Li Anis Skenario B Blok 11.docx

NAMA

: ANISA FITRI

NIM

: 04011281722154

KELAS

: ALPHA 2017

LEARNING ISSUE

I.

II.

ANEMIA DAN TROMBOSITOSIS REAKTIF

PEMERIKSAAN LABORATORIUM A. PEMERIKSAAN KADAR HEMOGLOBIN Hemoglobin (Hb) adalah pigmen merah yang terdapat di dalam eritrosit. Hemoglobin terdiri dari beberapa rantai protein dan molekul yang mengandung besi. Prinsip: Darah ditambah asam (HCL 0,1 N) akan membentuk asam hematin yang berwarna coklat. Warna coklat yang terbentuk dibandingkan dengan warna standar. Bahan pemeriksaan: Darah kapiler atau darah vena dengan antikoagulan EDTA. Alat dan reagen: 1. Hemoglobinometer Sahli 2. HCL 0,1 N 3. Aquadest Cara pengambilan darah kapiler (perifer): Ujung jari atau lateral tumit (untuk bayi) didesinfeksi dengan kapas alkohol 70%. Biarkan kering. Tusuk dengan lanset ± 3 mm, penusukan tegak lurus dengan garis kulit. Darah yang pertama keluar (tanpa ditekan) dibersihkan dengan kapas kering steril. Cara kerja: 1. Masukkan 5 tetesHCl 0,1 N ke dalam tabung Sahli. 2. Isap 20 l darah dengan pipet Sahli, bersihkan darah yang menempel pada bagian luar pipet. 3. Masukkan darah tersebut dengan hati-hati ke dalam tabung Sahli yang sudah berisikan HCl 0,1 N. 4. Bilas darah dalam pipet dengan cara menghisap dan mengeluarkan HCl 0,1 N beberapa kali. 5. Biarkan 4 menit agar hemoglobin berubah menjadi asam hematin. 6. Encerkan larutan dengan aquadest tetes demi tetes, sambil dikocok tiap kali menambahkan aquadest, sampai warna larutan sama dengan warna standar (pembanding). 7. Hasil harus dibaca dalam waktu 5 menit. 8. Tinggi bagian bawah meniskus menunjukkan kadar hemoglobin (g/dl). 3 Kerugian metode ini: 1. Kurang teliti, kesalahannya besar. 2. Warna asam hematin yang terbentuk tak stabil. 3. Warna standar dapat berubah dalam beberapa bulan. 4. Tabung yang dipakai tidak selalu sama isinya. 5. Kalibrasi pada tabung sangat rapat. 6. Jumlah darah yang dipakai sedikit sekali sehingga kelebihan/kekurangan sedikit saja, sudah menyebabkan kesalahan besar. Syarat-syarat: 1. Pada waktu menghisap darah dengan pipet Sahli, kolom darah tidak boleh berisi gelembung-gelembung udara. 2. Pemeriksaan

dilakukan dalam kamar yang terang/cahaya siang hari. Membersihkan alat-alat: 1. Sesudah dipakai, alat dicuci dengan air lalu dibilas dengan aquadest kemudian keringkan dengan kain yang tersedia. 2. Pipet dibersihkan berturut-turut dengan: a. aquadest b. aseton c. ether atau alkohol 3. Keringkan dengan air pengering. 4. Alat dalam keadaan bersih diserahkan kembali kepada asisten. Nilai rujukan pria : 13 - 16 g/dL Nilai rujukan wanita : 12 - 14 g/dL B. PEMERIKSAAN KADAR HEMATOKRIT

C. HITUNG ERITROSIT Konsentrasi jumlah eritrosit adalah jumlah eritrosit dalam 1 liter darah. (Pada sistem konvensional, konsentrasi ini dinamakan "hitung eritrosit", yi. ,jumlah eritrosit per mm3 darah.) Metode penghitungan eritrosit secara akurat memerlukan alat-hitung elektronik. Namun) alat ini seringnya tidak ada di laboratorium-laboratorium perifer. Terdapat metode yang lebih sederhana, meskipun kurang akurat, yi., penghitungan eritrosit di bawah mikroskop (pada bilik-hitung). Sayangnya, metode ini ketelitiannya rendah dan sebaiknya tidak dipakai. Biarpun begitu, metode ini lebih dianjurkan daripada harus mengukur dulu fraksi volume eritrosit Oihat bagian 94) atau kadar Rb Oihat bagian 9.3), baru kemudian menghitung konsentrasi jumlah eritrosit.

