Lezione 3
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- Words: 1,643
- Pages: 32
Tecniche di arricchimento e isolamento delle colture batteriche
Come si studiano i microrganismi isolati dall’ambiente Isolare in coltura pura i vari microrganismi presenti nella comunità microbica ed identificarli.
Studiare l’influenza, sulla crescita del microrganismo, di diversi fattori ambientali (calore, pH, pressione idrostatica, radiazioni, pressione d’ossigeno, altri organismi), modificando in laboratorio una variabile per volta. E’ molto importante indagare il rapporto che ogni specie microbica ha con il suo habitat fisico, chimico e biologico (ecologia microbica), per controllare i microrganismi in campo bio-medico (terapia), ambientale (biorisanamento) e industriale (alimenti e fermentazioni).
Schema generale della procedura di arricchimento, isolamento e identificazione delle colture batteriche Ia FASE. Arricchimento e isolamento FONTE Scelta e possibili pretrattamenti
(ARRICCHIMENTO) Di solito selettivo.
IIa FASE. Lavoro con colture pure COLTURE STOCK
CARATTERIZZAZIONE E IDENTIFICAZIONE
ISOLAMENTO PER PIASTRAMENTO Di solito selettivo o selettivo-differenziale
La scelta della fonte
Per individuare e isolare particolari microrganismi dall’ambiente sfruttiamo le nostre conoscenze riguardo le loro caratteristiche nutrizionali, esigenze di temperatura, produzione di particolari metaboliti, etc.
Fonti preferenziali di particolari microrganismi Le conoscenze delle caratteristiche ecologiche, fisiologiche e metaboliche dei microrganismi ci permettono di individuare alcune fonti preferenziali, per alcuni di essi. dal latte andato a male si può isolare facilmente lo Streptococcus lactis, dal formaggio svizzero il Propionibacterium, dalla frutta l’Acetobacter, dalle feci lo Streptococcus fecalis, dal mosto in fermentazione o dal vino il lievito Saccharomyces cerevisiae. Questi ambienti sono equivalenti a terreni di arricchimento.
Perché continuiamo ad isolare gli stessi microrganismi, spesso dalla stessa fonte?
Indagare e sfruttare la biodiversità microbica, anche quella intraspecifica.
La scelta del terreno di coltura
Più informazioni si hanno sulle proprietà di un microrganismo, maggiore è la probabilità di arrivare a definire un terreno di coltura adatto al suo isolamento e mantenimento in laboratorio.
Selezione per arricchimento L’isolamento di specifici tipi microbici è facilitato dall’utilizzo di colture di arricchimento (o colture selettive). Le colture di arricchimento utilizzano combinazioni di nutrienti e condizioni fisiche che soddisfano particolari esigenze nutrizionali o fisiche (temperatura, pH, disponibilità di ossigeno, pressione osmotica) del tipo microbico d’interesse.
L’origine storica delle colture di arricchimento: Beijerinck Isolamento del batterio azoto-fissatore aerobico Azotobacter.
Terreno selettivo privo di fonti di azoto
Terreno non selettivo
L’origine storica delle colture di arricchimento: Winogradsky Alla fine del XIX secolo, Winogradsky notò che, applicando condizioni di crescita equivalenti a campioni diversi di suolo o acqua, si evidenziava una tendenza a produrre la crescita, fra tutti i microrganismi presenti, di alcuni specifici tipi batterici, fisiologicamente simili. La tecnica utilizzata da Winogradsky
Cambiando la fonte di carbonio, cambiano i tipi microbici.
La colonna di Winogradsky Una colonna di vetro riempita con fango ricco di sostanza organica e solfuri, a cui vengono aggiunti substrati carboniosi diversi. La scelta dei substrati determina quali microrganismi prevarranno. Il cilindro viene riempito con acqua (lago, stagno, fossato, mare), coperto e lasciato indisturbato alla luce per diverse settimane per permettere la crescita dei microrganismi presenti nel materiale utilizzato. Foglio di alluminio
Acqua
Alghe e cianobatteri Batteri purpurei non sulfurei
Fango con nutrienti organici e CaSO4
Crescite di batteri purpurei e sulfurei verdi Decomposizione anossica e riduzione del solfato
Isolamento di attinomiceti Negli anni ’50 vennero isolati migliaia di attinomiceti produttori di agenti antibatterici, antivirali e antitumorali. Campioni di suolo, concime organico, acque dolci o atmosfera venivano inoculati in terreni solidi a basso contenuto di zuccheri per limitare la crescita di generi mobili a crescita rapida e facilitare la formazione di colonie di organismi a crescita lenta come gli attinomiceti.
