhídrico de las bacterias potencialmente antagónicas de hongos se realizó con apego al protocolo descrito por Naveen y colaboradores (2006). Brevemente descrito, en placas de TSA (agar soya tripticaseína) suplementadas con 4.4 % de glicina se sembraron masivamente las cepas bacterianas. Los testigos positivo y negativo de producción de ácido cianhídrico fueron Pseudomonas protegens E1BL2 y Ochrobactrum anthropi Z1AD1 respectivamente. También se utilizó una placa sin inocular como control. En la cara interna de la tapa de una caja Petri se colocó un papel filtro impregnando con ácido pícrico (1%) y Na2CO3 (10%)., Las cajas se cubrieron con parafilm para limitar la 34

pérdida del compuesto volátil y se incubaron a 28°C por 48 h. La producción de ácido cianhídrico se observóo con el cambio de coloración de amarillo a naranja donde el ácido pícrico es reducido por el ácido cianhídrico presente en el medio.

6.8. Prueba de protección de la germinación en semillas de maíz in vitro

Las semillas de maíz se desinfestaron agitándolas vigorosamente en una solución de hipoclorito de sodio al 5.0% durante 10 min. Posterior a este tratamiento, las semillas se lavaron con agua destilada estéril dos veces durante 1 min. Después se colocaron en agitación a temperatura ambiente (24ºC aproximadamente) durante 4 h. Por último, se efectuó un choque térmico en agua destilada estéril a 60ºC por 5 min en agitación, y después fueron colocadas en agua fría a 4ºC aproximadamente. La capacidad de la cepa con actividad antifúngica para proteger la germinación de las semillas de maíz raza Conejo se realizó como se describen de Borah y colaboradores (2016). Las semillas fueron sumergidas en matraces de 250 mL conteniendo 50 mL de la suspensión ajustada de bacterias a una D. O. a 600 nm de 0.8 y se mantuvieron en agitación por 12 h. Un grupo de semillas fueron sometidas al mismo tratamiento pero con solución salina en lugar de la suspensión bacteriana. Se colocaron tres semillas por placa con agar agua al 3%, al tiempo que se agregaron 100 µL de conidios (106 conidios/mL) por semilla de los siguientes hongos: F. oxysporum, F. equisetii, F. fujikuroi, F. culmorum. Las placas fueron incubadas a 28ºC por 10 días. La inhibición de la germinación por las especies de Fusarium fue evaluada en una escala de 18 puntos (Borah et al., 2016). El criterio de asignación de puntos fue el siguiente (a) sin germinación y presencia de micelio 0 puntos, (b) germinación mostrando micelio en la corteza y radícula 1 punto, (c) germinación sin presencia de micelio y presencia de síntomas 2 puntos, (d) germinación y observación de semilla saludable 3 puntos. Con un total de 18 puntos se asignaron a 6 semillas por tratamiento siendo 18 el máximo nivel de inhibición. Se prepararon 50 mL de una suspensión bacteriana ajustada a 0.8 D.O 600 nm matraces de 500 mL en los cuales se colocaron 25 semillas de maíz raza Conejo para llevar acabo el recubrimiento superficial de la semilla con la bacteria (seed35

coating), asimismo se decantó la suspensión y se dejaron secar las semillas por 3 min. Estas semillas fueron las que se ocuparon para experimentos posteriores. Los datos fueron interpretados aplicando un análisis de varianza de dos vías (*, p < 0.0001) con el método Sidak de comparación múltiple con un nivel de confianza del 95% n= (3) usando el programa Prism version 6.00 para Windows, (GraphPad Software, La Joya California USA, www.graphpad.com).

6.9. Prueba de protección por infección de Fusarium en planta de maíz a nivel invernadero

La capacidad de P. protegens E1BL2 para proteger la infección de plantas de maíz raza Conejo se realizó e acuerdo al protocolo modificado de Leyva y colaboradores (2015). Tres bocados (7 mm diámetro) de micelio joven de F. culmorum AI1B1, F. oxysporum 4HT04, F. fujikuroi 10HCH3, y F. equiseti 2HCH5, posteriormente se colocaron como inóculos por separado en bolsas de plástico que contenían 100 g de maíz quebrado estéril con 40 mL de agua destilada. Las bolsas se incubaron por 14 días a 28ºC. Después de la propagación del hongo, un total de 55 g de la mezcla maíz/hongo fueron agregados a una bolsa de 1 kg que contenía una mezcla (1:10 p/p) de vermiculita estéril/maíz inoculado. Para inocular las plantas con las bacterias, las semillas desinfestadas se germinaron en agar agua y después de 3 días de germinación fueron sumergidas por 20 min en una suspensión de solución bacteriana ajustada a una D. O. a 600 nm de 0.8. Posteriormente, cinco semillas se secaron y colocaron por tratamiento. Las semillas de maíz raza Conejo se desinfestaron de la misma manera que en el experimento anterior (sección 6.8). Los tratamientos fueron los siguientes; P. protegens E1BL2 + F. culmorum AI1B1; P. protegens E1BL2 + F. oxysporum 4HT04; P. protegens E1BL2 + F. fujikuroi 10HCH3; P. protegens E1BL2 + F. equiseti 2HCH5; B. subtilis 160 + F. culmorum AI1B1; B. subtilis 160 + F. oxysporum 4HT04; B. subtilis 160 + F. fujikuroi 10HCH3; B. subtilis 160 + F. equiseti 2HCH5; O. anthropi Z1AD1 + F. culmorum AI1B1; O.

