Listeria Spp..docx

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TAXONOMÍA Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Bacillales Familia: Listeriaceae Género: Listeria Especies: L. grayi L. innocua L. ivanovii L. monocytogenes L. seeligeri L. welshimeri DEFINICIÓN Listeria es un género bacteriano que comprende seis especies. Lleva su nombre en honor a Joseph Lister. Las especies de Listeria son bacilos Grampositivos.  

L. monocytogenes, es la especie típica y es el patógeno causante de la listeriosis. L. ivanovii es un patógeno de rumiantes que puede infectar a los ratones en el laboratorio, aunque es muy raro que produzca enfermedades en humanos.

ANTECEDENTES La identificación de la bacteria ha pasado por diferentes autores e investigadores, que la identificaron y nombraron de diferente forma. Respecto a la relación del género con Lister, la bacteria fue bautizada en honor de Lister por James Hunter Harvey Pirie (1877- 1965), bacteriólogo y geólogo escocés, que identificó la bacteria en 1927 y la denominó como Listerella hepatolytica. La identificación de la bacteria ya se había realizado un año antes (1926) por parte de tres microbiólogos de Cambridge (Murray, Webb y Swann) y que ellos denominaron Bacterium monocytogenes. La bacteria cambió de nombre en diferentes ocasiones, pasando por los nombres de Bacterium monocytogenes

hominis (Nyfeldt – 1932),Corynebacterium parvulum (Schultz -1934), Erysipelothrix monocytogenes (Miles y Wilson – 1946), Corynebacterium infantisepticum (Potel 1950), para terminar en 1957 con la designación Listeria monocytogenes realizada por Heinz Seeliger (1920-1997) en recuerdo de la nomenclatura de Pirie. ESPECIES DE INTERÉS MÉDICO Entre las diferentes especies incluidas en el monocytogenes es la única implicada en patología humana.

género,

Listeria

IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN      

Bacilos gram-positivos, cortos, regulares, no esporulados ni ramificados, que suelen observarse en disposición individual o formando cadenas cortas. La obtención de muestras puede ser de sangre venosa, LCR y materia fecal. Crece en agar sangre, agar soya tripticasa, caldo nutritivo. Produce β-hemolisis En agar bilis esculina es positivo A las 24 horas las colonias típicas de L. monocytogenes en agar MOX, las colonias son pequeñas,rodeadas de halo de ennegrecimiento debido a la hidrólisis de esculina

Imagen 1. Crecimiento de Listeria en Agar MOX (Medio Oxford Modificado) 

Medio PALCAM: Es diferencial debido a que Listeria spp. hidroliza esculina que en presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de color negro. Es selectivo para Listeria spp., por el agregado del suplemento selectivo para agar base Palcam que contiene antibióticos que inhiben en forma total o parcial el desarrollo

de la flora presente en la muestra y permiten la recuperación de Listeria spp.

Imagen 2. Crecimiento de Listeria spp. En medio Palcam 

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En caldo base Fraser todas las especies de Listeria hidrolizan esculina a esculitina que, junto con los iones férricos, forman un complejo marrón oscuro a negro. Citrato férrico amónico favorece el desarrollo de L. monocytogenes. En cultivos viejos pueden aparecer formando filamentos de 6-20 mm de longitud. Presentan de 1 a 5 flagelos peritricos que les confieren movilidad a 28ºC. Las colonias son pequeñas (de 1 a 2 mm tras uno o dos días de incubación) y lisas. Al observarse a la lupa con epiiluminación, con un ángulo de la luz de 45º-60º, se observan reflejos de color azul-verdoso sobre una superficie finamente granular. Su temperatura óptima de crecimiento está entre 30ºC y 37ºC, pero pueden crecer a 4ºC en pocos días. Listeria spp. son anaerobias facultativas, catalasa positivas y oxidasa negativas. Las reacciones de Voges-Proskauer y rojo de metilo son positivas. Hidrolizan la esculina en pocas horas, pero no la urea ni la gelatina; no producen indol ni SH2. Producen ácido de la D-glucosa y de otros azúcares. El contenido de guanina-citosina de su ADN es bajo, entre el 36% y el 38%.

