Lez 16 A Sterilizzazione

13/05/2013

STERILIZZAZIONE CON GAS – ossido di etilene, βpropiolattone. CH2

Ossido di etilene

CH2 O

Meccanismo d’azione: agente alchilante dei metaboliti cellulari, sostituisce i gruppi OH , SH, COOH, con gruppi EtOH Sterilizzazione di superficie, l’ossido di etilene ha poco potere penetrante. Eur. Pharm. 7° Ed.- Il metodo di sterilizzazione con gas deve essere usato solo quando non esiste un’alternativa idonea. E’ necessario assicurare la penetrazione del gas e dell’umidità nel materiale da sterilizzare ed un processo di eliminazione del gas che non lasci residui tossici di gas nel prodotto sterilizzato. Gas tossico sottoposto a legge su gas tossici, R.D. 147/27 e succ. modifiche. Massima concentrazione residua di ossido di etilene nel prodotto permessa < = 1 ppm. La sterilizzazione con EtO è una reazione chimica con fattore Q10 ~ 2, poco influenzata da T

STERILIZZAZIONE CON ETO La vel. di reazione dipende da:
Concentrazione ETO (250 e 1000 mg/l).
Umidità relativa
Temperatura
Tempo di esposizione METODI DI STERILIZZAZIONE CON ETO: In pressione con miscele di ETO non infiammabili In depressione con ETO puro e sue miscele infiammabili

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Impianto: autoclave per sterilizzazione con gas Parametri operativi Pretrattamento – 60 minuti, 98% umidità, 45 – 55 °C Eliminazione dell’umidità, vuoto 4,5 mm Hg Trattamento - Introduzione della miscela sterilizzante EtO+ CO2 1:9, umidità 50-60%, tempo 6 -24 ore. Evacuazione della camera – vuoto 3,27 mmHg Quarantena – almeno 24 ore Esempi di condizioni di esposizione a 55°C. Composizione (%)

Conc. O.E. (mg/ml)

Pressione (bar)

Tempi esp . (h)

10 O.E.; 90 CO2

450

1.9

6

20°.E.; 80 CO2

670

1.2

4

11 O.E., 54 CO2, 35 CO2

450

0.3

5

12 O.E.; 88 CHFCl2

650

0.5

4

Autoclave per sterilizzazione con ossido di etilene Fasi operative Riscaldamento intercapedine Vuoto

Pretrattamento

Umidificazione Vuoto Immissione gas

Sterilizzazione

Scarico della miscela sterilizzante Lavaggio con aria sterile a pressione atmosferica Fattori che influenzano il ciclo di sterilizzazione: pulizia delle superfici, occlusione da microrganismi, velocità evacuazione camera.

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Impianto industriale per la sterilizzazione con ETO

Sterilizzazione mediante radiazioni ionizzanti

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Radiazioni ionizzanti: vibrazioni elettromagnetiche ad alta frequenza emesse da isotopi radioattivi. Raggi α, β , γ Meccanismo d’azione: blocco della riproduzione dei microrganismi per formazioni di mutazioni letali che causano la rottura del DNA cellulare. Azione indiretta Azione diretta

Radiazioni ad alta energia (ionizzanti)

Raggi β

Raggi γ

Radiazioni particellari

Radiazioni elettromagnetiche

Basso potere di penetrazione

Elevato potere di penetrazione

Provocano un sensibile riscaldamento del prodotto

Non provocano il riscaldamento del materiale irraggiato

Tempo: 1 min

Tempo: 6-24 h

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Radiazioni ionizzanti Meccanismo di sterilizzazione - Azione diretta: le radiazioni inducono una ionizzazione del DNA nei nuclei dei microrganismi - Azione indiretta: Formazione di radicali liberi che inducono reazioni secondarie nel DNA

L’abbattimento della carica microbica è correlata alla dose assorbita dal prodotto

STERILIZZAZIONE TERMINALE CON RADIAZIONI IONIZZANTI

Dose 25 kGy BETA RAYS

GAMMA RAYS

Acceleratore 60Co

- Bassa penetrazione

- Elevato rateo di dose

source

-Elevata penetrazione -Basso rateo di dose

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Radiazioni Gamma neutroni COBALTO 59

FOTONE GAMMA 1.17 MEv

COBALTO 60

decadimento

NICKEL

FOTONE GAMMA 1.33 MEv PARTICELLA 0.3 MEv

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Eur. Pharm. 7th Ed. - La sterilizzazione con questo metodo si ottiene esponendo il prodotto a raggi gamma ottenuti da un idoneo radioisotopo (es. Cobalto 60) o ad un fascio di elettroni (acceleratore di elettroni). E’ un tipo di sterilizzazione terminale, la dose di riferimento è pari a 25 kGy, possono essere usate altre dosi previa dimostrazione che la dose scelta porti ad un livello di letalità adeguato e riproducibile nelle situazioni d’uso.

