Lezione 6
This document was uploaded by user and they confirmed that they have the permission to share it. If you are author or own the copyright of this book, please report to us by using this DMCA report form. Report DMCA
Overview
Download & View Lezione 6 as PDF for free.
More details
- Words: 1,304
- Pages: 33
SENESCENZA APOPTOSI
MITOSI TRASFORMAZIONE
DIFFERENZIAMENTO
STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA: Permette di determinare le differenze qualitative e quantitative dei geni espressi in un tipo cellulare in un dato momento
RNAm
NON è nota la natura dei geni che si vogliono studiare
E’ nota la natura dei geni che si vogliono studiare
. .
PCR REAL-TIME MICROCHIP A DNA
. .
VISUALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DI RNAm LA SAGE
La RT-PCR REAL TIME Permette di analizzare l’espressione di pochi geni noti: necessita di primers specifici per l’amplificazione del cDNA corrispondente
RT-PCR +
RNA
FASE ESPONENZIALE: ciascun prodotto di amplificazione raddoppia esattamente ad ogni ciclo di amplificazione FASE LINEARE (alta variabilità): i componenti della reazione sono stati consumati, la reazione sta rallentando ed i prodotti si stanno degradando FASE DI PLATEAU: la reazione si è fermata, non si creano più prodotti e se si attende troppo, essi si degradano
La reazione di amplificazione viene monitorata attraverso l’emissione di fluorescenza
Una fibra ottica rileva la fluorescenza via via che la reazione procede
In che modo si produce la fluorescenza durante la reazione?
1) La FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)
1) Si aggiunge alla miscela di reazione un oligonucleotide che ha un emettitore di fluorescenza a bassa energia in vicinanza di un emettitore a forte energia :trasferimento di energia all’emettitore debole
3) La digestione separa i due emettitori: cambio di fluorescenza
2) La DNA-polimerasi rimuove le basi (attività 5’-esonucleasica)
Il SYBR GREEN Scarsa fluorescenza
I MICROCHIP A DNA Permettono di monitorare l’espressione di decine di migliaia di geni, purchè noti
Microchip di cDNA Microchip di oligo-dNTP
Marcatura dell’RNAm
Permette di fare trascrizione
in vitro
Si possono marcare gli RNAm da cellule diverse con diverse fluorescenze
QUANTIFICAZIONE DELL’ESPRESSIONE Per valutare la specificità di segnale le sonde vengono sintetizzate come: -PERFECT MATCH (sequenza completamente omologa) segnale SPECIFICO + RUMORE -MISMATCH (sequenza con una mutazione) RUMORE Segnale specifico= PERFECT MATCH - MISMATCH
-Come controllo QUANTITATIVO si ibridano delle sonde con RNAm aggiunti in quantità nota: STANDARD DI RIFERIMENTO
INTERPRETAZIONE DEI DATI software
1 posizione della sonda e intensità
2 correlazione tra posizione della sonda sul microchip ed identità dell’RNAm che ad essa si lega
LA VISUALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DI RNAm Permette di individuare geni espressi in maniera differenziale, di cui la natura può anche NON essere nota
RNAm espressi durante lo sviluppo embrionale del cuore del ratto (gg. 10, 11, 12, 16) Restringe il numero di RNAm retrotrascritti (1/4)
(si ottengono TAG di diversa lunghezza)
Marcatura delle TAG
autoradiografia
La TAG può essere recuperata ed usata come sonda per lo screening di una library o clonata in un vettore e sequenziata
La SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
Dr.Victor E. Velculescu
Permette una rapida, dettagliata analisi quantitativa, qualitativa e simultanea di migliaia di trascritti, anche NON noti
Principi su cui si basa la SAGE: 1)
Una TAG di circa 9-10 bp contenuta in una posizione definita di un trascritto contiene sufficiente informazione per identificarlo in maniera univoca.