Alat-alat: 1. Alkohol 70% 6. Hemocytometer lengkap: 2. Kapas - kamar hitung 3. Hemolet - kaca penutup 4. Cairan Hayem atau Gower - pipet eritrosit 5. Mikroskop pipet karet Cara: 1. Isap darah kapiler dengan pipet eritrosit sampai tanda 0,5; hapuslah kelebihan darah yang melekat di ujung luar pipet. 2. Isap ke dalam pipet (1) cairan Hayem (atau Gower) sampai tanda 101, sambil memutar-mutar pipetnya, lepaskan karetnya. 3. Kocok pipet 10-15 detik dalam posisi horizontal sambil diputar-putar. 4. Kocok lagi selama 3 menit, buanglah 4 tetesan yang pertama lalu diisikan ke dalam kamar hitung yang bersih, biarkan 2-3 menit. 5. Hitung di bawah mikroskop dengan: Kamar hitung Improved Neubauer: Eritrosit : dengan HPF dalam 80 kotak kecil atau dalam 5 x 16 kotak kecil dan hasilnya dikalikan dengan 10.000 (4 angka 0) Nilai rujukan pria : 4,5 – 5,5 juta/mm3 Nilai rujukan wanita : 4,0 – 5,0 juta/mm3

Nilai yang tinggi Pada dehidrasi atau polisitemia, dapat ditemukan konsentrasi jumlah eritrosit yang tinggi. Nilai yang rendah Pada anemia (akibat penurunan produksi eritrosit, peningkatan hemolisis, atau perdarahan), dapat ditemukan konsentrasi jumlah eritrosit yang rendah. Catatan: Anemia merupakan sindrom klinis yang dapat di-sebabkan oleh berbagai ha!. Gambaran klinisnya bergantung pada derajat keparahannya dan lamanya. Gejalanya bervariasi, antara lain pucat, letih, nyeri kepala, pusing, mudah tersinggung, perilaku takterkendali, bahkan sampai syok dan gagaljantung. Anemia dapat disebabkan oleh: perdarahan - penurunan produksi eritrosit - peningkatan hemolisis. Pada berbagai negara di dunia, anemia paling sering disebabkan oleh defisiensi besi. Penyebab-penyebab lazim lainnya, seperti infeksi, malaria, malnutrisi, dan defisiensi vitamin, biasanya disertai dengan anemia defisiensi besi. Penyebabpenyebab lainnya meliputi: trauma infeksi parasit penyakit sistem endokrin penyakit kronis kelainan metabolisme bawaan (inborn errors of metabolism) intoksikasi.

D. HITUNG LEUKOSIT Konsentrasi jumlah leukosit atau hitung leukosit adalah jumlah leukosit yang terdapat dalam 1 liter darah. Pada penyakit-penyakit tertentu, terjadi perubahan jumlah leukosit dalam darah. Sebagai contoh, pada mononukleosis infeksiosa dan infeksi bakterial, jumlah leukosit meningkat secara bermakna; sebaliknya, pada demam tifoid, j·.lmlahnya menurun secara bermakna. Prinsip Sewaktu darah diencerkan dengan larutan pengencer leukosit,akan terjadi hemolisis eritrosit, tetapi leukositnya sendiri tetap intak. Selanjutnya, banyaknya leukosit (pada bilikhitungnya) dihitung di bawah mikroskop dan dilaporkan sebagai jumlah sel per liter darah. Alat-alat: 1. Alkohol 70% 6. Hemocytometer lengkap: 2. Kapas - kamar hitung 3. Hemolet - kaca penutup 4. Cairan Turk - pipet leukosit 5. Mikroskop - pipet karet

Cara: 1. Isap darah kapiler dengan pipet leukosit sampai tanda 0,5, hapuslah kelebihan darah yang melekat di ujung luar pipet. 2. Isap ke dalam pipet (1) cairan Turk sampai tanda 11, sambil memutar-mutar pipetnya, lepaskan karetnya. 3. Kocok pipet 10-15 detik dalam posisi horizontal sambil diputar-putar. 4. Kocok lagi selama 3 menit, buanglah 4 tetesan yang pertama lalu diisikan ke dalam kamar hitung yang bersih, biarkan 2-3 menit. 5. Hitung di bawah mikroskop dengan: Kamar hitung Improved Neubauer: Leukosit : dengan HPF dalam 64 kotak kecil atau dalam 4 x 16 kotak kecil dan hasilnya dikalikan dengan 50 Nilai rujukan : 5.000 – 10.000/mm3

