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4.3.2 Los extremos pegajosos aumentan la eficacia de la ligadura La reacción de ligadura en la Figura 4.20a muestra dos fragmentos con la punta roma uniéndose.juntos. Aunque esta reacción puede llevarse a cabo en el tubo de ensayo, no es muy eficaz. Esto se debe a que la ligasa es incapaz de "agarrar" la molécula que se va a ligar, y tiene para esperar a que las asociaciones de azar junten los extremos. Si es posible, ligadura con un extremo romo debe realizarse a altas concentraciones de ADN, para aumentar las posibilidades de los extremos de las moléculas que se juntan de la manera correcta. Por el contrario, la ligadura de los extremos pegajosos complementarios es mucho más eficaz. Este es porque los extremos pegajosos compatibles pueden formar pares de bases entre sí por enlace de hidrógeno (Figura 4.20b), formando una estructura relativamente estable para que la enzima funcione. Si el los enlaces de fosfodiester no se sintetizan con bastante rapidez, entonces los extremos pegajosos se rompen. de nuevo. Estas estructuras transitorias, emparejadas con la base, sin embargo, incrementan la eficiencia de aumentando el tiempo que los extremos están en contacto entre sí. 4.3.3 Colocación de puntas pegajosas en una molécula con punta roma Por las razones detalladas en la sección anterior, es deseable que los extremos pegajosos sean compatibles. en las moléculas de ADN para ser ligadas en un experimento de clonación de genes. A menudo estos los extremos pegajosos se pueden proporcionar al digerir tanto el vector como el ADN con el que se va a clonar la misma endonucleasa de restricción, o con diferentes enzimas que producen la misma enzima pegajoso, pero no siempre es posible hacerlo. Una situación común es cuando el tiene puntas pegajosas, pero los fragmentos de ADN que se van a clonar tienen puntas rotas.En estas circunstancias, se puede utilizar uno de los tres métodos siguientes para colocar el adhesivo correcto termina en los fragmentos de ADN. Enlazadores El primero de estos métodos implica el uso de enlazadores. Estas son piezas cortas de doble filamento ADN, de secuencia nucleotídica conocida, que se sintetizan en el tubo de ensayo. Un enlazador típico se muestra en la Figura 4.21a. Es de punta roma, pero contiene un sitio de restricción, BamHI en el ejemplo mostrado. La ligasa de ADN puede unir los enlazadores a los extremos de los grandes bluntended Moléculas de ADN. Aunque se trata de una ligadura de extremo romo, esta reacción en particular puede ser muy eficientemente porque los oligonucleótidos sintéticos, como los ligantes, pueden ser se fabrica en grandes cantidades y se añade a la mezcla de ligadura a una alta concentración. Más de un enlazador se unirá a cada extremo de la molécula de ADN, produciendo el estructura de la cadena que se muestra en la Figura 4.21b. Sin embargo, la digestión con BamHI rompe el cadenas en las secuencias de reconocimiento, produciendo un gran número de eslabones cortados y el fragmento original de ADN, que ahora lleva los extremos pegajosos de BamHI. Este fragmento modificado está listo para ser ligado a un vector de clonación restringido con BamHI. Adaptadores Hay una desventaja potencial con el uso de los enlazadores. Piensa en lo que pasaría si la molécula con la punta roma mostrada en la figura 4.21b contenía uno o más BamHI de reconocimiento. Si éste fuera el caso, el paso de restricción necesario para dividir el y producir los extremos pegajosos también partiría la molécula de punta roma. (Figura 4.22). Los fragmentos resultantes tendrán los extremos pegajosos correctos, pero eso no significa consuelo si el gen contenido en el fragmento con punta roma se ha roto en pedazos. El segundo método para unir los extremos pegajosos a una molécula con punta roma