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anthropi Z1AD1 + F. oxysporum 4HT04; O. anthropi Z1AD1 + F. fujikuroi 10HCH3; y O. anthropi Z1AD1 + F. equiseti 2HCH5. Asimismo, plantas tratadas únicamente con las cepas P. protegens E1BL2, B. subtilis 160, y O. anthropi Z1AD1 fueron sembradas como controles de daño/beneficio a la planta. Así también, tratamientos con las cepas F. culmorum AI1B1, F. oxysporum 4HT04, F. fujikuroi 10HCH3, y F. equiseti 2HCH5 fueron incluidos como controles negativos. Los diferentes tratamientos se colocaron a 28ºC ± 2°C con fotoperiodos de luz solar por 50 días, se tomaron la altura de tallo y raíz, así como peso en fresco de tallo y raíz y peso seco de tallo y raíz. Se observaron también síntomas de infección en los tratamientos desinfectando el tejido vegetal donde se presenta el signo. Los datos fueron interpretados aplicando un análisis de varianza de dos vías (*, p < 0.0001) con el método Sidak de comparación múltiple con un nivel de confianza del 95% n= (3) usando el programa Prism version 6.00 para Windows, (GraphPad Software, La Joya California USA, www.graphpad.com).

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7. Resultados

7.1. Evaluación cualitativa de producción de celulasas La actividad celulolítica de las cepas bacterianas observada en medio CMC-rojo Congo se estimó como halos de hidrólisis en la Figura 14, donde se observa que la cepa R. pusense Z3HL3 fue la que desarrolló el mayor halo de hidrólisis, más grande incluso que el observado en la cepa de B. subtilis 160 usada testigo positivo. Con los datos de todas las cepas se estimó el índice de hidrólisis que se muestra en la Figura 15, de donde se observa que todas las cepas exhibieron diferentes grados de actividad celulósicaproteolítica.

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Figura 14. Halos de hidrólisis de celulosa en medio CMC-rojo Congo. (1) S. maltophilia E2BL4, (2) A. xiloxosidans Z3AD5a, (3) C. gleum Z1HL3, (4) R. pusense Z3HL3, (5) O. anthropi Z1AD1, (6) O. anthropi Z1AD2, (7) S. marcescens Z1AD10, (8) P. protegens E1BL2, (9) B. subtilis 160. Las cepas fueron inoculadas hacia la derecha.

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*

Figura 15. Índices de hidrólisis de la celulosa en placa de cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. S. maltophilia E2BL4, A. xiloxosidans Z3AD5a, C. gleum Z1HL3, R. pusense Z3HL3, O. anthropi Z1AD1, O. anthropi Z1AD2, S. marcescens Z1AD10, P. protegens E1BL2, B. subtilis 160. Ponlas en el orden en que parecen en la figura. B. subtilis 160 fue empleada como testigo positivo. La cepa R. pusense Z3HL3 muestra diferencia significativa comparándola con el control B. subtilis 160. Los datos fueron interpretados aplicando un análisis de varianza de dos vías (*, p < 0.0001) con el método Sidak de comparación múltiple con un nivel de confianza del 95% n= (3) usando el programa Prism version 6.00 para Windows, (GraphPad Software, La Joya California USA, www.graphpad.com).

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Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

7.2. Evaluación cualitativa de producción de proteasas La actividad proteolítica en medio SM de las cepas empleadas se observa como halos de hidrólisis de la caseína del medio en la Figura 16. Todas las cepas exhibieron capacidad proteolítica, pero la cepa R. pusense Z3HL3 fue la que

desarrolló el halo de proteólisis mayor, mientras que la cepa S. marcescens Z1AD10 presentó el menor. El índice de proteólisis se muestra en la Figura 17.