49 = 262.144geni trascritti ≈ 20-25.000 2)
(conto attuale: media/gene 2700bp; 411)
La concatenazione di tali TAGs permette l’efficiente analisi seriale di trascritti, mediante il sequenziamento di TAGs multiple concatenate all’interno di un singolo clone
Requisiti necessari: Informazioni sull’ORIENTAMENTO e sui CONFINI tra TAGs adiacenti
Estrazione dell’RNA totale Purificazione dell’RNAm
.
Sintesi del cDNA con un oligo-dT biotinilato
BIOTINA (vit. H)
.L’AE (enzima di ancoraggio) NlaIII taglia nella sequenza 5'-GTAC, lasciando 4 basi sporgenti in 3’ Sferette coperte di STREPTAVIDINA (Streptomyces avidinii)
Taglia ogni 44 basi
3’
.
I frammenti biotinilati vengono isolati con
sferette coperte di streptavidina
Il campione viene diviso in due provette e ciascuna aliquota viene legata al linker A o B grazie alla codina di GTAC
I LINKERS sono costituiti da: - sito unico di legame a un primer per PCR (A e B) -sito di riconoscimento 5’-GGGAC per uno stesso enzina TE (Tagging Enzyme) (BmsFI) -estremità sticky complementari a GTAC
.
Taglio con BmsFI (TE)
BmsF1 appartiene agli enzimi di restrizione del tipo IIS: riconoscono un sito di riconoscimento asimmetrico, ma tagliano fino a 20 bp di distanza da esso: nel caso di BmsF1 vengono mantenute legate al linker delle TAG di ciascun cDNA di 9 bp
.I campioni delle due provette vengono riuniti e sottoposti a ligazione
.Mediante amplificazione per PCR utilizzando come primers A e B si ottiene l’amplificazione solo delle Ditags orientate testa/testa
Le Ditag vengono tagliate con l’EA e, grazie alle estremità stricky generate, vengono concatenate. Centinaia di Ditag concatenate vengono clonate in un vettore e sottoposte a sequenziamento in un unico round
Un software analizza la sequenza ottenuta: è possibile attribuire la sequenza ad ogni Tag, dato che si conosce la punteggiatura tra Ditag (sito AE) e l’orientamento delle singole Tag nelle Ditag (testa/testa). La sequenza della Tag può essere utilizzata per determinare l’RNAm da cui è stata estratta (banca dati o screening di library) (informazione QUALITATIVA). La frequenza con la quale una stessa Tag ricorre ci dice QUANTO un gene è espresso.
Inizialmente nata per accelerare il Sequenziamento delle EST nella prima Fase del Progetto Genoma Umano, Ora la SAGE viene utilizzata per determinare le variazioni dell’espressione genica indotte dall’innesco di programmi biologici diversi
CAPITO ORA PERCHE’?
La TRANSGENESI ANIMALE
-Bioreattori animali -Animali con caratteristiche più vantaggiose
Cervo catarifrangente
Studio della funzione biologica di un gene: il modello del topo transgenico
La ghiandola mammaria come bioreattore
-Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore -può produrre fino a 10g/l di proteina transgenica -è più economico dei comuni fermentatori -produce corrette modificazioni post-traduzionali -nel latte ci sono poche proteine (agevola la purificazione) -si recuperano nel latte anche proteine di membrana
Per ottenere l’espressione Del transgene solo nella Ghiandola mammaria, Vi si clona a monte il promotore Di un gene che è espresso Selettivamente in quel tessuto (es: caseina, beta-lactoglobulina)
Se si induce l’espressione dell’enzima lactasi, si ottiene latte a basso tenore di lattosio
Un modello sperimentale importante: IL TOPO TRANSGENICO
-Regolazione genica -Sviluppo dei tumori -Sviluppo della specificità immunitaria -Genetica molecolare dello sviluppo -Ecc…
.METODO DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA
-Fattibilità della produzione industriale di farmaci destinati all’uomo -Modelli biomedici per lo studio di malattie Genetiche dell’uomo
.METODO DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI MANIPOLATE
.METODO DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA Induzione di superovulazione: Siero di cavalla gravida 48 ore
Gonadotropina corionica umana
Accoppiamento con un Maschio vasectomizzato
Meno del 5% della prole è transgenica
.METODO DELLE CELLULE STAMINALI Topini neri
EMBRIONALI (ES) MANIPOLATE
Si pilota l’integrazione di un transgene in un sito cromosomico definito con la metodica della SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA: 1) Arricchimento in ES ricombinanti 2) Selezione di ES in cui è andato a buon fine il gene targeting
Selezione di cellule con giusto gene targeting
Si usano due farmaci: G418 + ganciclovir
GANCICLOVIR (Gcv)= analogo nucleosidico antierpetico HSV-tk
Gcv
Mamm-tk
Gcv-P
Gcv-PPP
Incorporazione nel DNA
Terminazione della catena e rotture nel DNA
tk1/tk2: HSV-tk HB1/HB2: box di omologia con il sito di integrazione nel cromosoma Neor: resistenza al G418
A) Almeno un HSV-tk viene integrato nel genoma: col ganciclovir le cellule muoiono B) Nessun HSV-tk viene integrato nel genoma: le cellule sopravvivono
TG: transgene
Prima di procedere alla iniezione nella blastocisti si verifica la corretta Integrazione nel cromosoma mediante PCR
P1: primer che ibrida in un Segmanto Esclusivo (US) del DNA del vettore P2: primer che ibrida in una regione del cromosoma (CS) adiacente al sito di ricombinazione omologa
Blastocisti accettrice di topini bianchi
Determinazione del Transgenico “fondatore” Per ottenere un topo transgenico omozigote è sufficiente incrociare due fondatori transgene
ALCUNE APPLICAZIONI PARTICOLARI DEI TRANSGENI
. L’espressione di un transgene può essere indirizzata in tessuti specificicon i PROMOTORI TESSUTO-SPECIFICI
T ag (antigene T): inattiva p53 e RB L’espressione selettiva negli isolotti di Langerhans provoca l’insorgenza di tumori al pancreas
Il transgene è soggetto alle stesse vie regolative del gene endogeno regolato da quel promotore specifico
.I transgeni come KILLERS di tipi cellulari specifici: Promotore cellulo-specifico/gene killer (es. HSV-tk)
MITOSI TRASFORMAZIONE
DIFFERENZIAMENTO
STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA: Permette di determinare le differenze qualitative e quantitative dei geni espressi in un tipo cellulare in un dato momento
RNAm
NON è nota la natura dei geni che si vogliono studiare
E’ nota la natura dei geni che si vogliono studiare
. .
PCR REAL-TIME MICROCHIP A DNA
. .
VISUALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DI RNAm LA SAGE
La RT-PCR REAL TIME Permette di analizzare l’espressione di pochi geni noti: necessita di primers specifici per l’amplificazione del cDNA corrispondente
RT-PCR +
RNA
FASE ESPONENZIALE: ciascun prodotto di amplificazione raddoppia esattamente ad ogni ciclo di amplificazione FASE LINEARE (alta variabilità): i componenti della reazione sono stati consumati, la reazione sta rallentando ed i prodotti si stanno degradando FASE DI PLATEAU: la reazione si è fermata, non si creano più prodotti e se si attende troppo, essi si degradano
La reazione di amplificazione viene monitorata attraverso l’emissione di fluorescenza
Una fibra ottica rileva la fluorescenza via via che la reazione procede
In che modo si produce la fluorescenza durante la reazione?