Nilai yang tinggi Peningkatan jumlah leukosit total dalam darah disebut leukositosis. Hal ini dapat terjadi pada infeksi bakterial tertentu. Pada leukemia, konsentrasi jumlah leukosit bisa sangat meningkat, berkisar antara 50 x 109/1 hingga 400 x 109/1, atau bahkanlebih. Pada kasus leukemia, darah yang dipakai untuk estimasi konsentrasijumlah leukosit harus lebih encermis., dengan mencampurkan 0,05 ml darah dan 1,95 ml larutan pengencer, menghasilkan pengenceran 1:40. Dengan pengencerannya sebesar ini, jumlah sel (x 109) per liter darah diperoleh dari jumlah sel yang ditemukan dikali 0,1, bukan 0,05. (Kalau dipakai satuan konvensional, jumlah sel per milimeter kubik darah diperoleh dari jumlah sel yang ditemukan dikali 100, bukan 50.) Nilai yang rendah Penurunan jumlah leukosit total dalam darah disebut leukopenia. Hal ini dapat terjadi pada infeksi tertentu, termasuk pada demam tifoid dan malaria. Leukopenia juga dapat terjadi akibat terapi rnedikamentosa tertentu. Kalau konsentrasi jumlah leukosit sangat rendah, pengenceran darah perlu diperkecil-mis., dengan mencampurkan 0,05 ml darah dan 0,45ml larutan pengencer, menghasilkan pengenceran 1:10. Dengan pengenceran sebesar ini, jumlah sel (x 109) per !iter darah diperoleh dari jumlah sel yang ditemukan dika!i 0,25, bukan 0,05. Koreksi jumlah leukosit akibat adanya eritrosit berinti Eritrosit berinti atau normoblas merupakan bentuk-eritrosit dini. Normalnya, sel ini tidak terdapat. dalam darah, tetapi bisa saja ditemukan pada penyakit-penyakit tertentu, seperti anemia sel sabit atau jenis anemia hemolitik lainnya. Normoblas tidak lisis dalam larutan pengencer sehingga ikut terhitung sebagai leukosit. Adanya normoblas ini, apalagi kalau

jumlahnya banyak, membuat penghitungan leukosit (terutama yang memakai alat-hitung sel automatik atau semi-automatik) harus dikoreksi sebagai berikut. Amati apusan-darah tipis yang dipulas dengan pewarna Romanowsky dan hitung banyaknya normoblas yang tampak per 100 leukosit. Penghitungan: Konsentrasi jumlah normobhls (per liter) adalah: Contoh: jumlah nomorblas yang ditemukan ----------------x konsentrasi jumlah leukosit 100 + jumlah nomorblas yang ditemukan Kalau ditemukan 50 normoblas dan konsentrasijumlah leukosit adalah 16 x 109/1, konsentrasijumlah normoblas tersebut adalah: 50 9 - - --x 16 = 5.3 x 10 /1 100 + 50 Jadi, konsentrasi jumlah leukosit terkoreksi adalah: (16 - 5,3) x 109/1 = 10,7 x 109/1.

E. MCV

F. MCH G. MCHC H. PEMERIKSAAN KADAR TROMBOSIT Alat-alat: 1. Kapas alkohol 70% 6. Hemocytometer lengkap: 2. Cawan petri - kamar hitung 3. Hemolet - kaca penutup 4. Cairan Rees-Ecker - pipet eritrosit 5. Mikroskop - pipet karet Cara: 1. Isap cairan Rees-Ecker ke dalam pipet eritosit sampai garis tanda 1 dan buanglah lagi cairan itu. 2. Isap darah kapiler dengan pipet eritrosit sampai garis tanda 0,5 dan cairan Rees-Ecker sampai tanda 101, segera kocok selama 3 menit. 9 3. Teruskan tindakan-tindakan seperti untuk menghitung eritrosit dalam kamar hitung. 4. Biarkan kamar hitung yang telah diisi dengan sikap datar dalam cawan petri yang tertutup selama 10 menit agar trombosit mengendap. 5. Hitunglah semua trombosit dalam seluruh bidang besar di tengah-tengah memakai lensa objektif besar. 6. Jumlah itu dikali 2.000 menghasilkan jumlah trombosit per ul darah. Nilai rujukan : 150.000 – 450.000/mm3

I. DIFFERENTIAL COUNT Prinsip Pada pemeriksaan 100 leukosit, hitung banyaknya tiap-tiap jenis leukosit yang ditemukan. Proporsi tiap-tiap jenis leukosit ini dilaporkan dalam fraksi desimal.'