Figura 16. Halos de proteólisis de la caseína en medio SM de cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. (1) S. maltophilia E2BL4, (2) A. xiloxosidans Z3AD5a, (3) C. gleum Z1HL3, (4) R. pusense Z3HL3, (5) O. anthropi Z1AD1, (6) O. anthropi Z1AD2, (7) S. marcescens Z1AD10, (8) P. protegens E1BL2, (9) B. subtilis 160.

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* *

Figura 17. Índices de hidrólisis de la caseína en placa de cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. La cepa B. subtilis 160 fue empleada como testigo positivo. La cepa R. pusense Z3HL3 muestra diferencia significativa positiva con el control B. subtilis 160 y la cepa S. marcescens Z1AD10 muestra diferencia significativa negativa comparándola con el control B. subtilis 160. Los datos fueron interpretados aplicando un análisis de varianza de dos vías (*, p < 0.0001) con el método Sidak de comparación múltiple con un nivel de confianza del 95% n= (3) usando el programa Prism version 6.00 para Windows, (GraphPad Software, La Joya California USA, www.graphpad.com).

7.3. Valoración cualitativa y cuantitativa de producción de quitinasas La actividad quitinolítica en medio QC de las cepas se observa como halos de hidrólisis en la Figura 18. Las cepas S. marcescens Z1AD10, P. protegens E1BL2 y destacadamente S. maltophilia E2BL4 fueron las únicas que crecieron e hidrolizaron la quitina del medio. Las cepas R. pusense Z3HL3, O. anthropi Z1AD1, O. anthropi Z1AD2, y A. xilosoxidans Z3AD5a crecieron en el medio pero no hidrolizaron la quitina, mientras que la cepa C. gleum Z1HL3 no creció en el medio.

41

Figura 18. Halos de hidrólisis de la quitina en medio QC de cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. (1) S. marcescens Z1AD10, (2) B. subtilis 160, (3) A. xilosoxidans Z3AD5a, (4) R. pusense Z3HL3, (5) O. anthropi Z1AD1, (6)P. protegens E1BL2, (7) S. maltophilia E2BL4, (8) O. anthropi Z1AD2.

Para la cuantificación de la actividad quitinolítica se realizó la curva tipo de la Figura 19 que arrojó una R2=0.9967. La ecuación de la recta se utilizó para cuantificar la actividad enzimática de las cepas como se ilustra en la Figura 20. También, como se muestra en la Figura 20, se realizó un ensayo cinético para determinar el tiempo en que la producción total de quitinasa era mayor. La cepa S. maltophilia mostró la mayor producción de enzima (0.84 U de qutinasa) a las 72 h. La cepa control B. subtilis 160 y los endófitos P. protegens E1BL2 y S. marcescens Z1AD10 produjeron entre 0.52 y 0.58 U de quitinasa a las 72 h.

42

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

1.4 1.2

Abs 535

1

y = 0.3043x - 0.0411 R² = 0.9967

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

1

2

NAG µM

3

4

5

Figura 19. Curva tipo de NAG (N-acetil glucosamina). (Miller, 1959).

7.1. Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de sideróforos. Como se observa en la Figura 21, la producción de sideróforos de las cepas en medio CAS se observó como un halo amarillo alrededor del crecimiento bacteriano. Las cepas A. xilosoxidans Z3AD5a y P. protegens E1BL2 mostraron la mayor actividad, aunque también el testigo B. subtilis 160 y las cepas S. maltophilia E2BL4, O. anthropi Z1AD1, y O. anthropi Z1AD2 produjeron sideróforos de magnesio. En la Figura 22 se presentan los índices de quelación para los iones calcio, magnesio, zinc, cobalto y cobre.

1 .2 1 .1 1 .0 0 .9

E2BL4

0 .8

NAG ( µM )

Z1AD 10 0 .7

B . s u b tillis E1BL2

0 .6

C o n tr o l n e g a tiv o 0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 0 .1 0 .0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T ie m p o ( h )

50

55

60

65

70

75

80

43

Figura 20. Cinética enzimática de quitinasas de cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. La cepa S. maltophilia produjo una cantidad mayor de quitinasa que la cepa control de B. subtilis 160. El resto de las cepas produjeron al final del experimento cantidades la misma cantidad de quitinasa que la cepa usada como testigo. Mueve la figura 20 después de la 19

7.2. Valoración cualitativa, y cuantitativa de producción de sideróforos. La producción de sideróforos de las cepas en medio CAS se observó como un halo amarillo como se observa en la Figura 21. Las cepas A. xilosoxidans Z3AD5a y P. protegens E1BL2 mostraron la mayor actividad, aunque también el testigo B. subtilis

160 y las cepas S. maltophilia E2BL4, O. anthropi Z1AD1, y O. anthropi Z1AD2 produjeron sideróforos de magnesio. En la Figura 22 se presentan los índices de quelación para los iones calcio, magnesio, zinc, cobalto y cobre.