está diseñado para para evitar este problema. Los adaptadores, como los enlazadores, son oligonucleótidos sintéticos cortos. Pero a diferencia de los enlazadores, un adaptador se sintetiza de manera que ya tiene un extremo pegajoso. (Figura 4.23a). La idea es, por supuesto, ligar el extremo romo del adaptador a la punta roma. de los extremos del fragmento de ADN, para producir una nueva molécula con extremos pegajosos. Esto puede parecen ser un método simple, pero en la práctica surge un nuevo problema. Los extremos pegajosos de cada individuo podrían formar pares de bases entre sí para formar dímeros (Figura 4.23b), de modo que la nueva molécula de ADN siga estando sin punta (Figura 4.23c). Los extremos pegajosos podría ser recreado por la digestión con una restricción de endonucleasa, pero eso derrotaría el propósito de usar adaptadores en primer lugar. La respuesta al problema radica en la estructura química precisa de los extremos del molécula adaptadora. Normalmente los dos extremos de una hebra de polinucleótido son químicamente un hecho que se desprende claramente de un examen cuidadoso de la estructura polimérica del DNA (Figura 4.24a). Uno de los extremos, denominado "terminal 5′", contiene un grupo de fosfatos. (5′-P); el otro, el terminal 3′, tiene un grupo hidroxilo (3′-OH). En la doble hélice la dos cadenas son antiparalelas (Figura 4.24b), por lo que cada extremo de una molécula de doble cadena consta de un terminal 5′-P y un terminal 3′-OH. La ligadura tiene lugar entre los extremos 5′-P y 3′-OH (Figura 4.24c). Las moléculas adaptadoras se sintetizan de forma que el extremo romo es el mismo que el "natural". ADN, pero el extremo pegajoso es diferente. El terminal 3′-OH del extremo pegajoso es el mismo como de costumbre, pero el terminal 5′-P está modificado: carece del grupo fosfato, y está en hecho a 5′-OH terminus (Figura 4.25a). La DNA-ligasa no puede formar un fosfodiester entre 5′-OH y 3′-OH. El resultado es que, aunque el emparejamiento de bases es siempre se produce entre los extremos pegajosos de las moléculas adaptadoras, la asociación nunca es estabilizado por ligadura (Figura 4.25b). Por lo tanto, los adaptadores pueden ligarse a una molécula de ADN sin filtrar, pero no a sí mismos. Después de conectar los adaptadores, se convierte el terminal anormal 5′-OH. a la forma natural 5′-P mediante el tratamiento con la enzima polinucleótido quinasa (p. 50), produciendo un fragmento con terminación pegajosa que puede ser insertado en un vector apropiado Producción de extremos pegajosos mediante la cola de homopolímero La técnica de la cola de homopolímero ofrece un enfoque radicalmente diferente a la producción de puntas pegajosas en una molécula de ADN con punta roma. Un homopolímero es simplemente un polímero en el que todas las subunidades son iguales.. Una cadena de ADN compuesta completamente de, digamos, la deoxiguanosina es un ejemplo de un homopolímero, y se conoce como polidioxiguanosina o poli(dG). La cola implica el uso de la enzima terminal deoxinucleótidotransferasa (p. 50) para añadir una serie de nucleótidos en los terminales 3′-OH de una molécula de ADN de doble cadena. Si esta reacción se lleva a cabo en presencia de un solo desoxirribonucleótido, un se produce la cola de homopolímero (Figura 4.26a). Por supuesto, para poder ligar juntos dos moléculas con cola, los homopolímeros deben ser complementarios. Frecuentemente polidoxicitosina (poly(dC))) se unen al vector y poly(dG) al ADN para ser clonados. El emparejamiento de bases entre los dos ocurre cuando las moléculas de ADN se mezclan (Figura 4.26b). En la práctica, las colas de poli(dG) y poli(dC) no suelen tener exactamente la misma longitud, y las moléculas recombinantes emparejadas de base que resultan tienen muescas así como discontinuidades (Figura 4.26c). Por lo tanto, la reparación es un proceso de dos pasos, utilizando Klenow polimerasa para rellenar las muescas seguidas de ligasa de ADN para sintetizar el fosfodiester final bonos. Esta reacción de reparación no siempre tiene que realizarse en el tubo de ensayo. Si las colas de homopolímero complementarias son más largas que unos 20 nucleótidos, entonces bastante se forman asociaciones estables de base emparejada. Una molécula de ADN