I limiti delle colture di arricchimento L’organismo più adatto al particolare insieme di condizioni di coltura che sono state scelte prende il sopravvento sugli altri membri della comunità e diventa l’organismo dominante. Questo microrganismo potrebbe essere solo un membro minoritario e di rilevanza ecologica ridotta dell’ecosistema microbico in esame. Spesso, per eliminare componenti microbiche minoritarie ma a crescita rapida, il campione ambientale viene diluito prima dell’inoculo in terreno arricchito.
Procedura generale di arricchimento in batteri aerobi o anaerobi Bisogna individuare una nicchia ambientale le cui condizioni sono favorevoli al microrganismo ricercato, per esempio: -
suolo per gli aerobi
-
fango per gli anaerobi
Arricchimento aerobico Isolamento di microrganismi capaci di crescere aerobicamente su benzoato come unica fonte di C e di energia. Senza arricchimento
Con arricchimento
Campione (acqua o suolo) 1 ml o 1g
inoculo in terreno + benzoato
1 ml o 1g
Diluizione in acqua isolamento
piastramento 0,1 ml
+ benzoato
0,1 ml
+ benzoato Risospensione colonie isolate
Piastra con materiale non arricchito
Piastra da procedura di arricchimento isolamento
Arricchimento anaerobico Isolamento, dal fango di uno stagno poco profondo, di microrganismi fotosintetici anaerobi resistenti a brevi esposizioni a bassi livelli di ossigeno. fango
Sviluppo colore porpora
luce Bottiglia con terreno di coltura con sali inorganici e glicerolo, chiusa con tappo di vetro
1 ml
Inoculo in 9 ml di terreno riducente (anaerobiosi) con agar liquefatto
Serie di diluizioni 1:10 nello stesso terreno e in agar liquefatto
NaHCO3 CO2 Glicerolo accettore di elettroni
Crescita a colonie
Provette sigillate con cera e esposte alla luce
Metodi selettivi di arricchimento per specifici tipi metabolici Per ottenere l’isolamento di microrganismi di un particolare tipo metabolico: chemioeterotrofi chemioautotrofi fototrofi è necessario creare condizioni più restrittive/selettive.
Tecnica di arricchimento per l’isolamento di termofili anaerobi
Se, tra i molti microrganismi presenti nel suolo, cerchiamo termofili anaerobi, possiamo incubare del terriccio a 60°C in condizioni anaerobiche.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di microrganismi azotofissatori anaerobi L’eliminazione di prodotti azotati da un terreno di coltura, rende impossibile lo sviluppo di tutti i microrganismi tranne gli azotofissatori. L’esclusione di ossigeno dall’ambiente di coltura impedisce la crescita di microbi aerobi. Con l’esclusione di ossigeno e composti azotati, si svilupperanno solo i batteri azotofissatori anaerobi.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di microrganismi acido-tolleranti Una selezione per arricchimento in microrganismi acido-tolleranti può essere fatta portando il pH del terreno a 4; si impedisce così la crescita della maggior parte dei batteri e nel contempo si favorisce lo sviluppo di una flora microbica acido tollerante composta per lo più da lieviti e muffe.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di microrganismi produttori di enzimi idrolitici Piastra contenente 1 % amido
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di batteri di interesse caseario
Se un terreno preparato con lattato di sodio come unica fonte di carbonio e di energia, si avrà lo sviluppo preferenziale di microrganismi come Propionibacterium (formaggio Emmenthal).
Altri metodi di selezione batterica
Selezione per inibizione
Selezione differenziale
Le procedure di selezione per arricchimento, per inibizione e differenziale possono anche essere combinate tra loro per facilitare l’isolamento dei tipi microbici d’interesse.