1) La FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)
1) Si aggiunge alla miscela di reazione un oligonucleotide che ha un emettitore di fluorescenza a bassa energia in vicinanza di un emettitore a forte energia :trasferimento di energia all’emettitore debole
3) La digestione separa i due emettitori: cambio di fluorescenza
2) La DNA-polimerasi rimuove le basi (attività 5’-esonucleasica)
Il SYBR GREEN Scarsa fluorescenza
I MICROCHIP A DNA Permettono di monitorare l’espressione di decine di migliaia di geni, purchè noti
Microchip di cDNA Microchip di oligo-dNTP
Marcatura dell’RNAm
Permette di fare trascrizione
in vitro
Si possono marcare gli RNAm da cellule diverse con diverse fluorescenze
QUANTIFICAZIONE DELL’ESPRESSIONE Per valutare la specificità di segnale le sonde vengono sintetizzate come: -PERFECT MATCH (sequenza completamente omologa) segnale SPECIFICO + RUMORE -MISMATCH (sequenza con una mutazione) RUMORE Segnale specifico= PERFECT MATCH - MISMATCH
-Come controllo QUANTITATIVO si ibridano delle sonde con RNAm aggiunti in quantità nota: STANDARD DI RIFERIMENTO
INTERPRETAZIONE DEI DATI software
1 posizione della sonda e intensità
2 correlazione tra posizione della sonda sul microchip ed identità dell’RNAm che ad essa si lega
LA VISUALIZZAZIONE DIFFERENZIALE DI RNAm Permette di individuare geni espressi in maniera differenziale, di cui la natura può anche NON essere nota
RNAm espressi durante lo sviluppo embrionale del cuore del ratto (gg. 10, 11, 12, 16) Restringe il numero di RNAm retrotrascritti (1/4)
(si ottengono TAG di diversa lunghezza)
Marcatura delle TAG
autoradiografia
La TAG può essere recuperata ed usata come sonda per lo screening di una library o clonata in un vettore e sequenziata
La SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
Dr.Victor E. Velculescu
Permette una rapida, dettagliata analisi quantitativa, qualitativa e simultanea di migliaia di trascritti, anche NON noti
Principi su cui si basa la SAGE: 1)
Una TAG di circa 9-10 bp contenuta in una posizione definita di un trascritto contiene sufficiente informazione per identificarlo in maniera univoca.
49 = 262.144geni trascritti ≈ 20-25.000 2)
(conto attuale: media/gene 2700bp; 411)
La concatenazione di tali TAGs permette l’efficiente analisi seriale di trascritti, mediante il sequenziamento di TAGs multiple concatenate all’interno di un singolo clone
Requisiti necessari: Informazioni sull’ORIENTAMENTO e sui CONFINI tra TAGs adiacenti
Estrazione dell’RNA totale Purificazione dell’RNAm
.
Sintesi del cDNA con un oligo-dT biotinilato
BIOTINA (vit. H)
.L’AE (enzima di ancoraggio) NlaIII taglia nella sequenza 5'-GTAC, lasciando 4 basi sporgenti in 3’ Sferette coperte di STREPTAVIDINA (Streptomyces avidinii)
Taglia ogni 44 basi
3’
.
I frammenti biotinilati vengono isolati con
sferette coperte di streptavidina
Il campione viene diviso in due provette e ciascuna aliquota viene legata al linker A o B grazie alla codina di GTAC
I LINKERS sono costituiti da: - sito unico di legame a un primer per PCR (A e B) -sito di riconoscimento 5’-GGGAC per uno stesso enzina TE (Tagging Enzyme) (BmsFI) -estremità sticky complementari a GTAC
.
Taglio con BmsFI (TE)
BmsF1 appartiene agli enzimi di restrizione del tipo IIS: riconoscono un sito di riconoscimento asimmetrico, ma tagliano fino a 20 bp di distanza da esso: nel caso di BmsF1 vengono mantenute legate al linker delle TAG di ciascun cDNA di 9 bp
.I campioni delle due provette vengono riuniti e sottoposti a ligazione
.Mediante amplificazione per PCR utilizzando come primers A e B si ottiene l’amplificazione solo delle Ditags orientate testa/testa
Le Ditag vengono tagliate con l’EA e, grazie alle estremità stricky generate, vengono concatenate. Centinaia di Ditag concatenate vengono clonate in un vettore e sottoposte a sequenziamento in un unico round
Un software analizza la sequenza ottenuta: è possibile attribuire la sequenza ad ogni Tag, dato che si conosce la punteggiatura tra Ditag (sito AE) e l’orientamento delle singole Tag nelle Ditag (testa/testa). La sequenza della Tag può essere utilizzata per determinare l’RNAm da cui è stata estratta (banca dati o screening di library) (informazione QUALITATIVA). La frequenza con la quale una stessa Tag ricorre ci dice QUANTO un gene è espresso.