Contoh: neutrofil 0,56; limfosit 0,25; eosinofil 0,12; monosit 0,06; dan basofil 0,01. Jumlah fraksi-fraksi tersebut harus sama dengan 1. Kalau jumlah leukosit total diketahui, laporkan fraksi jumlah ini dalam konsentrasi jumlah (yi., jumlah sel per !iter), bukan dalam fraksi desimal. 9.13.2 Peralatan • Mikroskop • Minyak imersi • Apusan-darah tipis yang dipulas dengan pewarna RomanowskY' Oihat bagian 9.10.3) • Kertas • Pensil. 9.13.3 Pemeriksaan mikroskopik Periksa apakah leukos.it sudah terdistribusi merata pada apusan, dengan objektif x100 (memakai minyak imersi). Pada apusan yangjelek, neutrofil biasanya terkonsentrasi pada ujung apusan. Ikuti langkah-langkah pelaporan tiap-tiap jenis leukosit berikut ini. Buatlah tabel yang terdiri dari: 5 kolom (N, E, B, L, dan M), dan 10 baris (lihat Gbr. 9.111). Setiap kali Anda menemukan jenis sel tertentu, buat turnsnya pada tiap-tiap baris tabel tersebut; kalau sudah tercapai 10 turns pada sebuah baris, lanjutkan ke baris berikutnya. Jadi, kalau kesepuluh baris sudah terisi, Anda berarti sudah memeriksa 100 leukosit. Selanjutnya, hitung jumlah turns total per kolom. Jumlab tersebut menunjukkan persentase tiap-tiap jenis leukosit. Konversikan angka ini menjadi fraksi desimal, dengan n:en~eser tanda koma ke kiri dua kali dan tambahkan angka nol di depannya. Dengan demikian, 59 menjadi 0,59, 8 menjadi 0,08, 1 menjadi 0,01, 28 menjadi 0,28, dU., seperti yang tercantum pada baris terakhir tabel. Fraksi-fraksi desimal ini menunjukkan fraksi jumlah tiap-tiap jenis leukosit dan mernpakan nilai yang harns dilaporkan (kalau memakai sist em satuan SI). Klsaran normal Tabe19.12 menyajikan kisaran-normal fraksijumlahjenis leukosit pada berbagai kelompok usia. Normalnya, distribusijenis-jenis leukosit menunjukkan dua pola utama: • Pola pertama, predominan limfosit (pada bayi dan anak di bawah 10 tahun). • Pola kedua, predominan neutrofil (pada bayi barn lahir, anak di atas 10 tahun, dan dewasa). Fraksi jumlah tiap-tiap jenis leuk6sit juga dapat dilaporkan dalam konsentrasi jumlahnya (yi., jumlah sel per liter). Konsentrasi jumlah inisama dengan fraksi jumlah jenis leukosit tertentu dikali konsentrasi jumlah leukosit total. Contoh: konsentrasi jumlah leukosit total = 5 x 109/1 fraksijumlah neutrofil = 0,42 konsentrasijumlah neutrofil = 0,42 x 5 x 109 = 2,1 x 108/1. Temuan-temuan yang abnormal • Neutrofilia, yaitu peningkatan fraksijumlah neutrofil (>0,65), lazim ditemukan pada infeksi. • Eosinofilia, yaitu peningkatan fraksi jumlah eosinofil (>0,05). Ditemukannya eosinofilia hampir sel0,35 pada dewasa dan >0,45 pada anak-anak), ditemukan pada infeksi viral tertentu (mis., campak), infeksi kronis tertentu (mis., malaria, tuberkulosis), dan beberapa kondisi toksik. • Monositosis, yaitu,peningkatan fraksijumlah monosit (>0,06), ditemukan pada infeksi bakterial tertentu (mis., demam tifoid, mononukleosis infeksiosa) dan infeksi parasit tertentu (mis., malaria, kala-azar [leishmaniasis visceral

• Neutropenia, yaitu penurunan jumlah neutrofil, dapat terjadi pada infeksi tertentu (mis., sepsis) dan beberapa penyakit lainnya. • Limfopenia, yaitu penurunan jumlah limfosit, dapat terjadi pada AIDS.

