Lecture 1 2006

Основными особенностями пространственной организации эукариотического генома являются упаковка геномной ДНК в хроматин и помещениие хроматина в особую органеллу – клеточное ядро

Суммарная длина ДНК размещенной в ядре клеток большинства позвоночных организмов составляет 1-2 м. Диаметр ядра составляет ~10 мкм

Сушественное сокращение линейных размеров ДНК должно быть осуществлено таким образом, чтобы сохранялась возможность быстрого вовлечения в транскрипцию определенных частей генома

В интерфазном ядре ДНК упакована не единообразно. Существуют более компактные районы (гетерохроматин) и менее компактные районы (эухроматин).

Упаковка ДНК в ядре осуществляется в несколько этапов

Компактизация ДНК в ядре осуществляется при посредстве сложного комплекса белков, среди которых принято выделять гистоны и негистоновые белки Гистоны являются чрезвычайно консервативными белками. Выделяют 5 основных типов гистонов Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 Гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4 входят в состав минимальной нуклеосомы (так называемой “Core Particle”). По-этому их нередко называют «коровыми» гистонами

Вторичная структура всех нуклеосомных гистонов характеризуется присутствием протяженного альфа-спирального домена (histone fold), который фланкируют (с обоих концов) домены, содержащие короткие альфа-спирали и петли. 15-30 aминокислотных остатков, расположенные на N-концах нуклеосомных гистонов, не организованы в какие-либо выраженные вторичные структуры. Эти части молекул нередко называют «хвостами» («tails»).

Нуклеосома является базовой структурной единицей первого уровня упаковки ДНК в хроматине. Она представляет собой белковую глобулу, или, точнее говоря некое подобие диска, на который намотан фрагмент ДНК протяженностью 146 п.н. Глобула состоит из восьми молекул гистонов: тетрамера (Н3)2-(Н4)2 и двух димеров Н2А-Н2В. Диаметр глобулы-диска составляет ~11 нм, а высота - ~ 5,7 нм

Нуклеосомы были обнаружены при электронной микроскопии развернутых хроматиновых фибрилл (хроматина, полученного после мягкой обработки ядер стафилококковой нуклеазой и экстракции 0,2 mM EDTA). На электронно-микроскопических снимках были выявлены единообразные глобулы регулярно расположенные на молекуле ДНК. Эти структуры получили называние “бусинок на нити”. Другое важное свидетельство того, что ДНК в составе хроматина организована в регулярные структуры было получено при анализе результатов частичного расщепления ядерной ДНК стафилококковой нуклеазой. Типичным продуктом такого расщепления является набор фрагментов с размерами кратными 200 п.н

Описано множество различных модификаций гистонов Наиболее хорошо изученной модификацией является ацетилирование лизиновых остатков

Каждый из N-концевых доменов гистонов H2B, H3 и H4 имеет 4 лизиновых остатка, которые могут ацетилироваться с образованием 16 возможных изоформ (одна неацетилированная, 4 моноацетилированные по разным позициям, 6 диацетилированных по разным позициям, 4 триацетилированные по разным позициям и 1 тетраацетилированная). В общей сложности для трех гистонов число возможных модификаций будет равно 48. Если учесть комбинаторику различных изоформ в составе одной нуклеосомной частицы, то число возможных вариантов составит более 4000. Если же учесть, что в нуклеосомной глобуле имеется по две копии каждого из входящих в ее состав гистонов, то число возможных вариантов превысит 107. Помимо ацетилирования гистоны могут также метилироваться фосфорилироваться и убикитинилироваться. В совокупности эти модификации делают возможное разнообразие нуклеосомных ч астиц поистине неисчерпаемым. Во всяком случае число теоретически возможных вариантов существенно превосходит общее количество нуклеосом в ядре (~107)