Selezione per inibizione
Se aggiungiamo al terreno di coltura sostanze chimiche selettive, che possano eliminare microrganismi che interferiscono con la crescita del microrganismo di interesse, si parla di selezione da inibizione.
Isolamento di batteri acido-lattici mediante selezione per inibizione
L’azide è un inibitore della crescita batterica in quanto agendo sulla citocromo c ossidasi inibisce la respirazione. Introducendo azide in un terreno di coltura nutritivo che contiene un carboidrato fermentabile come fonte di energia si arricchisce in batteri acido lattici che non possiedono citocromi e sono quindi insensibili all’azide.
Selezione per inibizione Il feniletanolo è un batteriostatico specifico per i batteri Gramnegativi. Il terreno di coltura Feniletanolo Agar può essere usato per isolare selettivamente batteri Gram-positivi.
Proteus mirabilis
E. coli
Staphilococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Enterococcus faecalis
Feniletanolo Agar
Selezione differenziale Un microbo può essere isolato semplicemente rendendolo più facilmente riconoscibile, una procedura che viene detta differenziale. La selezione differenziale spesso molecole indicatore.
utilizza
La presenza nel terreno solido di particolari indicatori facilita l’identificazione e isolamento del microrganismo di interesse.
Microrganismi utilizzatori di urea Per isolare un microrganismo in grado di idrolizzare l’urea possiamo utilizzare piastre di terreno solido contenenti urea e un indicatore di pH. Tra le colonie che si svilupperanno, quelle che formano ammoniaca dall’idrolisi dell’urea saranno individuate da un cambiamento di colore dell’indicatore.
Microrganismi che fermentano il cellobiosio
Batteri cellobioso-fermentanti cresciuti su piastre con cellobiosio come unica fonte di carbonio in un terreno agarificato contenente un indicatore di pH, verranno identificati grazie alla variazione di colore determinata dalla produzione acida durante la loro crescita.
Selezione per inibizione e differenziale: EMB Il terreno Eosina Metilene Blue (EMB) agar è un terreno sia selettivo che differenziale. Infatti, i coloranti eosina e blue di metilene inibiscono la crescita dei batteri gram-positivi con selezione dei gram-negativi; allo stesso tempo, la presenza di lattosio permette la differenziazione dei gram-negativi in base alla loro capacità di fermentare questo zucchero.
1:
1
2:
2
Pseudomonas aeruginosa, gram-negativo, non è inhibito. L’assenza di colorazione indica che P. aeruginosa non è capace di fermentare il lattosio.
3:
3
Enterobacter aerogenes, gram-negativo, non è inhibito. Il colore rosa indica che E. aerogenes è capace di fermentare il producendo acidi deboli.
lattasio 4:
4
Escherichia coli, gram-negativo, non è inhibito. Il colore metallico verde brillante indica la capacità di E. coli di fermentare il lattosio producendo acidi forti.
Staphylococcus aureus, gram-positivo, è inibito da eosina e blue di metilene.
Selezione per inibizione e differenziale: MSA Cosa è il terreno MSA. Il mannitolo salt agar (MSA), è un terreno selettivo e differenziale. MSA è selettivo perché contiene una concentrazione di sale (7.5%) che promuove la crescita di alcuni organismi mentre scoraggia quella di altri. MSA è differenziale perché contiene lo zucchero mannitolo e l’indicatore di pH rosso fenolo. Come funziona il terreno MSA. I microrganismi che fermentano il mannitolo producono cataboliti acidi, che causano un viraggio di colore. Infatti, il rosso fenolo è rosso ciliegia sopra pH 8.5, giallo-rosso tra pH 6.9 e 8.5, e giallo brillante a pH 6.9 o più basso. Come viene utilizzato il terreno MSA. MSA viene utilizzato per distinguere il batterio patogeno Staphylococcus aureus da quello non-patogeno S. epidermidis. Infatti, sebbene entrambi possono tollerare l’alta concentrazione salina del terreno MSA, solo S. aureus può fermentare il mannitolo, causando il viraggio dell’indicatore da rosso a giallo.