J. LAJU ENDAP DARAH (LED) Prinsip: Darah ditampung di dalam tabung-panjang berskala (dengan antikoagulan), yang diposisikan tegak. Eritrosit akan mengendap di dasar tabung, terpisah dengan lapisan plasma di atasnya. Tinggi kolom plasma, yang diukur 1 jam sesudahnya, menunjukkan laju pengendapan eritrosit (erythrocyte sedimentation rate [ESR]; laju endap darah [LED]). a. Cara Wintrobe 1. Dengan memakai pipet Wintrobe masukkanlah darah yang telah dicampur dengan antikoagulan ke dalam tabung Wintrobe setinggi garis tanda 0 mm. Jagalah jangan sampai terjadi gelembung hawa atau busa. 2. Biarkan tabung Wintrobe itu dalam sikap tegak-lurus selama 60 menit. 3. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan milimeter dan laporkanlah angka itu sebagai laju endap darah.

b. Cara Westergreen 1. Isaplah 0,4 ml larutan natrium sitrat 3,8% yang steril dalam spuit yang steril juga. 2. Lakukanlah pungsi vena dengan spuit itu dan isaplah 1,6 ml darah sehingga mendapatkan campuran sebanyak 2,0 ml. 3. Masukkanlah campuran itu ke dalam tabung dan campurlah baik-baik. 4. Isaplah darah itu ke dalam pipet Westergreen sampai garis bertanda 0 mm, kemudian biarkan pipet itu dalam sikap tegak lurus dalam rak Westergreen selama 60 menit. 5. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan milimeter dan laporkanlah angka itu sebagai laju endap darah. Sangat penting untuk menaruh pipet atau tabung laju endap darah dalam sikap tegak-lurus benar karena selisih kecil dari garis vertikal sudah dapat

berpengaruh banyak terhadap hasil laju endap darah. Nilai rujukan wanita : 0 – 15 mm/jam Nilai rujukan pria : 0 – 10 mm/jam Catatan: Pada pasien dengan dehidrasi, pengukuran LED tidak terlalu bermakna. Nilai yang tinggi Peningkatan LED terjadi pada penyakit-penyakit yang disertai dengan perubahan komposisi protein plasma, antara lain pada infeksi akut dan kronis, il1fark miokardium, serta artritis reumatoid. Pada pasien dengan anemia, LED juga dapat meningkat (lihat halaman 276). Nilai LED yang sangat tinggi ditemukan pada tuberkulosis, tripanosomiasis, dan keganasan. Peningkatan LED juga terjadi pada kehamilan.

K. BESI SERUM menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology) Besi dilepaskan dari ikatannya dengan transferrin, direduksi dari bentuk Fe3+ menjadi Fe2+ dan serum protein dipresipitasi dengan menggunakan reagen asam campuran (mixed acid reagent). Besi ferro dalam supernatan direaksikan dengan larutan kromogenakan membentuk komplek warna (pink solution)dan dibaca dengan fotometer pada panjang gelombang 562 nm. Dengan metode Colorimetric-Ferrozine Ikatan antara ferri (Fe3+) dan transferin dilepaskan oleh guanidine dalam suasana pH 4,8. Selanjutnya asam askorbat akan mereduksi ion ferri (Fe3+) menjadi ferro (Fe2+), kemudian Fe2+ akan bereaksi dengan ferrozine membentuk komplek berwarna.

Bahan pemeriksaan 1. Utama

Bahan utama pemeriksaan yang digunakan untuk pemeriksaan besi adalah serum 2. Pilihan Selain menggunakan bahan pemeriksaan serum, dapat juga menggunakan bahan pemeriksaan berupa plasma heparin dan plasma EDTA. 3. Reagen a) Menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology) -

Protein precipitant 100 g/L trichloracetic acid (0,61 M) dan 30 ml/L thioglycollic acid dalam 1 mol/L HCl. Larutan ini stabil selama 2 bulan dalam gelap.Karena pertimbangan masalah kesehatan dan keamanan pada penggunaan thioglycollic acid, maka ascorbic acid digunakan sebagai alternatif agen reduktor, meskipun mungkin lebih dipengaruhi oleh adanya copper. Dalam 45 ml HCl 1mol/L ditambahkan 5 ml larutan trichloracetic acid 6,1 mol/L, kemudian ditambahkan lagi dengan 200 mg ascorbic acid kemudian dicampur.

-

Larutan kromogen 25mg ferrozine dilarutkan dalam 100 ml sodium acetate 1,5 mol/L. Larutan ini dapat stabil hingga 4 minggu bila disimpan dalam gelap.