Важной модификацией гистонов является поли АДФ рибозилирование

по γ карбоксильной группе глутаминовой кислоты либо по С-концевой карбоксильной группе Цепи поли АДФ рибозы могут быть простыми и разветвленными и включать до 200 и более блоков

репарация, декомпактизация хроматина

В последние годы охарактеризовано много «вариантных» форм гистонов, некоторые из которых выполняют специальные функции

Н1

Н5 в эритроцитах птиц варианты Н11-Н18 в мышиных клетках

Н2А

macro H2A - 64% гомологии с H2A H2A-Bbd – 42% гомологии с H2A H2A.Z H2A.X

Н3

СENP-A (центромерный белок) Cid (центромерный белок) Н.3.3 (активный хроматин)

(в неактивной копии Х хромосомы) (в активном хроматине) (в активном хроматине) (маркирует мишени для репарации)

No Caption Found

Ahmad, Kami and Henikoff, Steven (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16477-16484

Copyright ©2002 by the National Academy of Sciences

CENP-A играет ключевую роль в формировании и функционировании центромер. Аналоги этого варианта гистона Н3 (CenH3s белки) присутствуют в клетках всех эукариот. CENP-A и его аналоги присутствуют в центромерах, не содержащих длинных тандемно повторяющихся сателлитных последовательностей. В центромерном участке хромосомы 8 риса саттелитные последовательности фактически отсутствуют и присутсвуют активные гены. Единственной особенностью центромерного участка явдяется присутсвие нуклеосом в которых Н3 замещен на CenH3s на протяжении 750 т.п.н. В противоположность основной массе гистонов CenH3s белки не замещаются на протамины в сперметазоидах. Это позволяет сохранить информацию о позиции центромеры при мейозе.

H2A.Z cпособен образовывать димер с H2B. Нуклеосома построенная из двух димеров H2A.Z-H2B и тетрамера (H3-H4)2 отличается меньшей стабильностью по сравнению с классической нуклеосомой. Относительная концентрация гистонов H2A.Z и H3.3 существенно выше в активных хроматиновых доменах, характеризующихся присутствием Н3 ацетилированного по позициям K9, K14, K18, K23 метилированного по позициям K4 и К79. Существует мнение, что нуклеосомы, содержащие гистоны с модификациями, типичными для активного хроматина, постепенно замещаются на нуклеосомы, содержащие типичные для активного хроматина вариантные формы гистонов.

Нуклеосомные частицы не вполне идентичны.

Модификации гистонов и включение в нуклеосомы вариантных форм гистонов могут: 1. Изменять параметры и стабильность нуклеосомных частиц 2. Выполнять сигнальную функцию

Негистоновые белки хроматина HMG белки и белки, участвующие формировании компактных (неактивных) хроматиновых структур (такие, как белок HP1 высших эукариот и Sir белки дрожжей). HMG -1/-2 10% от количества гистонов; характеризуются наличием так называемого HMG-1 домена (HMG-1 box). HMG-1 домен, включающий три альфа-спиральных участка , связывается с малой бороздкой ДНК и вызывает частичное разворачивание двойной спирали, приводящее к резкому изгибу молекулы ДНК

HMG -14/-17 1% от количества гистонов; Они содержат домен связывания с нуклеосомами, причем с нуклеосомной частицей могут связываться гомодимеры (HMG –14)2 и (HMG –17)2 но не компексы, содержащие одну моеклу HMG –14 и одну молекулу HMG –17. Связываясь с нуклеосомными частицами, HMG -14/-17 вызывают определенные изменения в их структуре, которые приводят к декомпактизации 30 нм фибриллы

HMG -I/Y 0,1% от количества гистонов; Для HMG - I/Y характерно присутствие так называемого АТ-крючка (AT-hook). Этот положительно зараженный домен из 9 аминокислотных остатков, содержащий консервативную Gly-Arg-Pro (GRP) последовательность фланкированную остатками аргинина. АТ-крючок связывается с малой бороздкой АТ-богатых последовательностей ДНК. В противоположность домену HMG-1, АТ-крючок предотвращает нарушения правильной укладки двойной спирали ДНК