recombinante, que se mantiene unida por el emparejamiento de bases, aunque no completamente ligado, es a menudo lo suficientemente estable como para ser introducido en la célula huésped en la siguiente fase del experimento de clonación (véase la figura 1.1). Una vezdentro del huésped, la propia polimerasa del ADN de la célula y la ligasa del ADN reparan la recombinación.Molécula de ADN, completando la construcción iniciada en el tubo de ensayo. 4.3.4 Ligadura del extremo romo con una topoisomerasa de ADN Una forma más sofisticada, pero más fácil y, en general, más eficiente de llevar a cabo las tareas de limpieza.es usar un tipo especial de enzima llamada ADN topoisomerasa. En la celda,Las topoisomerasas de ADN están implicadas en procesos que requieren giros de la doble hélice para ser removido o agregado a una molécula de ADN de doble cadena. Los giros se eliminan durante replicación de ADN para desenrollar la hélice y permitir que cada polinucleótido sea se replican y se añaden a moléculas circulares recién sintetizadas para introducir el superenrollamiento. Las topoisomerasas de ADN son capaces de separar las dos hebras de una molécula de ADN sin girar la doble hélice. Consiguen esta hazaña causando que los roturas de una o dos hebras en la columna vertebral del ADN (figura 4.27). Topoisomerasas de ADN por lo tanto, tienen actividades tanto de la nucleasa como de la ligasa. Para realizar una ligadura de extremo romo con una topoisomerasa, un tipo especial de vector de clonación. es necesario. Este es un plásmido que ha sido linealizado por la actividad de la nucleasa del ADN. enzima topoisomerasa del virus de la vacuna. La vacuna topoisomerasa corta el ADN en la secuencia CCCTT, que está presente sólo una vez en el plásmido. Después de cortar el las enzimas topoisomerasas permanecen unidas covalentemente a los extremos rotos resultantes. La reacción puede detenerse en este punto, permitiendo que el vector se almacene hasta que se produzca. necesario. El corte por la topoisomerasa resulta en 5′-OH y 3′-P termini (Figura 4.28a). Si las moléculas con la punta roma que se van a clonar han sido producidas a partir de una molécula más grandeal cortar con una enzima de restricción, entonces tendrán extremos 5′-P y 3′-OH. Antes mezclando estas moléculas con el vector, sus fosfatos terminales deben ser removidos para dar los extremos 5′-OH que pueden ligarse a los terminales 3′-P del vector. Las moléculas son por lo tanto, tratada con fosfatasa alcalina (figura 4.28b). La adición de las moléculas fosfatadas al vector reactiva las topoisomerasas ligadas, que proceden a la fase de ligadura de su reacción. La ligadura se produce entre los extremos 3′-P de los vectores y los extremos 5′-OH de las moléculas fosfatadas. El por lo tanto, las moléculas rotas se insertan en los vectores. Sólo una hebra es en cada punto de unión (Figura 4.28c), pero esto no es un problema porque las discontinuidades será reparado por enzimas celulares después de que las moléculas recombinantes tengan en la bacteria huésped.

3.3 Modificaciones 3.3.1 Evitar la autoligadura Aunque el cribado en blanco azulado que está disponible con la pUC vectores nos permite ver qué colonias de una placa contienen recombinantes los plásmidos, éstos son a veces muy pocos en número comparados con las colonias que contenían el vector que se religaba sin ningún inserto. Si necesitamos recuperar un gran número de moléculas recombinantes diferentes, entonces el gran número de colonias no recombinantes puede ser un problema. Existen varios enfoques para minimizar esto. Uno es aumentar la relación entre el ADN de inserción y el ADN vectorial. Un más solución fiable es utilizar fosfatasa alcalina (Sección 1.3.1). Este es capaz de eliminar grupos de fosfato de 5'-terminales de moléculas de ácido nucleico (y nucleótidos). Sin embargo, estos fosfatos se requieren grupos para que la ligadura se lleve a cabo. Así que si el vector es tratado con fosfatasa alcalina para eliminar su fosfato terminal grupos, entonces la autoligación ya no es posible. Ligadura del vector a inserto, sin embargo, sigue siendo posible porque cada molécula de inserto contiene dos grupos de fosfato, uno en cada extremo. Tenga en cuenta, sin embargo, que el sellado cada límite vector-inserto requiere dos grupos de fosfato, uno para cada hebra. Por lo tanto, el tratamiento con fosfatasa del vector significa que cada límite puede ser sellado covalentemente con ligasa en una hebra solamente. El otro cordón permanecerá cortado, como se muestra en la figura 3.6. Sin embargo, estas muescas no son un problema grave. La transformación es aún posible, y los procesos normales