Lecture 8 2006

А.С. Спирин 2006 г.

Лекция 8: Инициация трансляции у эукариот

ОСОБЕННОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ ТРАНСЛЯЦИИ И ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ мРНК

СОПРЯЖЕННАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ-ТРАНСЛЯЦИЯ ПРОКАРИОТ

Общая схема биосинтеза белков Д Н К

ТРАНСКРИПЦИЯ Р Н К

ПРОЦЕССИНГ И ТРАНСПОРТ РНК 5'

3'

м Р НК

РИБОСОМА

ТРАНСЛЯЦИЯ РИБОСОМА

3'

РИБОСОМА

5'

РАСТУЩИЙ ПЕПТИД

т РН К т РН К

т РН К

СВОРАЧИВАНИЕ ПРОЦЕССИНГ И ТРАНСПОРТ ПОЛИПЕПТИДА БЕЛОК

Инициация трансляции мРНК в цитоплазме: • «Девственная» инициация трансляции нетранслмруемых мРНК (мРНП). • Инициация трансляции транслируемых мРНК новыми рибосомами.

Инициация трансляции мРНК в цитоплазме: • «Девственная» инициация трансляции нетранслмруемых мРНК (мРНП). • Инициация трансляции транслируемых мРНК новыми рибосомами. • Ре-инициация в циркуляризованных полирибосомах.

ЦИРКУЛЯРИЗАЦИЯ ПОЛИРИБОСОМЫ

40S

5'-UTR CAP

POLY(A) 40S 60S CODING REGION 3'-UTR

60S

ЦИРКУЛЯРИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ПОЛИРИБОСОМ (полирибосомы клеток гипофиза крысы на эндоплазматическом ретикулуме).

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ Э ук ари оты :

скан и р о ван и е

I:

трансляци я

5'

3' СТА РТ

СТО П

П р ок ари оты :

трансляци я

II:

5'

3'

СТА РТ

СТО П

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ УЧАСТКИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ мРНК

• «Кэп» и 5'-НТО: Концевая инициация. Разделенность RBS и AUG. Сканирование. • Моноцистронность. • Длинные 3'-НТО: Регуляторные третичные структуры. Усилители инициации («энхансеры»).

В клетках эукариот вся мРНК существует в форме комплексов со специальнцыми белками – информационных рибонуклеопротедов (мРНП) либо в качестве свободных нетранслируемых мРНП-частиц (информосом), либо как транслируемые мРНП в составе полирибосом.

Мажорный белок цитоплазматических мРНП – «р50» = YB (“Y-box protein”): •Неспецифическая РНК-связывающая активность •Мол. масса 36 000 D •Трех-доменная структура: А,Р-богатый участок (N-конец), РНК-связывющий участок (центр), «+,–» участок (С-конец) •Формирование крупных гомоолигомеров

итоплазматические информационные рибонуклеопротеиды в животных клетках . Свободные нетранслируемые мРНП-частицы как форма существования маскированных мРНК. Стабильны в клетке, не подвержены деградации и полиаденилированию/деаденилированию, не способны взаимодействовать с факторами инициации трансляции и рибосомами.

I. Свободные мРНП-частицы как фонд транслируемых мРНК. Подвержены как деаденилированию и деградации, так и полиаденилированию и взаимодействию с рибосомами. Могут либо находиться в равновесии с полисомами, либо быть временно выключены из трансляции репрессорами.

II. Транслируемые мРНП, входящие в состав полисом и освобождаемые при диссоциации рибосом. Белки, связанные с мРНК в полисомах, позволяют рибосомам беспрепятственно транслировать кодирующие последовательности, а возможно и способствовать трансляции.

сновные физико-химические свойства свободных цитоплазматических мРНП (информосом) 1) Гетерогенность размеров, линейная корреляция коэффициентов седиментации частиц с коэффициентами седиментации их изолированной РНК. 2) Плотностная гомогенность (т. е. все частицы, не зависимо от размера, имеют одинаковое соотношение белок : РНК). 3) Высокое соотношение белка к РНК (около 4 : 1) и соответственно низкая плавучая плотность (1,4 г/см3 в CsCl). (Рибосомы имеют соотношение 1 : 1 и плавучую плотность 1,55 г/см3).