44

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

Figura 21. Halos de producción de sideróforos para el ion magnesio en medio CAS. (1) R. pusense Z3HL3, (2) S. maltophilia E2BL4, (3) C. gleum Z1HL3, (4) B. subtillis 160, (5) A. xilosoxidans Z3AD5a, (6) P. protegens E1BL2, (7) S. marcescens Z1AD10, (8) O. anthropi Z1AD1, (9) O. anthropi Z1AD2.

Figura 22. Índices de quelación de los iones divalentes calcio, magenesio, zinc, cobalto y cobre en medio CAS. Las cepas A. xilosoxidans Z3AD5a y P. protegens E1BL2 presentaron una diferencia significativa positiva comparándolas con B. subtillis 160 empleada como testigo positivo, las cepas S. malthopilia Z3AD5a, O. anthropi Z1AD1, y O. anthropi Z1AD2 mostraron diferencia significativa comparándolas con B. subtilis 160 empleada como testigo positivo. Los datos fueron interpretados aplicando un análisis de varianza de dos vías (*, p < 0.0001) con el método Sidak de comparación múltiple con un nivel de confianza del 95% n= (3) usando el programa Prism version 6.00 para Windows, (GraphPad Software, La Joya California USA, www.graphpad.com).

7.3. Estimación cuantitativa de producción de sideróforos La cuantificación de la producción de sideróforos para los iones divalentes calcio, magnesio, zinc, cobalto y cobre en medio CAS líquido se llevó a cabo como se

45

muestra en la Figura 23. Los datos cuantitativos se muestran en la Figura 24, donde se observa que todas las cepas produjeron sideróforos para los metales ensayados.

Ca

Mg

Co

Zn

Z1AD10 B. subtilis 160

Z1HL3 E1BL2 Z3HL3 Z3AD5a

Sin inocular

Figura 23. Placa de 96 pozos inoculadas con sobrenadantes bacterianos de las cepas endófitas suplementados con medio líquido CAS y calcio, magnesio, cobalto, zinc y cobre. El código de color representa la cepa empleada y sus triplicados, S. marcences Z1AD10 (rojo), B. subtilis 160 (azul), C. gleum Z1HL3 (amarillo), P. protegens E1BL2 (morado), R. pusense Z3HL3, A. xilosoxidans Z3AD5a, testigo sin inocular (negro).

46

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

Figura 24. Índices de quelación de los iones divalentes calcio, magenesio, zinc, cobalto y cobre en medio CAS de las cepas bacterianas endófitas y la cepa B. subtilis 160. La cepa A. xilosoxidans Z3AD5a mostró una producción de sideróforos significativamente mayor que la cepa testigo de B. subtilis 160. Las cepas R. pusense Z3HL3 y C. gleum Z1HL3 produjeron menos sideróforos que la cepa testigo. Los datos fueron interpretados aplicando un análisis de varianza de dos vías (*, p < 0.0001) con el método Sidak de comparación múltiple con un nivel de confianza del 95% n= (3) usando el programa Prism version 6.00 para Windows, (GraphPad Software, La Joya California USA, www.graphpad.com).

7.4. Prueba de inhibición en placa en hongos filamentosos

Como se observa en la Figura 25 y Tabla 2, además de la cepa testigo de B. subtilis 160, P. protegens E1BL2 fue la única bacteria que inhibió el desarrollo filamentoso de los hongos F. fujikuroi 10HCH3, F. equiseti 2HCH5, F. oxysporum 4HT04 y F. culmorum AIRB1.

47

Formatted: Line spacing: Multiple 1.15 li

Formatted: Font: 13 pt, Bold

F. fujikuroi 10HCH3

F. oxysporum 4HT04

F. equiseti 2HCH5

F. culmorum AIRB1

Figura 25. Inhibición de las especies fitopatógenas del género Fusarium por las bacterias endófitas de maíz raza Jala y B. subtilis 160. B. subtilis 160 (circulo naranja); P. protegens E1BL2 (círculo rojo).