Индуцированный изгиб

Нарушение стэкинг-взаимодействий

Азотистые основания ДНК не контактируют с гистонами. Соответственно, посадка нуклеосом на ДНК не являетсястрого специфичной в отношении последовательности. В большинстве случаев нуклеосомы расположены на ДНК случайным образом. Сушествуют, однако, свободные от нуклеосом участки (участки гиперчувствительности к ДНКазе I) и области с регулятрым расположением нуклеосом на ДНК (phasing). Пермеабилизация клеток Кратковременная обработка ДНКазой I Выделение ДНК Обработка рестриктазой Электрофорез, блотинг и гибридизация с пробой, комплементарной одному из концов анализируемого фрагмента

DNase I

DNase I

DNase I

Гибридизационая проба

После обработки микрококковой нуклеазой, электрофореза, блоттинга и гибридизации

Гибридизационая проба

Некоторые последовательности ДНК являются предпочтительными для посадки нуклеосом в силу способности легко накручиваться на гистоновый октамер. Другие последовательности, напротив, вообще Не могут накручиваться на гистоновый октамер

Распределение нуклеосом на молекуле ДНК подчиняется определенным закономерностям и может быть как близким к случайному, так и абсолютно фиксированным (фазированные нуклеосомы). Предпочтительные позиции нуклеосом на свободной ДНК можно предсказать с помощью существующих компьютерных программ, позволяющих анализировать способность изучаемых последовательностей ДНК накручиваться на октамер гистонов. В хроматине позиции нуклеосом могут отличаться от предсказанных в силу того, что посадка на ДНК специфичных в отношении последовательностей белковых факторов, в том числе транскрипционных факторов может препятствовать посадке нуклеосом В англоязычных статьях для характеристики расположения нуклеосом на ДНК часто используются два термина, имеющих принципиально разное значение: FASING – фиксированное расположение нуклеосом на последовательности ДНК SPACING – расстояние между центрами нуклеосом (может быть регулярным – 200 п.н или нерегулярным (крайне редко)

Фиксированное расположение нуклеосом на промоторах и других регуляторных последовательностей может создать серьезные проблемы для транскрипции Эти проблемы устраняются при участии комплексов ремоделирования хроматина Существуют три группы комплексов ремоделирования хроматина, прототипами которых являются swi/snf комплекс дрожжей и NURF (Nucleosome Remodelling Factor) комплекс дрозофилы и NURD (nucleosome remodeling and histone deacetylation complex, активная субъединица – Mi2 активности swi/snf

активности NURF (каталитическая субъединица ISWI)

дестабилизация

слайдинг

перемещение на другую молекулу ДНК

слайдинг

Cубъединичный состав swi/snf ремоделирующих комплексов у разных эукариотических организмов

В клетке существует два пути сборки нуклеосом: пост-репликационная сборка нуклеосом и не зависящая от репликации сборка нуклеосом

В ходе пост-репликационной сборки нуклеосом нуклеосомы собираются только из базовых форм гистонов Вариантные формы гистонов включаются в нуклеосомные частицы в ходе не зависящей от репликации сборки

Если просто смешать гистоны с ДНК, то получатся некие неструктурированные комплексы При наличии того или иного шаперона, понижающего заряд гистонов, либо при повышении концентрации соли происходит самосборка нуклеосом, но не обеспечивается регулярность их расположения на ДНК (спейсинг) Для обеспечения регулярного распределения нуклеосом в системе дорлжен присутствовать комплекс ремоделирования хроматина (ACF или CHRAC)

Зависящая от репликации ДНК сборка нуклеосом осуществляется в два этапа. Сначала на ДНК сажается тетрамер (H3-H4)2. В цитоплазме новосинтезированные гистоны особым образом ацетилируются. Такие ацетилированные гистоны собираются в тетрамер, который переносится в ядро особым шапероном (CAF-1 и ASF-1 (Ati Silencing Function protein1; ASF-1 в коплексе с гистонами называют RCAF), который переносит тетрамер в ядро и обеспечивает его посадку на ДНК за репликационной вилкой. После сборки нуклеосом ацетильные группы удаляются

CAF-1 имеет сродство к PCNA, а ASF-1 cвязывается с CAF-1. Таким образом оба шаперона привлекаются к местам репликации ДНК.

