Lezione 6
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- Words: 659
- Pages: 14
Il concetto di specie microbica Il concetto di specie usato per piante ed animali non si applica ai procarioti. Il concetto di specie microbica non ha una base teorica solida, ma tende ad essere arbitrario, antropocentrico o guidato da necessità pratiche. Il sequenziamento e la comparazione di interi genomi: miglior metodo di tassonomia molecolare.
Approccio tassonomico tradizionale L’approccio molecolare mediante ibridazione DNADNA (DDH) è il metodo di riferimento. Sia il contenuto in geni che le similarità nucleotidiche di geni condivisi contribuiscono a una misura della parentela genomica complessiva di due isolati. L’identità di specie tra due diversi isolati è determinata da almeno il 70% di ibridazione tra i due genomi in condizioni standard. I dati di DDH sono in accordo con risultati recenti che utilizzano il sequenziamento di interi genomi o analisi multilocus.
La tecnica DDH
Limiti della tecnica DDH Pochi laboratori usano questo metodo. I motivi:
attualmente
non adatta ad una identificazione veloce non adatta per la classificazione di procarioti che attualmente risultano noncoltivabili
prevede la comparazione di due genomi per volta, non è possibile fare riferimento ad una banca dati
Approccio tassonomico più usuale
Attualmente, nuovi isolati vengono comparati tra loro e con taxa noti determinando le similarità di sequenza nei loro geni 16S rDNA.
Sequenziamento del gene rRNA 16S Coltura pura
Primer universali
∼1500 bp
oppure clonaggio delle sequenze amplificate
Risultato dell’approccio tassonomico molecolare
Allineamento delle sequenze degli amplificati 16S rRNA
Calcolo della distanza evolutiva
Albero filogenetico
Differenziazione tra batteri utilizzando l’analisi del 16S rRNA Due isolati appartengono alla stessa specie se mostrano almeno il 97% di identità a livello della sequenza del gene 16S rRNA. Due isolati appartengono allo stesso genere se mostrano il 93-95% di identità
Risultati discordanti Percentuale di similarità del 16S rRNA
Le sequenze di 16S rDNA sono molto conservate e non forniscono sufficiente risoluzione per esplorare le parentele tra popolazioni batteriche strettamente imparentate.
Percentuale di similarità genomica DNA/DNA
Esiste la specie microbica ? La trasformazione, coniugazione e trasduzione determinano scambio orizzontale (o laterale) di DNA tra batteri ed acquisizione di nuove sequenze (differenze genomiche) e di nuove capacità (differenze fenetiche). Più che la parentela filogenetica sembra essere l’ambiente l’elemento determinante nello scambio di DNA. Lo scambio di DNA tra batteri di un taxa o di taxa diversi potrebbe rendere difficile la corretta assegnazione di specie.
Nuovo approccio tassonomico La sequenza del gene 16S rRNA è più utile per assegnare un isolato ad un genere, mentre il metodo Multi Locus Sequences Typing (MLST) può aiutarci ad identificare raggruppamenti in ramificazioni più profonde (evolutivamente più recenti) e quindi raggruppare diversi isolati nelle principali linee genetiche a livello di specie. La MLST utilizza l’analisi di sequenza (circa 500 bp) di diversi (6-7) geni “housekeeping” che sono meno conservati del 16S rDNA. I geni vengono concatenati in un’unica sequenza la cui analisi viene usata per costruire un albero. Ha il vantaggio che l’analisi di più geni diminuisce gli effetti della ricombinazione ad un singolo locus.
Approccio tassonomico polifasico Per definire una specie microbica, i microbiologi dovrebbero usare un approccio polifasico, che utilizza ed integra diversi tipi di dati ed informazioni, con lo scopo di raggiungere una classificazione condivisa delle entità biologiche e che contiene un minimo di contraddizioni.
Schema approccio tassonomico polifasico isolato Analisi fenetica
Sequenza 16S rDNA
Posizione filogenetica
Ibridazione DNA-DNA
Identità di specie
NON CORRISPONDE classificazione
Confronto con specie note
Analisi genomica o filogenetica
Analisi numerica Analisi chemiotassonomica Fingerprinting DNA e rDNA
CORRISPONDE identificazione
Esempio di analisi tassonomica polifasica La caratterizzazione tassonomica polifasica di isolati inizia con un’analisi degli acidi grassi cellulari (metodo chemiotassonomico)
e una serie di metodi di tipizzazione basati sull’analisi del DNA (AFLP, utilizzo in PCR di primer casuali) che sono relativamente facili, veloci ed automatizzabili. Si ottengono dei raggruppamenti. Successivamente le analisi 16S rRNA di rappresentanti di questi raggruppamenti sono comparate con quelle di specie note, determinandone la posizione filogenetica. Vengono selezionati microrganismi filogeneticamente vicini che vengono saggiati con esperimenti di DDH per l’appartenza di specie.