Keen.mht
Come si studiano i microrganismi isolati dall’ambiente Isolare in coltura pura i vari microrganismi presenti nella comunità microbica ed identificarli.
Studiare l’influenza, sulla crescita del microrganismo, di diversi fattori ambientali (calore, pH, pressione idrostatica, radiazioni, pressione d’ossigeno, altri organismi), modificando in laboratorio una variabile per volta. E’ molto importante indagare il rapporto che ogni specie microbica ha con il suo habitat fisico, chimico e biologico (ecologia microbica), per controllare i microrganismi in campo bio-medico (terapia), ambientale (biorisanamento) e industriale (alimenti e fermentazioni).
Schema generale della procedura di arricchimento, isolamento e identificazione delle colture batteriche Ia FASE. Arricchimento e isolamento FONTE Scelta e possibili pretrattamenti
(ARRICCHIMENTO) Di solito selettivo.
IIa FASE. Lavoro con colture pure COLTURE STOCK
CARATTERIZZAZIONE E IDENTIFICAZIONE
ISOLAMENTO PER PIASTRAMENTO Di solito selettivo o selettivo-differenziale
La scelta della fonte
Per individuare e isolare particolari microrganismi dall’ambiente sfruttiamo le nostre conoscenze riguardo le loro caratteristiche nutrizionali, esigenze di temperatura, produzione di particolari metaboliti, etc.
Fonti preferenziali di particolari microrganismi Le conoscenze delle caratteristiche ecologiche, fisiologiche e metaboliche dei microrganismi ci permettono di individuare alcune fonti preferenziali, per alcuni di essi. dal latte andato a male si può isolare facilmente lo Streptococcus lactis, dal formaggio svizzero il Propionibacterium, dalla frutta l’Acetobacter, dalle feci lo Streptococcus fecalis, dal mosto in fermentazione o dal vino il lievito Saccharomyces cerevisiae. Questi ambienti sono equivalenti a terreni di arricchimento.
Perché continuiamo ad isolare gli stessi microrganismi, spesso dalla stessa fonte?
Indagare e sfruttare la biodiversità microbica, anche quella intraspecifica.
La scelta del terreno di coltura
Più informazioni si hanno sulle proprietà di un microrganismo, maggiore è la probabilità di arrivare a definire un terreno di coltura adatto al suo isolamento e mantenimento in laboratorio.
Selezione per arricchimento L’isolamento di specifici tipi microbici è facilitato dall’utilizzo di colture di arricchimento (o colture selettive). Le colture di arricchimento utilizzano combinazioni di nutrienti e condizioni fisiche che soddisfano particolari esigenze nutrizionali o fisiche (temperatura, pH, disponibilità di ossigeno, pressione osmotica) del tipo microbico d’interesse.
L’origine storica delle colture di arricchimento: Beijerinck Isolamento del batterio azoto-fissatore aerobico Azotobacter.
Terreno selettivo privo di fonti di azoto
Terreno non selettivo
L’origine storica delle colture di arricchimento: Winogradsky Alla fine del XIX secolo, Winogradsky notò che, applicando condizioni di crescita equivalenti a campioni diversi di suolo o acqua, si evidenziava una tendenza a produrre la crescita, fra tutti i microrganismi presenti, di alcuni specifici tipi batterici, fisiologicamente simili. La tecnica utilizzata da Winogradsky
Cambiando la fonte di carbonio, cambiano i tipi microbici.
La colonna di Winogradsky Una colonna di vetro riempita con fango ricco di sostanza organica e solfuri, a cui vengono aggiunti substrati carboniosi diversi. La scelta dei substrati determina quali microrganismi prevarranno. Il cilindro viene riempito con acqua (lago, stagno, fossato, mare), coperto e lasciato indisturbato alla luce per diverse settimane per permettere la crescita dei microrganismi presenti nel materiale utilizzato. Foglio di alluminio
Acqua
Alghe e cianobatteri Batteri purpurei non sulfurei
Fango con nutrienti organici e CaSO4
Crescite di batteri purpurei e sulfurei verdi Decomposizione anossica e riduzione del solfato
Isolamento di attinomiceti Negli anni ’50 vennero isolati migliaia di attinomiceti produttori di agenti antibatterici, antivirali e antitumorali. Campioni di suolo, concime organico, acque dolci o atmosfera venivano inoculati in terreni solidi a basso contenuto di zuccheri per limitare la crescita di generi mobili a crescita rapida e facilitare la formazione di colonie di organismi a crescita lenta come gli attinomiceti.