-

Larutan standar besi (80 μmol/l) o Tambahkan 200 μL HCl 2 mol/L dalam 22,1 ml deionized water, dan campur. o Tambahkan 100 μL larutan standar besi (1000 μg Fe/mL dalam 1 % HCl) dan campur. o Stabil hingga 2 bulan pada suhu ruangan

b) Metode Colorimetric-Ferrozine -

Reagen 1 : R1 Acetate buffer, pH 4,8 Guanidine hydrochloride Thiourea

-

Reagen 2 : R2

100 mmol/L 5

mol/L

52,5 mmol/L

Ascorbic acid -

Reagen 3 : R3 Ferrozine

-

41 mmol/L

Standar : Std 100 μg/dL

Iron

1mg/L 17,9 μmol/L

Prosedur a) Menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology) 1. Masukkan ke dalam tabung, masing-masing 0,5 ml serum, 0,5 ml larutan kerja standar besi, dan 0,5 ml iron-free water sebagai blanko. 2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 0,5 ml protein precipitant, kemudian campur, selanjutnya diamkan selama 5 menit 3. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm selama 4 menit. untukmengendapkan protein dan mendapatkan supernatan.Ambil 0,5 ml supernatan dan 0,5 ml campuran pada tabung lainnya. Kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml larutan kromogen dan campur dengan baik. 4. Tunggu selama 10 menit 5. Ukur absorbans pada panjang gelombang 562 nm. 6. Penghitungan : Serum iron =

Atest-Ablanko

x 80

Astandar-A blanko Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit Terbentuknya komplek warna akan terlambat, bila menggunakan plasma EDTA, dan harus ditunggu selama 15 menit sebelum diukur absorbansnya. b) Menggunakan Metode Colorimetric-Ferrozine

1. Larutan kerja (Working reagent) :Larutkan 1 sendok takar R2 dalam 50 ml R1. Tunggu hingga tercampur dengan baik. Larutan ini stabil selama 2 minggu pada suhu 2-8o C, dan 3 hari pada suhu 20-25o C. 2. Kemudian lakukan sesuai tabel dibawah ini : Blanko

Standar

Sampel

Larutan kerja

500 μL

500 μL

500 μL

Akuades

150 μL

-

-

Standar

-

150 μL

-

Sampel

-

-

4. Campurkan dan baca absorbans (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 50 detik Blanko

Standar

Sampel

-

A1

A2

Blanko

Standar

Sampel

25 μL

25 μL

5. Kemudian tambahkan :

Reagen 3 (R3)

25 μL

6. Campurkan dan baca absorbance (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 325 detik Blanko

Standar

Sampel

-

A3

A4

7. Penghitungan : A4-A2

X konsentrasi standar

A3-A1

L. TOTAL IRON BINDING CAPACITY (TIBC)  menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology)

Pada serum ditambahkan besi yang berlebih (ferri klorid). Besi yang tidak terikat transferin akan diabsorbsi oleh magnesium carbonate, kemudian kadar besi serum diukur. 

Metode Saturasi TIBC dievaluasi setelah saturasi transferin oleh larutan besi, dan kelebihan besi akan diabsorbsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah disentrifus, konsentrasi besi dalam supernatan diukur.

Bahan pemeeriksaan 1. Utama Bahan utama pemeriksaan yang digunakan untuk pemeriksaan besi adalah serum 2. Pilihan Selain menggunakan bahan pemeriksaan serum, dapat juga menggunakan bahan pemeriksaan berupa plasma heparin dan plasma EDTA. 3. Reagen a) Direkomendasikan ICSH -

Basic magnesium carbonate

-

Saturating solution (100 μmol Fe/L). o Tambahkan 17,7 ml deionized water, 100 μL HCl 1mol/L, 100 μL larutan standar.(Saturating iron solution mengandung 5,6 μg Fe/mL)Campur o Stabil dalam 2 bulan pada suhu ruangan.

b) Metode Saturasi -

Reagen 1 : R1 Iron saturating solution

500 μg/dL 5

mg/L

89,5 μmol/L -

Reagen 2 : R2 Magnesium hydroxide carbonate(1 sendok takar = 100 mg)

Prosedur

a) Direkomendasikan oleh ICSH 7. Masukkan 0,5 ml serum ke dalam tabung 8. Kemudian tambahkan 0,5 ml saturating iron solution, campur dengan hati-hati, dan diamkan selama 15 menit pada suhu ruangan. 9. Tambahkan 100 mg light magnesium carbonate, tutup tabung dan bolak-balik tabung, diamkan selama 30 menit dengan sekali-kali diaduk 10. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan. 11. Periksa supernatan, jika masih sisa magnesium carbonate harus disentrifus ulang. 12. Ambil supernatannya sebanyak 0,5 ml dan perlakukan seperti pada pemeriksaan serum iron. 13. Hasil akhir dikalikan 2 Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit b) Metode Saturasi 1. Sampel 0,5 ml dicampurkan dengan 1 ml reagen R1, diinkubasi selama 5 menit 2. Kemudian tambahkan 1 sendok takar ( kira-kira 100 mg) reagen R2, dan diinkubasi selama 20 menit, dengan sekali-kali dikocok. 3. Sentrifus selama 10 menit dengan 3000 rpm 4. Ambil supernatannya. 5. Periksa supernatan seperti pada penentuan SI. Dengan 1 bagian supernatan : 3 bagian reagen R1 (pada SI).