Vantaggi:

Svantaggi

• Temperatura e pressione ambiente

• Formazione di radicali liberi

• Utilizzabile in contenitori a barriera assoluta

• Formazione di ozono

• Basso contenuto di residui

• Formazione di prodotti di degradazione

• Poche variabili di processo

Dose di Riferimento (dose assorbita) per sterilizzazione = 25 KGy per un SAL di almeno 10-6 La dose di riferimento di 25 kGy è calcolata seguendo il criterio dell’overkill per un PNSU pari a 10-6 (N0 = 106) su una popolazione microbica con D10 pari a 2,09.

dose(kGy) = D10 × (log N 0 − log N )

dose( kGy) = 2,09 × (6 + 6 ) = 25kGy dose( kGy) = 1,7 × (6 + 9) = 25,5kGy Microrganismo di riferimento come indicatore biologico di sterilizzazione: bacillus pumilus D10 = 1,7 kGy in conc. pari a 107 - 108

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DOSIMETRIA a) Unità di dose assorbita (D) è il gray (Gy) 1 Gy = deposizione nel materiale irraggiato di una quantità di energia pari a 1 J/Kg 1 Gy = 100 rad b) Rateo di dose: Gy .sec-1 (kGy/h)

Dosimetri chimici Diretti

•

Indiretti

Calorimetro

1.

(in fase liquida e solida) routinari 2. di riferimento

•

Dosimetri diretti Per via calorimetrica misurando l’aumento di temperatura prodotto in materiali che non subiscono trasformazioni chimiche e nei quali pertanto si ha la completa conversione dell’energia radiante in energia termica (polistirene)

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Dosimetri chimici in fase liquida e solida (indiretti, routinari) Si misura la quantità di un prodotto della radiolisi dal quale si conosce la resa radiolitica (G) espressa come numero di molecole formate per 100 eV di energia assorbita -Dosimetro di Fricke soluzione acquosa 10-3 M di FeSO4 in 0,4 M H2SO4; G (Fe3+) = 15,5 per radiazioni γ da Co60 Dose assorbita (Gy) = 2,94 x 100 x (1-0,007 x ∆T) x ∆A Dove: ∆A = differenza di assorbanza, misurata a 304 nm in una cella da 1 cm, della soluzione irradiata rispetto al controllo ∆T = differenza di temperatura tra quella di lettura e quella di riferimento (20°C) 0,007 = fattore di conversione del coefficiente di estinzione molare dello ione Fe3+ per la temperatura Radiazioni γ di energia intorno al MeV e per una dose assorbita in acqua o in materiali equivalenti; per altri materiali si deve apportare la correzione per le diverse densità elettroniche

Dosimetri chimici in fase liquida e solida (indiretti, routinari)

- Lastre o pellicole di polimetacrilato (PMMA) addizionate di un colorante rosso che si scurisce proporzionalmente alla dose assorbita – aumento di assorbanza dovuto alla variazione di colore (360 -640 nm)

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• • • •

Temperatura Umidità Fading Rateo di dose Dosimeter

Dosimetri routinari Readout method

Dose range (kGy)

Dyed Perspex Strips (3 mm)

Spectrometer 640 nm

5 - 50

Amber 3042 Dyed Perspex Strips (3 mm)

Spectrometer 603/651 nm

1 -30

Radix

Spectrometer 315 nm

5 -50

Spectrometer 530 nm

0.1 - 3

Red 4034

Material

Perspex

Form

Strips (1.5 mm)

Gammachrome YR

Dyed Perspex Strips (1.5 mm)

Dosimetri chimici in fase liquida e solida (indiretti, di riferimento) - Dosimetro di alanina, nel quale si valuta l’intensità del segnale ESR (spettroscopia di risonanza di spin elettronico) generato da radicali prodotti nella radiolisi dell’alanina che è proporzionale alla dose assorbita Dosimeter

Form

Readout method

Dose range (kGy)

Ceric/Cerous

Liquid in glass ampoule

Spectrometer 320 nm

1 - 100

Dichromate

Liquid in glass ampoule

Spectrometer 350/440 nm

1 -100

Alanine

Solid pellet

Electron Spin Resonace

0,01 -100

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Validazione del processo di irraggiamento 1. Scelta della Dose sterilizzazione ( ≤ dose sterilizzante) in base alle caratteristiche del prodotto e performance dell’irradiatore 2. Qualifica del processo: a. determinazione del carico: Il committente deve standardizzare le dimensioni e il peso dei colli. Si studia la disposizione dei colli nel convogliatore che consente un miglior sfruttamento dello spazio. b. mappatura dosimetrica: si effettua per ogni tipo di collo e caricamento (almeno 3 mappature) sul volume occupato dal prodotto nel convogliatore