NAP-1/2 является шапероном димера Н2А-Н2В. Последний присоединяется к тетрамеру уже сидящему на ДНК.

С помощью экспериментов по ко-иммунопреципитации было продемонстрировано, что в дрозофилиных клетках ASF1 физически взаимодействует с комплексом ремоделирования хроматина Brahma (SWI/SNF). Таким образом может обеспечиваться возникновение регулярных цепей нуклеосом

В течение ряда лет дебатировался вопрос о том, является ли распределение нуклеосом после репликации консервативным или полуконсервативным

С помощью электронной микроскопии и триоксаленовых сшивок было продемонстрировано, что распределение является полуконсервативным псорален сшивает цепи ДНК только в межнуклеосомных спейсерах

При репликации вирусной ДНК in vitro в условиях отсутствия новых гистонов, псораленовой сшивки и денатурации ДНК можно видеть такие структуры

Более подробные исследования показали, что новосинтезированные нуклеосомы организованы в кластеры в результате чего при переваривании микрококковой нуклеазой наблюдается стандартный нуклеосомный паттерн Возможно это связано с процессивностью работы фактора ремоделирования хроматина ACF1

No Caption Found

Ahmad, Kami and Henikoff, Steven (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16477-16484

Copyright ©2002 by the National Academy of Sciences

Сборка нуклеосом из четырех гетеродимеров гистонов допускает интересную возможность сохранения эпигенетических маркеров за счет построения «химерных» нуклеосом из двух «старых» и двух «новых» гетеродимеров.

клетки инкубировали в течение нескольких генераций в среде, содержащей «тяжелые» (13С, 15N) и радиоактивномеченные аминокислоты. После этого клетки инкубировали в течение 48 часов в нормальной среде. Гистоны в составе «коровых» частиц нуклеосом сшивали формальдегидом в условиях, когда возможна сшивка белков с белками, но не с ДНК (рН 9,0) После этого разделяли нуклеосомные коровые частицы в градиенте плотности. Полученные результаты соответствовали варианту B (тетрамер сохраняется в исходном виде, а димеры Н2А-Н2В могут обмениваться)

Не зависящая от репликации сборка нуклеосом

Особый шаперон - HIRA При посредстве НIRA (histone regulator A) в частности осуществляется замена Н3 на Н3.3 с одновременной утратой H3, ацетилированного по К9 Замена H2A-H2B на H2A.Z-H2B осуществляется при посредстве комплекса

Swr1 Этот комплекс содержит Swi2 АТФазу, родственную Snf2. Таким образом, в данном случае для обмена димеров нужна активность, сходная с активностью фактора ремоделирования хроматина

Утраченная после репликации непрерывность хроматинового домена, содержащего модифицированные варианты гистонов может быть восстановлена путем не зависящей от репликации сборки нуклеосом. В случае нуклеосом, содержащих H3.3 и H2A.Z этому может способствовать процесс транскрипции

Существуют ситуации, когда нуклеосомы надо не собирать, а разбирать (например, чтобы «открыть» промотер) Эксперименты по направленной инактивации генов asf1 b cac 1 (дрожжевой аналог CAF-1 высших эукариот) свидетельствуют о том, что in vivo asf 1 может играть важную роль в разборке нуклеосом. При инактивации asf 1 доступность ДНК для стафилококковой нуклеазы понижается

Adkins, M. W. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:52069-52074