M. FERRITIN SERUM  Metoda Elisa Double Sandwich

Pemeriksaan feritin serum memakai metode ELISA dengan cara double sandwich. Antibodi dengan high affinity terhadap feritin (antiferitin Ig G) akan berikatan dengan feritin serum dan selanjutnya dilabel dengan enzim horseradish peroxidase dan dibaca absorbannya pada panjang gelombang 492 nm. 

Metode IRMA (Immunoradiometric Assay) Antibodi yang dilabel dengan radioaktif yang berlebih direaksikan dengan ferritin. Ferritin yang tidak berikatan dengan antibodi akan dihilangkan dengan immunoadsorbent

Bahan pemeeriksaan 1. Utama Bahan utama pemeriksaan yang digunakan untuk pemeriksaan besi adalah serum 2. Pilihan Selain menggunakan bahan pemeriksaan serum, dapat juga menggunakan bahan pemeriksaan berupa plasma heparin dan plasma EDTA. 3. Reagen Metode ELISA Double Sandwich -

Preparat antiferitin Ig G yang dikonjugasi dengan horseradish peroxidase

-

Larutan standar feritin. Dibuat dengan cara o Encerkan human ferritin 200 µg/ml ke dalam air. Encerkan larutan feritin 200 µg/ml ke dalam 10 µl/ml dalam 0,05 mol/l larutan sodium barbitone (yang terdiri dari 0,1 mol/l NaCl, 0,02% NaN dan BSA 5 gr/dl), pH disesuaikan sampai pH 8 dengan menambah HCl 5 mol/l. o Bagi dalam 200 tabung kecil, masing-masing berisi 200 µl, tutup rapat dan tahan sampai 1 tahun pada suhu 40C o Jika akan dipakai, encerkan dengan buffer B sampai 1000 µg/l dan siapkan larutan dalam range 0,2 – 25 µg/l (bandingkan dengan standar WHO untuk uji serum ferritin 94/572)

-

Buffer A : Phosphate-buffered saline pH 7,2

-

Buffer B : 5 gram BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 1 liter buffer A

-

Buffer C: Carbonate buffer pH 9,6

-

Buffer D : Citrate phosphate buffer pH 5.

-

Larutan substrat

Prosedur Metode ELISA Double Sandwich 1. Lapisi microtitreplate, dengan cara : -

Preparat antiferitin Ig G diencerkan dengan 2 µg/ml buffer C, tambahkan 200 µl ke dalam tiap-tiap sumuran.

-

Tutup dan inkubasi semalam pada suhu 40C. Kosongkan sumuran dengan cara dibalik dan di-tapping pada handuk kering.

-

Tambahkan 200 µl 0,05% BSA dalam buffer C, diamkan 30 menit dalam suhu ruangan.

-

Cuci tiap sumuran dengan buffer A sampai 3x. plate dapat disimpan sampai 1 minggu pada tempat kering dan suhu 40C

2. Encerkan 50 µl serum pasien dengan 1 ml buffer B. 3. Tambahkan 200 µl larutan standard dan serum pasien ke dalam tiap sumuran dalam waktu 20 menit. 4. Tutup dan diamkan selama 20 menit pada suhu kamar dan jauhkan dari sinar matahari 5. Kosongkan sumuran dan cuci 3x dengan buffer A. 6. Tambahkan 200 µl preparat konjugasi antiferitin Ig G dengan horseradish peroxidase yang sudah diencerkan, tutup dan diamkan selama 2 jam pada suhu kamar. 7. Cuci 3x dengan buffer A 8. Tambahkan 200 µl larutan substrat pada tiap-tiap sumuran, inkubasi selama 30 menit. 9. Tambahkan 50 µl asam sulfur 4M pada tiap-tiap sumuran untuk menghentikan reaksi

10. Tunggu 30 menit dan baca absorbannya pada 492 nm dengan microtitre plate reader, atau ambil 200 µl larutan dari tiap sumuran dan masukkan dalam 800 µl air, baca dengan fotometer. Implikasi Klinik - Kekurangan Zat Besi 2. Perdarahan yang mengakibatkan hilangnya zat besi dari tubuh menyebabkan kekurangan zat besi yang harus diobati dengan pemberian zat besi tambahan. 3. Kekurangan zat besi juga bisa merupakan akibat dari asupan makanan yang tidak mencukupi. 4. Kekurangan seperti ini sering terjadi selama kehamilan karena sejumlah besar zat besi harus disediakan ibu untuk pertumbuhan janin. 5. Anemia karena kekurangan zat besi juga bisa terjadi pada remaja putri yang sedang tumbuh dan mulai mengalami siklus menstruasi, jika mereka mengkonsumsi makanan yang tidak mengandung daging. 6. Bila

cadangan

besi

dalam

tubuh

berkurang,

dapat

terjadi

anemia.