Determinazione sperimentale della zona “fredda” (dose minore) e della zona “calda” (dose maggiore), nonché del rapporto di uniformità (R.U.=Dmax/Dmin) 3. Compilazione della parte documentale: - Validazione della sterilizzazione (descrive le fasi sperimentali e risultati ottenuti) - Capitolato dell’Irraggiamento (descrive le specifiche di fornitura, clausole di invariabilità, penali)

Validazione del processo di irraggiamento Scelta della dose sterilizzante (validazione microbiologica) Metodo 1 Questo metodo si basa sulla verifica sperimentale che la risposta alla radiazione della popolazione microbica presente su un prodotto è maggiore rispetto a quella della popolazione standard.

Procedura a. b. c. d. e.

Misura quantitativa dell’inquinamento (Bioburden) Definizione della dose di verifica (SAL = 10-2) Irraggiamento alla dose di verifica di campioni Test di sterilità sui campioni trattati Analisi dei risultati

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a. Misura quantitativa dell’inquinamento Il laboratorio di microbiologia misura l’inquinamento presente su 30 campioni scelti a random da almeno 3 lotti consecutivi di produzione (10 pezzi per lotto) b. Irraggiamento alla dose di verifica di campioni Il laboratorio di microbiologia o l’irradiatore definisce la dose di verifica (SAL 10-2) dai valori tabulati nella ISO 11137 (tabella in cui sono riportati le dosi di irraggiamento necessarie per raggiungere un certo SAL in funzione del grado di inquinamento) c. Test di sterilità sui campioni trattati L’irradiatore irraggia alla dose di verifica 100 campioni provenienti da uno dei tre lotti precedenti (punto a) o un lotto immediatamente successivo. La dose effettiva può variare dalla dose di verifica di +10% e la dose somministrata non deve essere inferiore al 90% di quella calcolata.

Mappatura dosimetrica sui campioni trattati

d. Test di sterilità sui campioni trattati 100 campioni

e. Analisi dei risultati Se i pezzi non sterili sono 0, 1 o 2 significa che la risposta alla radiazione della popolazione microbica sul prodotto è maggiore rispetto a quella della popolazione starndard. E’ quindi possibile estrapolare dalla tabella ISO 11137 il valore di dose sterilizzante. Se l’esperimento fallisce, ovvero il numero di test positivi è maggiore di 2, si ripete la procedura o si cambia metodo.

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dose(kGy) = D10 × (log N 0 − log N )

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FILTRAZIONE STERILIZZANTE Eur. Pharm. 7th Ed.- è una filtrazione che, tramite un opportuno test microbiologico, si dimostra soddisfacente a produrre una soluzione sterile. I filtri sterilizzanti devono avere porosità di riferimento pari a 0,22 µ. Definizione FDA – Un filtro sterilizzante è quel filtro che dovendo filtrare una sospensione contenente il microrganismo Pseudomonas Diminuta, alla conc. minima di 107 ufc per cm2 di superficie filtrante, produrrà un effluente sterile Lo Pseudomona Diminuta ATCC 19146 ha un diametro medio di 0,3 µ Filtrazione di superficie, membrane filtranti con porosità omogenea e standardizzata. Materiale di costruzione : esteri di cellulosa, nylon, teflon, polivinil cloruro, poliammide, polisulfone. Parametri del filtro: pressione al punto di bolla, ∆P di progetto Il sistema filtrante deve essere strutturato in modo da evitare contaminazioni

Tests di integrità di un filtro Test del punto di bolla

Pressione al punto di bolla: minima pressione richiesta per superare la tensione superficiale del liquido e forzarlo attraverso i capillari del filtro.

4γ cos θ P=K D P = pressione al punto di bolla D = diametro del poro θ = angolo di contatto liquido/membrana. γ = tensione superficiale del liquido

Diffusion test

Valutazione della quantità di aria spostata ad una pressione pari all’ 80% della pressione al punto di bolla.