4) Устойчивость к удалению ионов магния. (Рибосомы при удалении магния диссоциируют сначала на субчастицы, а затем на РНК и белок).

5) Чувствительность к рибонуклеазам. (Рибосомы относительно устойчивы к рибонуклеазной обработке).

ОСОБЕННОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ мРНК: • Пространственное разделение транскрипции и трансляции • Функциональная стабильность мРНК («долгоживучесть») • Сканирование пред-инициаторного участка мРНК • Специфические пространственные структуры в 5’ и 3’ НТО • Функционально активные 5’ и 3’ нетранслируемые участки мРНК и их функциональные взаимодействия («переговоры») в ходе трансляции • Множественность белковых факторов инициации • Нуклеопротеидная форма существования (мРНП)

I

II

III

“Native” 40S subunit = 40S:eIF3:eIF1A:eIF1:eIF2αβγ

I

II

III

ЦИКЛ ИНИЦИАТОРНЫХ ФАКТОРОВ eIF2:GDP/GTP И eIF2B eIF 2 : G T P : eIF 2 B

M e t-tR N A

i

G TP e IF 2 : e IF 2 B

M e t-tR N A i : e IF 2 : G T P : e IF 2 B 4 0 S S U B U N IT

G D P e IF 2 B e IF 2 : G D P

8 0 S : M e t-tR N A

4 0 S : M e t-tR N A i : e IF 2 : G T P

i

IN IT IA T IO N C O M P L E X

6 0 S S U B U N IT

I

II

III

40S – eIF3 – eIF4F (G) – PABP – 3’poly(A) (E) – cap

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ ИНИЦИАТОРНОГО 48S РИБОСОМНОГО КОМПЛЕКСА

3′

CA P

E (2 )

G

A :A T P

e IF 4 F

A U G

A :A T P

A U G

A U G

G E

(1 )

A D P, P

(2 )

E

i

A

G

(3 )

B

A :A T P

A U G

e IF 4 B

e IF 4 A :A T P

A U G

(4 ) e IF 4 F

B

A

e IF 4 A :A T P

A U G

A :A T P (4 )

(5 ) A D P, P e IF 4 A

B

B i

A

43S C O M PLEX A :A T P (6 )

B

48S C O M PLEX

A U G

(6 )

B

РАСПЛЕТАНИЕ НЕКОДИРУЮЩЕЙ ЛИДЕРНОЙ ОБЛАСТИ мРНК ФАКТОРОМ eIF4A (ATP-DEPENDENT HELICASE, OR RNA-DEPENDENT ATPase)

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ Э ук ари оты :

скан и р о ван и е

I:

трансляци я

5'

3' СТА РТ

СТО П

П р ок ари оты :

трансляци я 5'

3'

СТА РТ

II:

СТО П

(а также внутренняя инициация у эукариот)

ВНУТРЕННЯЯ ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ ПИКОРНОВИРУСНОЙ РНК IRES

A

300

400

500 200 586 AUG 100

600

743 AUG

Pyrimidine-rich region

IRES B

5'

AUG

UUUC.. .UU

AUG

600

scanning

500 300

enteroviruses rhinoviruses

cardioviruses

700

100

800

834

unstructured spacer, starting window

AUG 400 Pyrimidine-rich region

IRES

oligopyrimidine tract

aphthoviruses

3'

ВНУТРЕННЯЯ ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ ПИКОРНОВИРУСНОЙ РНК IRES

5'

CAP

UUUC.. .UU

AUG

AUG scanning

enteroviruses rhinoviruses

cardioviruses unstructured spacer, starting window oligopyrimidine tract

aphthoviruses

3'

СХЕМА ВНУТРЕННЕЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ РНК ВИРУСА ПАРАЛИЧА СВЕРЧКА

(1)

Домен IRES’a занимает Р-участок рибосомы, вместо инициаторной тРНК, садясь на пролиновый CCU-кодон.