Tabla 1. Diferenciación con géneros relacionados.

Tabla 2. Diferenciación fenotípica de especies del género Listeria

MECANISMOS DE PATOGENICIDAD El motivo por el que L. monocytogenes produce una grave infección, se debe a la capacidad que tiene de inducir su propia fagocitosis por células fagocíticas y no fagocíticas del huésped, seguido por la replicación en el interior de las mismas y su transferencia directa a otra célula. Como L. monocytogenes es un microorganismo intracelular, se disemina protegido de las defensas del huésped incluyendo anticuerpos y complemento (Cossart et al., 2003). Antes de alcanzar el intestino, las bacterias ingeridas deben soportar el ambiente adverso del estómago, al menos 13 proteínas de estrés oxidativo y 14 proteínas de “shock” tóxico, son inducidas bajo condiciones de estrés en L. monocytogenes (Vázquez-Boland et al., 2001b). Las bacterias ingresadas con el alimento son captados por los enterocitos o la células M próximas a las placas de Peyer en el intestino delgado, multiplicándose luego en las células fagocíticas. Las bacterias son transportadas por los macrófagos del intestino al hígado o al bazo, donde son destruidas por los neutrófilos y las células de Kupffer. Si la respuesta inmune mediada por células T del huésped es inadecuada, las listerias se multiplican en los hepatocitos y en los macrófagos y son llevadas por la sangre a varios órganos, especialmente al cerebro y/o al útero, donde atraviesan la barrera hematoencefálica o la placenta. Una intrincada serie de factores de virulencia son producidos por L. monocytogenes para facilitar cada paso en su proceso de invasión. MECANISMOS DE RESISTENCIA Una vez en el interior de la célula, la vacuola fagocítica es rápidamente lisada por la toxina listeriolisina O (LLO) y dos fosfolipasas C (PLC): fosfatidilinositol-PLC (PI-PLC) y fosfatidilcolina-PLC (PC-PLC), codificadas por plcA y plcB, respectivamente. LLO es una toxina dependiente de colesterol y capaz de formar poros en la membrana de los fagosomas, permitiendo que L. monocytoges escape de las vacuolas primarias y secundarias. Esta acción citolítica de LLO se ve aumentada por la acción de PI-PLC, que reconoce como sustrato a fosfatidilinositol y por PC-PLC, que es una lecitinasa, que tiene actividad enzimática sobre fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina. PC-PLC es expresada como protoenzima y se requiere la metaloproteasa dependiente de zinc Mpl, para su maduración. Una vez libre en el citosol, L. monocytogenes expresa los genes para adquirir los nutrientes necesarios para la multiplicación intracelular. Se ha determinado que el gen hpt, que codifica para el transportador de hexosa 6-fosfato, es importante para el óptimo crecimiento intracelular de Listeria. Luego de la replicación, se induce la polimerización de filamentos de actina en un polo de la bacteria; este proceso es dirigido por la proteína ActA. La formación de una estructura semejante a una cola de cometa facilita el movimiento intracelular, permitiendo la invasión a células vecinas, mediante un proceso que implica la formación de una protrusión que contiene a la bacteria rodeada por una vacuola de doble membrana, la cual es lisada por PC-PLC, PI- PLC y LLO. Se han identificado otros factores de virulencia involucrados en la colonización del