Gejalanya berupa: -

pucat

-

'kuku sendok' (spoon nails, suatu kelainan bentuk dimana kuku-kuku tampak tipis dan berbentuk cekung/berlekuk)

-

kelemahan yang disertai dengan berkurangnya kekuatan otot

-

perubahan dalam tingkah laku kognitif.

Diagnosa ditegakkan berdasarkan gejala-gejala dan hasil pemeriksaan darah yang menunjukkan adanya anemia dan kadar zat besi dan feritin yang rendah (feritin adalah protein yang mengandung/menyimpan zat besi). -

Kelebihan Zat Besi 1. Kelebihan zat besi bisa menyebabkan keracunan, dimana terjadi muntah, diare dan kerusakan usus.

2. Zat besi dapat terkumpul di dalam tubuh jika seseorang: -

mendapatkan terapi zat besi dalam jumlah yang berlebihan atau dalam waktu yang terlalu lama

-

menerima beberapa tranfusi darah

-

menderita alkoholisme menahun.

Hemokromatosis merupakan penyakit kelebihan zat besi yang diturunkan, yang bisa berakibat fatal tetapi mudah diobati, dimana terlalu banyak zat besi yang diserap, menyerang lebih dari 1 juta orang di AS.

Biasanya gejala-gejalanya tidak timbul sampai usia pertengahan dan berkembang secara tersembunyi, berupa: -

kulit menjadi berwarna merah tembaga

-

sirosis

-

kanker hati

-

diabetes

-

gagal jantung, yang bisa berkembang menyebabkan kematian mendadak.

Gejala-gejala lainnya adalah: -

artritis

-

kemandulan

-

hipotiroid

-

kelelahan menahun.

Measurement Serum Iron (SI)

Serum TIBC

Increased Iron overload Liver disease Chronic alcoholism Hypoplastic anaemia Haemolysis/ineffective Iron deficiency erythropoiesis Pregnancy Oral contraceptive

Decreased Iron deficiency Infection/inflamation Anaemia of chronic disorder

Iron overload Infection/inflamation Anaemia of chronic disorder

Mekanisme abnormal: Dalam makanan terdapat 2 macam zat besi, yaitu besi heme dan non heme. Besi heme terdapat pada hampir semua jenis makanan hewani antara lain daging, ikan, ayam, hati, dll. Sedangkan besi non heme terdapat dalam sayuran hijau, kacang-kacangan, kentang, dan sebagainya. Dengan kata lain, Mira kekurangan besi heme yang sangat dibutuhkan untuk keseimbangan tubuh.

Eritrosit dibuat di sumsum tulang dan mengandung hemoglobin yang berfungsi sebagai alat transpor oksigen. Molekul hemoglobin terdiri dari globin, protoporfuin dan besi. Globin dibentuk sekitar ribosom sedangkan protoporfirin dibentuk sekitar mitokondria. Besi didapat dari transferin. Pada permulaan sel eritrosit berinti terdapat reseptor transferin. Karena kadar Fe dalam darah yang rendah, mengakibatkan sitoplasma sel eritrosit berinti gagal mengikat Fe untuk pembentukan hemoglobin. Penyebab ketidak berhasilan eritrosit berinti untuk mengikat besi dapat juga disebabkan oleh rendahnya kadar transferin dalam darah. Hal ini karena sel eritrosit berinti maupun retikulosit hanya memiliki reseptor transferin bukan reseptor Fe. Yang dapat terikat dengan transferin hanya Fe elemental dan untuk membentuk 1 ml packed red cells diperlukan 1 mg Fe elemental. Sehingga terjadilah penurunan kadar hemoglobin dalam darah. Diperlukan beberapa jenis enzim dalam kadar yang cukup agar eritrosit dapat bertahan dalam bentuk aktif selama 120 hari. Kekurangan enzim-enzim ini akan menyebabkan eritrosit tidak dapat bertahan cukup lama dan menyebabkan umur eritrosit tadi kurang dari 120 hari. Ada dua enzim yang berperan penting yaitu piruvat kinase dan glukose 6-fosfat dehidrokinase (G6PD).