48

Tabla 2. Selección de bacterias con potencial antagónico contra especies fitopatógenas del género Fusarium se empleó a B. subtilllis 160 como control positivo. F. culmorum

F. oxysporum

F. equiseti

F. fujikuroi

AIRB1

4HT04

2HCH5

10HCH3

-

-

-

-

R. pusense Z3HL3

-

-

-

-

C. gleum Z1HL3

-

-

-

-

A. xilosoxidans

-

-

-

-

+

+

+

+

-

-

-

-

O. anthropi Z1AD1

-

-

-

-

O. anthropi ZAD2

-

-

-

-

B. subtilis 160

+

+

+

+

Hongos Bacterias S. maltophilia E2BL4

Z3AD5a P. protegens E1BL2 S. marcescens Z1AD10

El signo positivo (+) indica actividad inhibitoria, el signo negativo (-) indica la ausencia de actividad inhibitoria.

7.5. Estimación cualitativa de la producción de ácido cianhídrico Como se observa en la Figura 26a, la cepa P. protegens E1BL2 fue la única que cambió el color del papel impregnado con ácido pícrico de color amarillo a naranja, lo cual indica la producción de ácido cianhídrico debido a la reducción del ácido pícrico. Sin embargo, la cepa de O. anthropi Z1AD1 no fue productora de ácido cianhídrico como se constata en la Figura 26b.

49

a)

b)

Figura 26. Estimación cualitativa de la producción de ácido cianhídrico de Pseudomonas protegens E1BL2 y Ochrobactrum anthropi en medio TSAglicina. a) Pseudomonas protegens E1BL2 positiva a HCN papel filtro color naranja, b) Ochrobactrum anthropi Z1AD1 negativa a producción de HCN papel filtro color amarillo.

7.6. Ensayo de protección de semillas de maíz raza Conejo infectadas con conidios de especies fitopatógenas del género Fusarium por Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum antrophi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160. En la Figura 27 se muestran los resultados del ensayo de protección a la infección por Fusarium spp. de las semillas de maíz. Como se resume en la Tabla 3 y Figura 29, las cepas de P. protegens E1BL2, O. antrophi Z1AD1 y B. subtilis 160 mostraron altos puntajes de protección de la germinación. Los testigos mostraron que los conidios sin protección bacteriana mostraron un bajo puntaje y no permitieron la germinación adecuada de las semillas. Figura 30),

50

Figura 27. Ensayo de protección de semillas de maíz raza Conejo infectadas con conidios de especies fitopatógenas del género Fusarium por Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum antrophi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160.

51

Tabla

3.

Puntaje

de

protección

de

Pseudomonas

protegens

E1BL2,

Ochrobactrum anthropi Z1AD1 y Bacillus subtilis 160 a semillas infectadas con especies fitopatógenas del género Fusarium.

Muestra

Solución Salina (control positivo) Pseudomonas protegens E1BL2 B. subtilis 160 Ochrobactrum anthropi Z1AD1 Fusarium culmorum (control negativo) Fusarium oxysporum (control negativo) Fusarium fujikuroi (control negativo) Fusarium equiseti (control negativo) F. culmorum + E1BL2 F. culmorum +Z1AD1 F. culmorum + B. subtilis 160 F. oxysporum + E1BL2 F. oxysporum + Z1AD1 F. oxysporum + B. subtilis 160 F. fujikuroi + E1BL2 F. fujikuroi + Z1AD1 F. fujikuroi + B. subtilis 160 F. equiseti + E1BL2 F. equiseti + Z1AD1 F. equiseti + B. subtilis 160

Número de semillas (n) y puntaje obtenido. Semilla Semilla sin Semilla sin Semilla germinar germinada Total, de germinar germinada y con puntos y sin sana y sin recubierta micelio en obtenidos micelio micelio por la radícula por recubierto (puntaje= micelio (puntaje tratamiento (puntaje= n x 3) (puntaje n= x 2) n x 1) = n x 0)

1 1 1 5

6

18

5 5 5

17 16 17

1

1

6

0

5

1

4 3 3 3 1 2 1 1 2 3 1 4 2

2

1

2

1 1 1

2

3 3 1 5 4 2 4 4 2 5 2 4

2 9 9 10 15 12 11 13 12 7 15 6 12

52

Figura 28. Porcentaje de germinación de las semillas de maíz raza Conejo previamente protegidas de la infección de los hongos fitopatógenos del género Fusarium por las cepas endófitas Pseudomonas protegens E1BL2, Ochrobactrum anthropi Z1AD1 y la cepa testigo Bacillus subtilis 160.

7.7. Prueba de protección por infección de Fusarium en planta de maíz a nivel invernadero Las semillas fueron inoculadas con la técnica “seedcoating” con las cepas P. protegens E1BL2, O. antrhropi Z1AD1 y la cepa testigo B. subtilis y posterirmente infectadas con F. culmorum. En la Figura 29 se observa un ejemplo de los resultados del desarrollo donde se puede observar el efecto protector, desarrollo óptimo y sin evidencia de infección por Fusarium de la planta cuando se bioinoculó con la cepa P. protegens E1BL2. Asimismo las raíces de la planta se mostraron sanas como se aprecia en la Figura 30. Por otro lado, en la Figura 31 contrastan las plantas que fueron tratadas únicamente con solución salina que presentaron signos de infección fúngica y necrosis en la raíz. También se observaron, como se muestra en la Figura 32, síntomas de la infección por el necrosamiento de los entrenudos así como la marchitez temprana en el tejido foliar.