de replicación y reparación celular producirá moléculas que ya no están melladas. En la práctica, el tratamiento con fosfatasa alcalina se lleva a cabo después de que el vector haya sido cortado, y antes de que el vector e insertar el ADN están mezclados. Todos los rastros de actividad de la fosfatasa deben eliminarse antes del se añade el ADN del inserto, de lo contrario, el inserto se desposforilará, y la ligadura intermolecular también será bloqueada. Las fosfatasas alcalinas comúnmente utilizadas son inactivadas por el calentamiento para unos minutos. Este tratamiento puede ir seguido de la eliminación de proteínas con fenol y cloroformo para minimizar cualquier arrastre de activos en las reacciones de ligadura. Si la enzima utilizada es suficiente lábil al calor, se puede omitir la purificación del ADN antes de la ligadura. Un tercer enfoque para aumentar la fracción de recombinantes recuperada es usar vectores más complejos que, si son auto-ligados, dirigen la síntesis de una molécula que mata a la célula huésped. Uno utiliza el gen ccdB (control de la muerte celular). La región de codificaciónpara esto se ordena en el vector de modo que la autoligación resulte en laexpresión de la proteína CcdB y consecuente muerte de las células que contiene la molécula. Esta es la base de'Zero BackgroundTM'. vectores. 3.3.2 Clonación forzada En el ejemplo que hemos considerado, el ADN del inserto podría haber sido ligados al ADN vectorial en cualquiera de las dos orientaciones. En algunos circunstancias, es deseable controlar la orientación en la cual se inserta un fragmento de restricción particular. Esto es a veces llamada clonación forzada. Esto es posible con los vectores pUC, ya que hay muchos sitios de restricción diferentes agrupados en las múltiples sitio de clonación. La región también se

denomina a veces polilinker.La consecuencia de tener esta colección de sitios es que, si el inserto El ADN tiene diferentes sitios de restricción en cada extremo, podemos usar fácilmente un corte vectorial con las dos enzimas correspondientes. Entonces habrá ser sólo una orientación única en la que el inserto puede ser ligado al vector. Hay una serie de vectores pUC con diferentes combinaciones y disposiciones de los lugares de restricción en el lugar de clonación múltiple. Ellos generalmente vienen en pares cuyos múltiples sitios de clonación son espejo imágenes de unos y otros, como se muestra en la figura 3.7. Se generaron Fig. 3.6 Tratamiento con fosfatasa de vector. Eliminación de la grupos de fosfato (P) del vectorial significa que la autoligación es No es posible. Ligadura a la amolécula. con fosfatos de 5' sigue siendo posible, aunque un estrangulamiento será cortado en cada cruce por la ligación de diferentes moléculas de ADN sintético que contienen el sitios de restricción apropiados en un sitio EcoRI cerca del principio del lacZ' minigene. Esta amplia combinación de sitios de restricción, combinada con la de color blanco azulado, hace que los vectores de la pUC sean muy versátiles. Allí son muchas otras series de vectores basados en el mismo principio, pero con características adicionales (por ejemplo, para impulsar la transcripción del ADN de la inserción). Más adelante nos ocuparemos de algunos ejemplos de ello. 3.3.3 Productos de PCR de clonación El método básico de clonación puede aplicarse a la clonación de PCR productos. En el caso más sencillo, podemos tratar los productos de PCR como embotellados moléculas de ADN y ligarlas a un vector que ha sido cortado para dar cabos sueltos. Muy a menudo, esta ligadura de la punta roma no es muy eficiente. Un mejor enfoque es incorporar los sitios de restricción en los primers utilizados para la PCR. Por lo tanto, los productos de PCR tendrán estos sitios de la restricción situados en cada extremo y pueden ser cortados con la(s) enzima(s) apropiada(s) antes de una ligadura con terminación pegajosa en un vector de corte apropiado. Puede ser aún más eficiente explotar el hecho de que muchos preparados de polimerasa utilizados para la PCR incorporan un adicional Un residuo que no está codificado en la plantilla en el extremo del moléculas que sintetizan. Los productos pueden, por lo tanto, ser ligados directamente en moléculas vectoriales que tienen un residuo T que sobresale. Se puede hacer una preparación vectorial de ADN adecuada cortando el vector con una enzima que genera extremos rotos y luego enzimáticamente añadiendo un residuo de 3' T a los extremos. Esta es la base de la pGEM-T serie vectorial, que están disponibles comercialmente como plásmidos linealizadoscon el residuo de T añadido. 