Si fa riferimento alla quantità di aria spostata in condizioni di filtro integro. Aumento della quantità di aria spostata indicano filtro rotto Diminuzione della quantità di aria spostata indicano filtro intasato

I valori della pressione al punto di bolla sono dati dal produttore del filtro (certificato di analisi) Aumento del valore di P indicano che il filtro è intasato. Diminuzione del valore di p indicano che il filtro è rotto

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ESEMPI DI APPLICAZIONE NEL SETTORE FARMACEUTICO DEI DIFFERENTI PROCESSI DI STERILIZZAZIONE Metodo di sterilizzazione

Prodotto/materiale

Vapore saturo sotto pressione

Soluzioni parenterali in fiala Materiale da medicazione Strumenti per lavorazioni asettiche Materiale plastico termoresistente Terreni di coltura Materiale in gomma Indumenti per le lavorazioni asettiche In generale qualsiasi materiale che sopporta questo tipo di sterilizzazione.

Calore secco

Vetreria (contenitori, fiale) Oli Strumenti chirurgici Strumenti per lavorazioni asettiche Polveri

ESEMPI DI APPLICAZIONE NEL SETTORE FARMACEUTICO DEI DIFFERENTI PROCESSI DI STERILIZZAZIONE Metodo di sterilizzazione

Prodotto/materiale

Ossido di etilene

Strumenti chirurgici Materiale plastico Materiale da medicazione

Raggi γ

Polveri Guanti chirurgici Materiale plastico Contenitori Materiale da medicazione

Filtrazione

Liquidi termolabili (Iniettabili, soluzioni oftalmiche, terreni di coltura, soluzioni di vitamine, soluzioni di antibiotici, vaccini ecc.)

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INDICATORI BIOLOGICI DI STERILIZZAZIONE

METODO DI STERILIZZAZIONE

INDICATORE BIOLOGICO

Vapore saturo sotto pressione

Bacillus stearothermophilus ATCC7953, D121 = 1,5 min conc. 5 x 10 5

Calore secco

Bacillus subtilis var. niger ATCC9372, D160 = 5-10 min conc. 1 x 105

Gas (es. ossido di etilene)

Un qualsiasi indicatore usato nella sterilizzazione con calore Bacillus pumilus ATCC14844 D=1,7 kGy, conc. 107 – 108

Raggi γ

Filtrazione sterilizzante

Pseudomonas Diminuta, conc. minima di 107 ufc per cm2 di superficie filtrante

STERILIZATION, STERILITY ASSURANCE: regulatory remarks

GUIDELINE OF THE EUROPEAN COMMUNITY CPMP/QWP/054/98

Decision tree for sterilization choices for aqueous products

Decision tree for sterilization choices for non-aqueous liquid, semi-solid or dry powder products

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Guideline of the European Community CPMP/QWP/054/98 DECISION TREE FOR STERILIZATION CHOICES FOR AQUEOUS PRODUCTS Can the product be sterilized by moist heat at 121°C for 1 5 minutes?

NO

YES

Can the product be sterilized by moist heat with Fo ≥ 8 mins achieving SAL ≤10-6 ?

Use autoclaving at 121°C for 15 min

YES

NO

Use moist heat with Fo ≥ 8 mins Can the formulation be filtered through a microbial retentive filter ? NO

YES

Use presterilizaed individual components and aseptic compounding and filling

Use a combination of aseptic filtration and aseptic process

Guideline of the European Community CPMP/QWP/054/98 DECISION TREE FOR STERILIZATION CHOICES FOR NON- AQUEOUS LIQUID, SEMI-SOLID OR DRY POWDER PRODUCTS Can the product be sterilized by dry heat at 160° C for 120 minutes? NO

YES

Can the product be sterilized by dry heat with alternative combinations of time and temperature to the standard cycle achieving SAL ≤ 10-6?

Use sterilization at 160 °C for 120 minutes

NO YES

Can the formulation be sterilized with an alternative method different from dry heat e.g. ionizing radiation with an absorbed minimum dose ≥ 25 kGy?

Use dry heat with alternative combinations of time and temperature to the standard cycle achieving SAL ≤ 10-6 YES

NO

Use sterilization with ionizing radiation with an absorbed minimum dose ≥ 25 kGy

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Guideline of the European Community CPMP/QWP/054/98 DECISION TREE FOR STERILIZATION CHOICES FOR NON- AQUEOUS LIQUID, SEMI-SOLID OR DRY POWDER PRODUCTS follows…. Can the formulation be sterilized with an alternative method different from dry heat e.g. ionizing radiation with an absorbed minimum dose ≥ 25 kGy? NO

Can the product be sterilised with a validated lower irradiation dose?(ref. ISO11137) NO

YES

Use sterilisation by validated irradiation dose

Can the formulation be filtered through a microbial retentive filter? NO

YES

Use filtration and aseptic processing

Use presterilised individual components and aseptic compounding and filling

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