53

Figura 29. Prueba a nivel invernadero de protección con bacterias endófitas de

maíz raza Jala a plantas de maíz raza Conejo infectadas con Fusarium culmorum. a) Plantas tratadas con solución salina b) Plantas tratadas con la cepa O. antrhropi Z1AD1, c) Plantas tratadas con B. subtilis 160, d) Plantas tratadas con P. protegens E1BL2.

Figura 30. Raíz sana sin presencia de signos o síntomas de infección por Fusarium culmorum protegida por P. protegens E1BL2.

54

Figura 31. Raíz enferma con presencia de micelio y síntomas de infección y necrosis tratada con solución salina y Fusarium culmorum.

Figura 32. Síntomas de enfermedad fúngica por necrosamiento en entrenudo del tallo (a) y marchitez foliar temprana (b).

55

Las determinaciones de los pesos húmedo y seco y las longitudes de la raíz y el tallo de las plántulas de maíz de la raza Conejo sometidas a los diferentes tratamientos de protección después de 50 días de crecimiento en invernadero se muestran en las Figuras 33, 34, 35 y 36 respectivamente. En general, las cepas

Figura 33. Peso húmedo de las plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. nivel invernadero. El asterisco (*) sobre las barras representa diferencias significativas en comparación con el control B. subtillis 106.

56

Figura 34. Peso seco de las plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero. El asterisco (*) sobre las barras representa diferencias significativas en comparación con el control B. subtillis 106.

Figura 35. La longitud de raíz en plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero. El asterisco (*) sobre las barras representa la diferencia significativa en comparación con el testigo.

57

Figura 36. La longitud del tallo en plántulas de maíz raza Conejo de 50 días de crecimiento sometidas a diferentes tratamientos de biocontrol de las cepas endófitas y Bacillus subtilis 106 a la infección de Fusarium spp. a nivel invernadero.

El

asterisco (*) sobre las barras representa la diferencia significativa en comparación con el testigo.

58

8. Discusión Las bacterias provenientes de la rizosfera o dentro de los tejidos de las plantas proveen características idóneas para su investigación y aplicación biotecnológica. En este trabajo se exploró el potencial antagonista de una colección de bacterias endófitas del maíz de la raza Jala que tiene características fenotípicas sobresalientes como su talla de más de 6 metros de altura y sus mazorcas oscilan entre 30 y 45 cm de longitud. La siembra de esta variedad o raza se realiza en la localidad de Jala, Nayarit Mex., en una región que se caracteriza por tener suelos de baja salinidad, alto contenido de materia orgánica y alta capacidad de intercambio catiónico, cualidades relacionadas al origen volcánico de los suelos de esa región (Kempton, 1994). Previamente a este trabajo, las bacterias se identificaron por aproximación filogenética usando la secuencia del gen 16SRNA y se analizaron sus rasgos fenotípicos relevantes en el contexto de sus capacidades promotoras del crecimiento vegetal como la solubilización de fosfato, fijación de nitrógeno, producción de AIA y sideróforos (Guerra-Camacho, 2015; Villagómez-Garfias, 2016; Ríos-Galicia, 2017). En este trabajo se amplió este estudio fenotípico a través de la indagación de sus capacidades enzimáticas extracelulares como celulasas, quitinasas y proteasas. En este sentido, las cepas Rhizobium pusense Z3HL3, Ochrobactrum antrophi Z1AD1 Pseudomonas protegens E1BL2 destacaron en estas pruebas. Estas enzimas se ha sugerido que pueden tener importancia en bacterias que se utilicen en el biocontrol de hongos fitopatógenos. En particular, las quitinasas pueden degradar la pared celular de los hongos cuyo componente principal es la quitina. La mayoría de las bacterias endófitas poseen estas enzimas ya que están implicadas también en la inducción de resistencia sistémica siendo efectores para la producción de fitoquímicos que inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos, entre los géneros de bacterias que se han reportado producen esta clase de enzimas extracelulares se encuentran Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium (Jaskiw V et al., 2014).