I limiti delle colture di arricchimento L’organismo più adatto al particolare insieme di condizioni di coltura che sono state scelte prende il sopravvento sugli altri membri della comunità e diventa l’organismo dominante. Questo microrganismo potrebbe essere solo un membro minoritario e di rilevanza ecologica ridotta dell’ecosistema microbico in esame. Spesso, per eliminare componenti microbiche minoritarie ma a crescita rapida, il campione ambientale viene diluito prima dell’inoculo in terreno arricchito.
Procedura generale di arricchimento in batteri aerobi o anaerobi Bisogna individuare una nicchia ambientale le cui condizioni sono favorevoli al microrganismo ricercato, per esempio: -
suolo per gli aerobi
-
fango per gli anaerobi
Arricchimento aerobico Isolamento di microrganismi capaci di crescere aerobicamente su benzoato come unica fonte di C e di energia. Senza arricchimento
Con arricchimento
Campione (acqua o suolo) 1 ml o 1g
inoculo in terreno + benzoato
1 ml o 1g
Diluizione in acqua isolamento
piastramento 0,1 ml
+ benzoato
0,1 ml
+ benzoato Risospensione colonie isolate
Piastra con materiale non arricchito
Piastra da procedura di arricchimento isolamento
Arricchimento anaerobico Isolamento, dal fango di uno stagno poco profondo, di microrganismi fotosintetici anaerobi resistenti a brevi esposizioni a bassi livelli di ossigeno. fango
Sviluppo colore porpora
luce Bottiglia con terreno di coltura con sali inorganici e glicerolo, chiusa con tappo di vetro
1 ml
Inoculo in 9 ml di terreno riducente (anaerobiosi) con agar liquefatto
Serie di diluizioni 1:10 nello stesso terreno e in agar liquefatto
NaHCO3 CO2 Glicerolo accettore di elettroni
Crescita a colonie
Provette sigillate con cera e esposte alla luce
Metodi selettivi di arricchimento per specifici tipi metabolici Per ottenere l’isolamento di microrganismi di un particolare tipo metabolico: chemioeterotrofi chemioautotrofi fototrofi è necessario creare condizioni più restrittive/selettive.
Tecnica di arricchimento per l’isolamento di termofili anaerobi
Se, tra i molti microrganismi presenti nel suolo, cerchiamo termofili anaerobi, possiamo incubare del terriccio a 60°C in condizioni anaerobiche.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di microrganismi azotofissatori anaerobi L’eliminazione di prodotti azotati da un terreno di coltura, rende impossibile lo sviluppo di tutti i microrganismi tranne gli azotofissatori. L’esclusione di ossigeno dall’ambiente di coltura impedisce la crescita di microbi aerobi. Con l’esclusione di ossigeno e composti azotati, si svilupperanno solo i batteri azotofissatori anaerobi.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di microrganismi acido-tolleranti Una selezione per arricchimento in microrganismi acido-tolleranti può essere fatta portando il pH del terreno a 4; si impedisce così la crescita della maggior parte dei batteri e nel contempo si favorisce lo sviluppo di una flora microbica acido tollerante composta per lo più da lieviti e muffe.
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di microrganismi produttori di enzimi idrolitici Piastra contenente 1 % amido
La tecnica di arricchimento per l’isolamento di batteri di interesse caseario
Se un terreno preparato con lattato di sodio come unica fonte di carbonio e di energia, si avrà lo sviluppo preferenziale di microrganismi come Propionibacterium (formaggio Emmenthal).
Altri metodi di selezione batterica
Selezione per inibizione
Selezione differenziale
Le procedure di selezione per arricchimento, per inibizione e differenziale possono anche essere combinate tra loro per facilitare l’isolamento dei tipi microbici d’interesse.