hospedero; sin embargo, éstos no serían específicos de L. monocytogenes, ya que también han sido detectados en otras especies de Listeria. Estos factores son conocidos como factores de virulencia accesorios y entre éstos se encuentran la proteína p60 (producto del gen iap), secretada por todas las cepas de Listeria, que parece estar involucrada en los últimos pasos de la división celular; los mediadores en respuesta al estrés (ClpC, ClpE, ClpP), involucrados en el escape desde el fagosoma y en la multiplicación intracelular. También se ha asignado un rol importante a la presencia de las enzimas superóxido dismutasa y catalasa, las que actúan en conjunto para detoxificar radicales libres y, por último, los sistemas de captación de hierro, que permiten a la bacteria capturar el hierro de los tejidos del hospedero. En estos últimos años, se ha relacionado la capacidad de sobrevivir y multiplicarse dentro de la célula hospedera con algunos mecanismos como evasión de los mecanismos de defensa de la célula hospedera, ya sea en el citosol o en la vacuola fagocítica, característica que está otorgada por la presencia de enzimas que modifican el peptidoglicano como PgdA, que deacetila los residuos de N-acetilglucosamina produciendo resistencia a la enzima lisosima28,39; también se informa de la capacidad de la proteína ActA para evitar la autofagia, proceso en el cual L. monocytogenes es degradada en los lisosomas. Finalmente, hay evidencias experimentales que señalan que L. monocytogenes es capaz de inducir modificaciones en las histonas y remodelar la cromatina; por lo tanto, tendría una participación en lo que se conoce como regulación epigenética. ENFERMEDADES Existen dos formas de presentación clínica de la infección: a) Listeriosis perinatal b) Listeriosis en el paciente adulto. Las formas clínicas predominantes corresponden en ambos casos a la infección diseminada o a la infección localizada en el sistema nervioso central. Es la infección de origen alimentario con mayor tasa de mortalidad en humanos (20 al 30 % o mayor) a pesar del inicio del tratamiento antibiótico previo (McLauchlin, 1990). La infección generalmente comienza alrededor de las 20 horas después de la ingestión del alimento contaminado en los casos de gastroenteritis (Dalton et al., 1997), mientras que el período de incubación para la forma invasiva es generalmente más larga, alrededor de 20 a 30 días.(Lindan et al.,1988). Los mismos períodos de incubación han sido descritos para animales, tanto para la gastroenteritis como para la forma diseminada. La dosis mínima requerida para la infección humana no ha sido determinada, pero el número de bacterias detectadas en alimentos responsables de casos esporádicos y epidémicos de listeriosis sugiere que es alto. Esta dosis también depende de otros factores como el estado inmunológico del huésped.

a) Listeriosis feto materna y listeriosis neonatal La infección se produce por invasión del feto por vía placentaria y desarrollo de corioamnionitis. Como consecuencia, puede ocurrir el aborto, generalmente a partir de los 5 meses de embarazo, el parto prematuro o el nacimiento a término con infección generalizada del neonato, síndrome conocido como granulomatosis infantiséptica. Se caracteriza por la presencia de microabscesos piogranulomatosos diseminados en el cuerpo y con alta mortalidad (Klatt et al., 1986). En la madre, la infección es generalmente asintomática y puede presentarse como un síndrome gripal leve con escalofríos, fatiga, dolor de cabeza, muscular y articular alrededor de 2 a 14 días antes del aborto. La listeriosis neonatal tardía se observa con menos frecuencia. Generalmente ocurre de 1 a 8 semanas posteriores al parto y se presenta con un síndrome febril acompañado por meningitis y en algunos casos gastroenteritis y neumonía. La vía de contaminación del neonato es por aspiración de exudados maternos contaminados durante el parto. También se han registrado casos intrahospitalarios en unidades de neonatología por transmisión horizontal a través de instrumental y las manos del personal de salud (Farber et al., 1991). La mortalidad de la listeriosis neonatal tardía es más baja (10 al 20%), pero al igual que la listeriosis temprana, puede dejar secuelas tales como hidrocefalia y retraso psicomotor (Lorber, 1996). b) Listeriosis del adulto La infección mas frecuente en el adulto es la invasión del sistema nervioso central (SNC) (55 al 70% de los casos). Desarrolla generalmente como meningoencefalitis acompañada por cambios severos de la conciencia, desordenes del movimiento y en algunos casos parálisis de los nervios craneales. La mortalidad de la infección del SNC es del 20%, pero puede ser del 40 al 60% si está asociada a una enfermedad de base. En ciertos grupos de riesgo, como enfermos de cáncer, L. monocytogenes es la causa más frecuente de meningitis bacteriana (Lorber, 1996). Otra forma frecuente de listeriosis es la bacteriemia o septicemia que tiene una alta tasa de mortalidad (hasta el 70%), si esta asociada a una enfermedad inmunosupresiva. Hay otras formas clínicas atípicas (5 al 10% de casos) tales como endocarditis, miocarditis, arteritis, neumonía, pleuritis, hepatitis, colecistitits, peritonitis, abscesos localizados, artritis. En vacas la forma más frecuente es la mastitis (Blenden et al., 1987). Investigaciones de brotes alimentarios han dado la evidencia de que un síndrome gastrointestinal es la manifestación clínica de la infección por L. monocytogenes (Aureli et al., 2000).