59

Para evaluar la producción de quitinasas también se realizó un ensayo cuantitativo. Las cepas de Stenotrophomonas maltophilia E2BL4, Serratia marcescens Z1AD10, y P. protegens E1BL2 produjeron actividad quitinasa con una acumulación máxima a las 72 h de incubación. S. marcescens que posee un sistema quitinolítico bien estudiado (Vaaje‐Kolstad et al., 2013). Asimismo, se ha descrito que S. maltophilia secreta una quitinasa que tiene actividad antifúngica (Suma & Podile, 2013). También se han reportado cepas de P. protegens E1BL2 que producen quitinasas con posible actividad antifúngica e insecticida (Abdelwahab et al., 2016; Loper et al., 2016). La importancia de la secreción de quitinasas para control biológico por microorganismos antagonistas de hongos fitopatógenos tiene un gran potencial de aplicaciones (Swiontek Brzezinska et. al., 2013). La producción de sideróforos para los iones divalentes ensayados se puso de manifiesto en Rhizobium pusense Z3HL3, Cryseobacterium gleum Z1HL3 Achromobacter xilosoxidans Z3AD5a, P. protegens E1BL2 y S. marcescens Z1AD10. Aunque claramente poseer sideróforos confiere una clara ventaja selectiva no todas las especies los pueden sintetizar y secretarlos (Ueno et al., 2009). La cuantificación de los sideróforos detectados en este trabajo no sobrepasóo el 80% de quelación, aunque la actividad quedó cercana a los reportes de cepas de Bacillus megaterium y Bacillus subtilis que alcanzan hasta el 90% de quelación en 34 h (Patel, 2009). La producción de sideróforos es un mecanismo de biocontrol contra bacterias y hongos patógenos de humanos y fitopatógenos debido a que funcionan como “pepenadores” de iones esenciales para la función enzimática. Además de su obvia importancia en la disponibilidad de minerales del suelo y en el mejoramiento del crecimiento de las plantas, los sideróoforoes tienen un importante papel como agentes para el biocontrol, biosensors, en la bioremediation y como quelantes (Ahmed & Holmström, 2014). Los hongos fitopatógenos requieren cationes para algunos de sus factores de virulencia de naturaleza enzimática como lo son las pectinasas, xilanasa y pectato liasa, todas ellas enzimas necesarias para la degradación de la pared celular (Inmaculada et al., 2006). Como consecuencia de esto, si existen sideróforos producidos por bacterias que se usan en el biocontrol, 60

los hongos no tendrán funcionales muchas de las enzimas que se requieren para la infección aunque hayan sido secretadas. A continuación, en el trabajo se exploró la capacidad de las cepas como inhibidores de crecimiento fúngico de especies fitopatógenas del género Fusarium in vitro. Solamente la cepa P. protegens E1BL2 presentó una clara actividad antagónica sobre

los hongos provados. Previamente se ha reportado que

P. protegens

produce DAPG 2,4-diacetilfloroglucinol y pioluterina, compuestos con potente actividad antifúngica (Yan et al., 2017). También P. protegens E1BL2 produjo ácido cianhídrico compuesto el cual inhibe el complejo IV de la cadena transportadora de electrones. Este compuesto volátil también es sintetizado por algunas plantas, se acumula en vacuolas y representa un mecanismo con el cual se protegen de la agresión a herbívoros. Como también se confirmó en nuestro trabajo, el genoma de P. protegens H78 indica que es una cepa que además de ser una rizobacteria que promueve el crecimiento vegetal, produce un conjunto de antibióticos, sideróforos (pyoluteorin), 2,4-diacetilphloroglucinol (DAPG), pirrolnitrina, orfamida, una toxina insecticida, pioverdina, piochelina y cianuro de hidrógeno que pueden inhibir a hongos fitopatógenos como Botrytis Cinerea (Abdelwahab et al., 2016; Huang et al., 2017). Otras especies como P. fluorescens que ha sido propuesta suprimir la pudrición negra del tabaco causada por el hongo Thielaviopsis basicola e inhibir los hongos Rhizoctonia solani y Pythium aphanidermatum; Pseudomonas aeruginosa; y Pseudomonas chlororaphis que se ha propuesto para el biocontrol de áfidos, también producen ácido cianhídrico (; Askeland et al., 1983; Kang et al., 2018; Lenney et al., 2011; Michelsen & Stougaard, 2012; Voisard et al., 1989). La única bacteria que, además de no interferir con la germinación, protegió la las semillas de maíz de la raza Conejo de la infección de Fusarium spp. fue P. protegens E1BL2. Este rasgo es importante debido a que F. oxysporum y F. culmorum son hongos fitopatógenos causales de la marchitez temprana en maíz y producen micotoxinas en granos (Scherm B et al., 2013). También F. equiseti y F. fujikuroi producen micotoxinas y causan infecciones en la raíz (Leslie Jf et al., 2006).