3.3.4 Métodos que no utilizan ADN ligasa En el experimento básico, usamos enzimas de restricción para cortar el ADN moléculas y ligasa para unirse a ellas. Hay otros sistemas que tienen diferentes formas de cortar y ligar moléculas.Suelen ser más rápidos que los enfoques basados en la DNA ligasa, pero son más nuevos y menos utilizados. 1. Topoisomerasa. Este enfoque utiliza el virus Vaccinia topoisomerasa I. En vivo, rompe una hebra de una molécula de ADN en la secuencia de reconocimiento -C/TCCTT- y se convierte en covalentemente unida a un extremo de la molécula dividida. El superenrollamiento de la plantilla de ADN puede entonces ser alterada girando alrededor del la hebra sin guardar, y la enzima entonces sella la hebra original y se disocia del ADN. Topoisomerasa disponible en el mercado. (sistemas de'TOPO Clonación'). en forma lineal, con la enzima topoisomerasa adherida. El la topoisomerasa ligará rápidamente el vector a un sustrato adecuado moléculas. Para la clonación de productos de PCR con residuos A sobresalientes, el vector tiene un único residuo T que sobresale con la topoisomerasa adjunto. El producto de la PCR puede recocer al vector y de la misma manera, se liga rápidamente.

2. Recombinase. Se pueden utilizar reacciones de recombinación específicas del sitio para clonar productos de PCR o transferir piezas insertadas de ADN rápidamente de un vector a otro. Esta es la base de la Sistema'Gateway', basado en bacteriófagos lambda (Sección 4.4). Este bacteriófago puede integrar su ADN en un sitio específico recombinación entre un sitio en el fago (attP) y un sitio en el genoma del huésped (attB). Se explota la recombinación a través de los sitios de att en el sistema Gateway para transferir insertos directamente entre vectores llevando a los sitios de att. Para la clonación de productos de PCR, por ejemplo, el primers contienen el sitio attB. El vector receptor (denominado vector de entrada) contiene secuencias attP que flanquean el lugar de inserción. Adición de la recombinación de catalizadores de proteínas recombinadas entre los emplazamientos attB y attP, integrando el producto PCR en el vector, como se muestra en la figura 3.8. El inserto puede ser transferido, si es necesario, a diferentes vectores que tienen de los sitios por recombinación similar específica del sitio. Alternativamente, los fragmentos de restricción pueden ser insertados en un vector de entrada mediante ligadura convencional y luego transferida a otros vectores mediante recombinación. 3.4 Eslabones, adaptadores y casetes 3.4.1 Enlazadores La importancia de la pUC y otros vectores similares se debe en gran medida a la presencia del centro de clonación múltiple, con su capacidad de aceptar una amplia gama de fragmentos diferentes. Una característica similar es ofrecida por moléculas llamadas enlazadores. Estos son cortos, químicamente sintetizados moléculas que contienen un reconocimiento enzimático de restricción particular dentro de su secuencia. Un ejemplo de esto, un enlazador EcoRI, es que se muestra en la figura 3.9. Usando los enlazadores EcoRI, es posible clonar un bluntended insertar una molécula en un vector portador de un sitio de clonación EcoRI. Los enlazadores son a su vez moléculas rotas, y pueden ser unidos en la molécula de inserción de la punta roma usando ADN ligasa T4. Aunque La reacción (al ser una ligadura con punta roma) es relativamente ineficaz, el uso de un exceso de enlazador ayuda a asegurar que una gran proporción de las moléculas de inserción tienen enlazadores en los extremos. Algunas moléculas terminan con más de un enlazador en cada extremo, pero que no es un problema. El siguiente paso es tratar las moléculas del inserto-linker con la enzima de restricción apropiada, que corta dentro de la para dejar un solo corte en cada extremo del inserto. Así que el inserto ahora tiene extremos pegajosos, que