Approccio tassonomico tradizionale L’approccio molecolare mediante ibridazione DNADNA (DDH) è il metodo di riferimento. Sia il contenuto in geni che le similarità nucleotidiche di geni condivisi contribuiscono a una misura della parentela genomica complessiva di due isolati. L’identità di specie tra due diversi isolati è determinata da almeno il 70% di ibridazione tra i due genomi in condizioni standard. I dati di DDH sono in accordo con risultati recenti che utilizzano il sequenziamento di interi genomi o analisi multilocus.
La tecnica DDH
Limiti della tecnica DDH Pochi laboratori usano questo metodo. I motivi:
attualmente
non adatta ad una identificazione veloce non adatta per la classificazione di procarioti che attualmente risultano noncoltivabili
prevede la comparazione di due genomi per volta, non è possibile fare riferimento ad una banca dati
Approccio tassonomico più usuale
Attualmente, nuovi isolati vengono comparati tra loro e con taxa noti determinando le similarità di sequenza nei loro geni 16S rDNA.
Sequenziamento del gene rRNA 16S Coltura pura
Primer universali
∼1500 bp
oppure clonaggio delle sequenze amplificate
Risultato dell’approccio tassonomico molecolare
Allineamento delle sequenze degli amplificati 16S rRNA
Calcolo della distanza evolutiva
Albero filogenetico
Differenziazione tra batteri utilizzando l’analisi del 16S rRNA Due isolati appartengono alla stessa specie se mostrano almeno il 97% di identità a livello della sequenza del gene 16S rRNA. Due isolati appartengono allo stesso genere se mostrano il 93-95% di identità
Risultati discordanti Percentuale di similarità del 16S rRNA
Le sequenze di 16S rDNA sono molto conservate e non forniscono sufficiente risoluzione per esplorare le parentele tra popolazioni batteriche strettamente imparentate.
Percentuale di similarità genomica DNA/DNA
Esiste la specie microbica ? La trasformazione, coniugazione e trasduzione determinano scambio orizzontale (o laterale) di DNA tra batteri ed acquisizione di nuove sequenze (differenze genomiche) e di nuove capacità (differenze fenetiche). Più che la parentela filogenetica sembra essere l’ambiente l’elemento determinante nello scambio di DNA. Lo scambio di DNA tra batteri di un taxa o di taxa diversi potrebbe rendere difficile la corretta assegnazione di specie.
Nuovo approccio tassonomico La sequenza del gene 16S rRNA è più utile per assegnare un isolato ad un genere, mentre il metodo Multi Locus Sequences Typing (MLST) può aiutarci ad identificare raggruppamenti in ramificazioni più profonde (evolutivamente più recenti) e quindi raggruppare diversi isolati nelle principali linee genetiche a livello di specie. La MLST utilizza l’analisi di sequenza (circa 500 bp) di diversi (6-7) geni “housekeeping” che sono meno conservati del 16S rDNA. I geni vengono concatenati in un’unica sequenza la cui analisi viene usata per costruire un albero. Ha il vantaggio che l’analisi di più geni diminuisce gli effetti della ricombinazione ad un singolo locus.
Approccio tassonomico polifasico Per definire una specie microbica, i microbiologi dovrebbero usare un approccio polifasico, che utilizza ed integra diversi tipi di dati ed informazioni, con lo scopo di raggiungere una classificazione condivisa delle entità biologiche e che contiene un minimo di contraddizioni.
Schema approccio tassonomico polifasico isolato Analisi fenetica
Sequenza 16S rDNA
Posizione filogenetica
Ibridazione DNA-DNA
Identità di specie
NON CORRISPONDE classificazione
Confronto con specie note
Analisi genomica o filogenetica
Analisi numerica Analisi chemiotassonomica Fingerprinting DNA e rDNA
CORRISPONDE identificazione
Esempio di analisi tassonomica polifasica La caratterizzazione tassonomica polifasica di isolati inizia con un’analisi degli acidi grassi cellulari (metodo chemiotassonomico)
e una serie di metodi di tipizzazione basati sull’analisi del DNA (AFLP, utilizzo in PCR di primer casuali) che sono relativamente facili, veloci ed automatizzabili. Si ottengono dei raggruppamenti. Successivamente le analisi 16S rRNA di rappresentanti di questi raggruppamenti sono comparate con quelle di specie note, determinandone la posizione filogenetica. Vengono selezionati microrganismi filogeneticamente vicini che vengono saggiati con esperimenti di DDH per l’appartenza di specie.