61

Se analizo la resistencia a nivel invernadero sembrando semillas de maíz raza Conejo a 50 días en contenedores de plástico con vermiculita mezclada con maíz molido estéril infectado con las cuatro especies fitopatógenas del género Fusarium, Fusarium culmorum Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti y Fusarium fujikuroi. protegidas con las cepas E1BL2 Pseudomonas protegens y Z1AD1 Ochrobactrum antropi, la aplicación de estas cepas redujo la infección en las plántulas de maíz así como promovieron el crecimiento de estas, la aplicación de E1BL2 Pseudomonas protegens en la semillas las protegió de una infección fúngica también les permitió un desarrollo optimo, la cepa E1BL2 Pseudomonas protegens

cuenta con

diferentes mecanismos de biocontrol (Shrey Bodhankar et al., 2017) como producción de sideróforos, qutitinasa, celulasa, proteasa, ácido cianhídrico así mismo inhibió el crecimiento fúngico en placa esto aumenta la capacidad de la planta de protegerse previo a microorganismos patógenos, la aplicación de PGPR induce la respuesta inmune de las plantas mediante ISR la acumulación de enzimas líticas y antibióticos como el DAPG o pioluterina fungen como elicitores en una cascada de señalización hacia la planta para sintetizar fitoquímicos que inhiban el crecimiento de microorganismos patógenos, así mismos la bibliografía menciona a Pseudmonas protegens CHA0 y P. flourescens Q2-87 inducen ISR en Arabidopsis por la expresión de enzimas asociadas a la defensa de microorganismos patógenos como (quitinasa, peroxidasa, polifenol oxidasa) (Pooja Kannojia et al., 2019).

La cepa Pseudomonas protegens E1BL2 estimulóo el crecimiento de la planta esta cepa

ya

se

caracterizó

fenotípicamente

como

promotora

de

crecimiento

produciendo, AIA, reducción de acetileno, ACC desaminasa así como solubilización de fosfatos (De la Vega-Camarillo,2018; Rios-Galicia 2017).

62

La aplicación de la cepa Ochrobactrum anthropi Z1AD1 mostróo la capacidad de controlar la infección fúngica a la planta de maíz raza Conejo. Eesta cepa no cuenta con enzimas capaces de inhibir el crecimiento fúngico, y aunque por otra parte se esperaba que no contara con el potencial de inhibir la infección fúngica, su comportamiento se esto se podría asociar más hacia la interacción planta-bacteria en la cual la bacteria presenta compuestos que inducen una respuesta de protección hacia la planta. E, en el trabajo reportado por la bibliografía K. Sowndhararajan y colaboradores, aislaron a Ochorbactrum anthropi BMO-111 la cual no presentóo enzimas extracelulares, sideróforos o producción de ácido cianhídrico así mismo inhibió el crecimiento de Pestalotipsis theae in vitro. Ppor lo anterior, cual se sugiere extraer compuestos extra celulares y celulares, ; con la finalidad

de

indagar

el

carácter

que

inhibe

el

crecimiento

fúngico

(K.

Sowndhararajan et al., 2012).

63

9. Conclusiones

La cepa Pseudomonas protegens E1BL2 cuenta con mecanismos potenciales de biocontrol como la producción de sideróforos para quelar iones magnesio, cobalto, calcio, zinc y cobre; la secreción de quitinasas, celulasas y proteasas; la excreción de ácido cianhídrico; y la capacidad para inhibir el crecimiento fúngico de Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti y Fusarium fujikuroi in vitro e in vivo sin afectar la capacidad de germinación de las semillas del maíz. La bacteria Stenotrophomonas maltophilia E2BL4 fue la cepa con mayor actividad quitinolítica, la bacteria Achromobacter xilosoxidans Z3AD5a fue la cepa que tuvo mayor producción de sideróforos para los iones divalentes magnesio, calcio, cobre, zinc,y cobalto, la bacteria Rhizobium pusense Z3HL3 destacó en su capacidad de producir celulasas y proteasas.

64

Bibliografía: revisar que no falten ni sobren, la mayoría tienen el nombre de la revista completo, pero en la última referencia lo abreviaste, revísalas todas. Quítales el número, no tiene caso, pues citas por apellido. Deja un doble espacio entre referencia y referencia. Todos los nombres cientoficos en itálicas. Los nombres oficiales de las revistas, la primera letra va en mayúscula. Tienes que homogeneizar, después del número de volumen, a veces pones dos puntos (:) y a veces coma (,), etc. Etc.

10. Bibliografía Formatted: Font: (Default) Arial, 12 pt

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