EL PROTEOMA DE LISTERIA MONOCYTOGENES La determinación completa de la estructura genética y proteica de L. monocytogenes y el conocimiento de las funciones interconectadas de la arquitectura celular de este microorganismo, son fundamentales para comprender

la supervivencia y el crecimiento de este patógeno alimentario en el ambiente, en alimentos y en los casos humanos de listeriosis. Los estudios proteómicos han sido enfocados hacia la respuesta del organismo frente a un stress general, así como también hacia situaciones de stress más específicas, que son importantes para la supervivencia y crecimiento en diferentes condiciones relacionadas con alimentos, biofilms y procesos infecciosos. La propiedad de L. monocytogenes de sobrevivir y crecer a temperaturas de refrigeración hace importante determinar los mecanismos por los cuales los patógenos alimentarios llevan a cabo dicha actividad. Phan-Thanh, and Gormon, encontraron 32 proteínas que eran producidas al doble, frente a un shock térmico, que consistía en llevar la bacteria de 25 ºC a 49 ºC de temperatura. Los mismos autores encontraron 38 proteínas que aumentaban al doble o más, al llevar la bacteria de 25 ºC a 4 ºC. Dos de las proteínas expresadas durante el shock al frío fueron identificadas, como proteínas ribosomales S6 y factor de elongación Tu (EF-Tu). De la misma manera, L. monocytogenes tiene la capacidad de tolerar condiciones de alta osmolaridad. Es capaz de crecer en presencia de NaCl 10% y ha sido aislada de alimentos con alta concentración de sal. La exposición a 3.5% NaCl durante 30 minutos resulta en la producción de proteínas generales de stress DnaK y Crc y las enzimas alanina dehidrogenasa, gliceraldehido 3 fosfato dehidrogenasa (Gap), y Cys K que interviene en la síntesis de cisteína. Después de estar a 3.5% NaCl por 60 a 90 minutos, se expresan proteínas relacionadas a largos períodos de aclimatación, en condiciones de alta osmolaridad. Estas proteínas se conocen como de aclimatación a sales e incluyen Gbu, EF-Tu, GuaB, CcpA, PTS manosa específica, Pdh A y Pdh D (subunidades de la piruvato dehidrogenasa). El desarrollo y persistencia de biofilms conteniendo L. monocytogenes es una importante área de investigación, ya que los biofilms son prevalentes en las plantas procesadoras de alimentos y los biofilms pueden reducir la efectividad de los tratamientos de sanitización dispuestos para eliminar Listeria y otros microorganismos. De las 8 proteínas reguladoras de L. monocytogenes caracterizadas en biofilms, PdhD y CysK fueron identificadas como proteínas de stress salino en medios mínimos. PdhD e YvyD eran proteínas que tenían mayor expresión en medio mínimo que en BHI con y sin el agregado de 6% de NaCl. El hallazgo que PdhD, CysK e YvyD son altamente expresadas tanto en un medio mínimo, como en un biofilm desarrollado en un medio agarificado complejo, indica que las bacterias en el biofilm están respondiendo a limitaciones nutricionales similares a las de bacterias en un medio mínimo. Los perfiles de proteínas de células planctónicas desarrolladas en glucosa fueron comparadas con los perfiles de células privadas de glucosa en biofilms. La comparación reveló que las bacterias del biofilm privadas de glucosa, incrementaban la expresión de 14 proteínas, de las cuales 5 pudieron ser identificadas. Estos avances en el conocimiento serán utilizados para desarrollar mejores estrategias de intervención y métodos de detección para salvaguardar la producción de alimentos.