(3)

Ala-tRNA занимает А-участок, садясь на свой GCU-кодон.

(5)

Происходит «псевдо-транслокация» AlatRNA из А в Р участок.

(7)

На вакантный А-участок садится Thr-tRNA, в соответствии с АСА-кодоном, и начинается трансляция.

J.E. Wilson, T.V. Pestova, C.U.T. Hellen and P. Sarnow (2000) Initiation of protein synthesis from the A site of the ribosome. Cell 102, 511-520.

3’-КОНЦЕВЫЕ УСИЛИТЕЛИ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ:

(3) Poly(A) tail (+ PABP). (4) Histone mRNA SL (+ SLBP). (5) Pseudoknot domains and other special structures (TED, TE, etc.). (6) tRNA-like domain (of plant viral RNAs).

КРУГОВАЯ ТРАНСЛЯЦИЯ В СФОРМИРОВАННЫХ ПОЛИСОМАХ

40S

5'-UTR CAP

eIF3, eIF4 PABP POLY(A) 40S 60S CODING REGION 3'-UTR

60S

тРНК-ПОДОБНАЯ СТРУКТУРА НА 3’-КОНЦЕ РНК ВТМ

A

B

10

UA

30

G

A A U CCCC

CCG GGGGCCCA

GGGG GGC CCCC U U A G UUA G 40 G A U C U 20 A G C A A G U C A U 100 C A U A G G U G C U G 50 G G C 90 C G U A G C C G G C 60 U 5' C A A A U U A 80 G C U A A U U A A U A U G C G U U C

70

OH

СХЕМА РНК ВИРУСА ЖЕЛТОЙ МОЗАИКИ ТЕРНЕПСА (TYMV)

Полноразмерная РНК (6319 нт) содержит следующие гены: (1) ген транспортного белка (МР), начинающегося на 89-м нуклеотиде; (2) ген поли-белка (РР), начинающегося на 96-м нуклеотиде в +1 рамке; (3) ген белка оболочки (СР), начинающегося на 5645-м нуклеотиде.

S. Barends, H.H.J. Bink, S.H.E. van den Worm, C.W.A. Pleij and B. Kraal (2003) Entrapping ribosomes for viral translation: tRNA mimicry as a molecular Trojan Horse. Cell 112, 123-129.

СХЕМА МЕХАНИЗМА ВНУТРЕННЕЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ ГЕНА ПОЛИ-БЕЛКА ВИРУСА ЖЕЛТОЙ МОЗАИКИ ТУРНЕПСА С УЧАСТИЕМ тРНК-ПОДОБНОГО 3’-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА

Трансляция гена РР начинается с валина!

Val

S. Barends, H.H.J. Bink, S.H.E. van den Worm, C.W.A. Pleij and B. Kraal (2003) Entrapping ribosomes for viral translation: tRNA mimicry as a molecular Trojan Horse. Cell 112, 123-129.

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

•

Установка донорного субстрата в P-участок рибосомы. Постановка первой аминокислоты синтезируемой полипептидной цепи, образование первой пептидной связи.

•

Установка рамки считывания матричной РНК. Опознавание инициирующего кодона, детерминация стартового нуклеотида трансляции.

•

Точка приложения механизмов регуляции белкового синтеза на уровне трансляции.

реимущества регуляции на уровне трансляции: 1) Быстрота ответа. 2) Обратимость (и, следовательно, консервация ресурсов мРНК). 3) Точная подгонка количества синтезируемого белка к потребности клетки в нем. 4) Координированный синтез семейств белков. 5) Пространственный контроль синтеза белков в клетке. 6) Регуляция синтеза белков при клеточной дифференцировке. 7) Регуляция синтеза белков в отсутствие активности клеточного ядра (например, в раннем эмбриогенезе).