Inizialmente nata per accelerare il Sequenziamento delle EST nella prima Fase del Progetto Genoma Umano, Ora la SAGE viene utilizzata per determinare le variazioni dell’espressione genica indotte dall’innesco di programmi biologici diversi
CAPITO ORA PERCHE’?
La TRANSGENESI ANIMALE
-Bioreattori animali -Animali con caratteristiche più vantaggiose
Cervo catarifrangente
Studio della funzione biologica di un gene: il modello del topo transgenico
La ghiandola mammaria come bioreattore
-Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore -può produrre fino a 10g/l di proteina transgenica -è più economico dei comuni fermentatori -produce corrette modificazioni post-traduzionali -nel latte ci sono poche proteine (agevola la purificazione) -si recuperano nel latte anche proteine di membrana
Per ottenere l’espressione Del transgene solo nella Ghiandola mammaria, Vi si clona a monte il promotore Di un gene che è espresso Selettivamente in quel tessuto (es: caseina, beta-lactoglobulina)
Se si induce l’espressione dell’enzima lactasi, si ottiene latte a basso tenore di lattosio
Un modello sperimentale importante: IL TOPO TRANSGENICO
-Regolazione genica -Sviluppo dei tumori -Sviluppo della specificità immunitaria -Genetica molecolare dello sviluppo -Ecc…
.METODO DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA
-Fattibilità della produzione industriale di farmaci destinati all’uomo -Modelli biomedici per lo studio di malattie Genetiche dell’uomo
.METODO DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI MANIPOLATE
.METODO DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA Induzione di superovulazione: Siero di cavalla gravida 48 ore
Gonadotropina corionica umana
Accoppiamento con un Maschio vasectomizzato
Meno del 5% della prole è transgenica
.METODO DELLE CELLULE STAMINALI Topini neri
EMBRIONALI (ES) MANIPOLATE
Si pilota l’integrazione di un transgene in un sito cromosomico definito con la metodica della SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA: 1) Arricchimento in ES ricombinanti 2) Selezione di ES in cui è andato a buon fine il gene targeting
Selezione di cellule con giusto gene targeting
Si usano due farmaci: G418 + ganciclovir
GANCICLOVIR (Gcv)= analogo nucleosidico antierpetico HSV-tk
Gcv
Mamm-tk
Gcv-P
Gcv-PPP
Incorporazione nel DNA
Terminazione della catena e rotture nel DNA
tk1/tk2: HSV-tk HB1/HB2: box di omologia con il sito di integrazione nel cromosoma Neor: resistenza al G418
A) Almeno un HSV-tk viene integrato nel genoma: col ganciclovir le cellule muoiono B) Nessun HSV-tk viene integrato nel genoma: le cellule sopravvivono
TG: transgene
Prima di procedere alla iniezione nella blastocisti si verifica la corretta Integrazione nel cromosoma mediante PCR
P1: primer che ibrida in un Segmanto Esclusivo (US) del DNA del vettore P2: primer che ibrida in una regione del cromosoma (CS) adiacente al sito di ricombinazione omologa
Blastocisti accettrice di topini bianchi
Determinazione del Transgenico “fondatore” Per ottenere un topo transgenico omozigote è sufficiente incrociare due fondatori transgene
ALCUNE APPLICAZIONI PARTICOLARI DEI TRANSGENI
. L’espressione di un transgene può essere indirizzata in tessuti specificicon i PROMOTORI TESSUTO-SPECIFICI
T ag (antigene T): inattiva p53 e RB L’espressione selettiva negli isolotti di Langerhans provoca l’insorgenza di tumori al pancreas
Il transgene è soggetto alle stesse vie regolative del gene endogeno regolato da quel promotore specifico
.I transgeni come KILLERS di tipi cellulari specifici: Promotore cellulo-specifico/gene killer (es. HSV-tk)