Selezione per inibizione
Se aggiungiamo al terreno di coltura sostanze chimiche selettive, che possano eliminare microrganismi che interferiscono con la crescita del microrganismo di interesse, si parla di selezione da inibizione.
Isolamento di batteri acido-lattici mediante selezione per inibizione
L’azide è un inibitore della crescita batterica in quanto agendo sulla citocromo c ossidasi inibisce la respirazione. Introducendo azide in un terreno di coltura nutritivo che contiene un carboidrato fermentabile come fonte di energia si arricchisce in batteri acido lattici che non possiedono citocromi e sono quindi insensibili all’azide.
Selezione per inibizione Il feniletanolo è un batteriostatico specifico per i batteri Gramnegativi. Il terreno di coltura Feniletanolo Agar può essere usato per isolare selettivamente batteri Gram-positivi.
Proteus mirabilis
E. coli
Staphilococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Enterococcus faecalis
Feniletanolo Agar
Selezione differenziale Un microbo può essere isolato semplicemente rendendolo più facilmente riconoscibile, una procedura che viene detta differenziale. La selezione differenziale spesso molecole indicatore.
utilizza
La presenza nel terreno solido di particolari indicatori facilita l’identificazione e isolamento del microrganismo di interesse.
Microrganismi utilizzatori di urea Per isolare un microrganismo in grado di idrolizzare l’urea possiamo utilizzare piastre di terreno solido contenenti urea e un indicatore di pH. Tra le colonie che si svilupperanno, quelle che formano ammoniaca dall’idrolisi dell’urea saranno individuate da un cambiamento di colore dell’indicatore.
Microrganismi che fermentano il cellobiosio
Batteri cellobioso-fermentanti cresciuti su piastre con cellobiosio come unica fonte di carbonio in un terreno agarificato contenente un indicatore di pH, verranno identificati grazie alla variazione di colore determinata dalla produzione acida durante la loro crescita.
Selezione per inibizione e differenziale: EMB Il terreno Eosina Metilene Blue (EMB) agar è un terreno sia selettivo che differenziale. Infatti, i coloranti eosina e blue di metilene inibiscono la crescita dei batteri gram-positivi con selezione dei gram-negativi; allo stesso tempo, la presenza di lattosio permette la differenziazione dei gram-negativi in base alla loro capacità di fermentare questo zucchero.
1:
1
2:
2
Pseudomonas aeruginosa, gram-negativo, non è inhibito. L’assenza di colorazione indica che P. aeruginosa non è capace di fermentare il lattosio.
3:
3
Enterobacter aerogenes, gram-negativo, non è inhibito. Il colore rosa indica che E. aerogenes è capace di fermentare il producendo acidi deboli.
lattasio 4:
4
Escherichia coli, gram-negativo, non è inhibito. Il colore metallico verde brillante indica la capacità di E. coli di fermentare il lattosio producendo acidi forti.
Staphylococcus aureus, gram-positivo, è inibito da eosina e blue di metilene.
Selezione per inibizione e differenziale: MSA Cosa è il terreno MSA. Il mannitolo salt agar (MSA), è un terreno selettivo e differenziale. MSA è selettivo perché contiene una concentrazione di sale (7.5%) che promuove la crescita di alcuni organismi mentre scoraggia quella di altri. MSA è differenziale perché contiene lo zucchero mannitolo e l’indicatore di pH rosso fenolo. Come funziona il terreno MSA. I microrganismi che fermentano il mannitolo producono cataboliti acidi, che causano un viraggio di colore. Infatti, il rosso fenolo è rosso ciliegia sopra pH 8.5, giallo-rosso tra pH 6.9 e 8.5, e giallo brillante a pH 6.9 o più basso. Come viene utilizzato il terreno MSA. MSA viene utilizzato per distinguere il batterio patogeno Staphylococcus aureus da quello non-patogeno S. epidermidis. Infatti, sebbene entrambi possono tollerare l’alta concentrazione salina del terreno MSA, solo S. aureus può fermentare il mannitolo, causando il viraggio dell’indicatore da rosso a giallo.
Keen.mht