se pueden usar para la inserción en un sitio de restricción de la manera habitual. Esto se resume en Figura 3.9 Sin embargo, hay un problema potencial. Si el inserto contiene un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción del enlazador, luego el segundo paso del proceso en la Figura 3.9 cortará el inserto así como el enlazadores. Es probable que esto no sea deseable. Se puede evitar con tratamiento de la inserción, antes de la adición de los enlazadores, con el correspondiente metilasa: EcoRI metilasa si se están utilizando enlazadores EcoRI. Este hace que la molécula sea insensible a la enzima de restricción, la cual todavía será capaz de cortar el enlazador. Por supuesto, una forma alternativa de clonar ADN sin filtrar en un vector con extremos EcoRI es evitar el uso de enlazadores y en su lugar pulirlos los extremos del vector de corte para hacerlos embotados. Eso podría ser seguido por una ligadura de inserción de ADN en el vector. ¿Cuáles son los ventajas de usar enlazadores? Hay tres ventajas principales. Uno es que hace un mejor uso del ADN del inserto y del vector, que puede escasear. Ligadura del inserto con punta roma en la punta roma es una reacción ineficiente, en la que gran parte de la inserción es ...desperdiciado. Ligadura del enlazador de punta roma en el inserto de punta roma también puede ser ineficiente. Sin embargo, usamos un gran exceso de enlazadores (que se encuentran en abundante suministro, siendo sintetizados en una sustancia química escala), de modo que una gran proporción de insertos adquiere enlazadores y puede ser eficientemente ligados al vector.

La segunda ventaja, que también viene con el uso de un exceso de enlazadores, es que la probabilidad de que dos insertar moléculas de ADN que se ligan entre sí (concatenadas) es reducido. La tercera ventaja viene cuando es necesario cortar el del vector en una etapa posterior. Es poco probable que la ligadura de un inserto sin filo en el vector que ha sido cortado con EcoRI y luego pulido regenerará cualquier sitio de restricción. Por lo tanto, es difícil, para extirpar el inserto con precisión del vector. Sin embargo, insertar clonado en el vector EcoRI-cortado usando los enlazadores EcoRI puede ser fácilmente extirpado simplemente por redigestión con EcoRI. No hay ninguna razón por la que un enlazador deba tener sólo una restricción en su interior. Los enlaces que contienen varios sitios están disponibles. A menudo se les llama polilinker, y se parecen a la clonación múltiple. sitio de los vectores de la pUC. 3.4.2 Adaptadores Uno o ambos extremos de un enlazador pueden ser de un solo hilo. Estos son a veces llamados adaptadores. En la figura 3.10 se dan ejemplos. El se muestra por primera vez es un adaptador que es romo en un extremo (como un adaptador convencional ) y pegajoso en el otro. Por lo tanto, se puede ligar, sin necesidad de más digestión, a una molécula de punta roma para dejar un extremo pegajoso. Tenga en cuenta que en este ejemplo el extremo sobresaliente de 5' no está fosforilado; esta falta de un grupo de fosfato impide la concatenación de adaptadores en la reacción de ligadura (lo que oscurecería la pegajosa que se utilizarán para la clonación). Algunos adaptadores (como el segundo ejemplo en la Figura 3.10) son pegajosas en ambos extremos y pueden ser fijadas a una molécula que ya está pegajosa. Los adaptadores también pueden tener sitios de restricción dentro de su secuencia. 3.4.3 Casetes (cartuchos de clonación) Los casetes (cartuchos de clonación) son una combinación de enlazadores con otroscomo marcadores seleccionables. En su forma más simple. consisten en un gen de resistencia a los antibióticos flanqueado por ADN que contiene múltiples sitios de clonación (Figura 3.11). Por consiguiente, pueden utilizarse como una manera fácil de incorporar marcadores seleccionables u otros marcadores. en moléculas de ADN. Esto puede ser particularmente útil como forma de inactivar un gen clonado en la técnica de disrupción de genes (ver Sección 7.6). Los casetes pueden contener señales de expresión génica (como promotores, terminadores, etc.) en lugar de marcadores seleccionables. Estos casetes se llaman casetes promotores, casetes terminator, y así sucesivamente.