Laporan Paraffin.docx

1

Kegiatan ke 2 Pembuatan Preparat Jaringan Hewan (Dengan Metode Paraffin Block)

A. Tujuan Kegiatan l. Mahasiswa dapat nłengetalłui teknik pembuatan preparat jaringan hewan dengan menggunakan paraffin block 2. Mahasiswa dapat membuat preparat jaringan hewan dengan menggunakan paraffin block 3. Mahasiswa dapat mengidentifikasi dan menyajikan hasil preparat jaringan hewan dengan menggunakan paraffin block

B. Kajian Pustaka Mikroteknik adalah teknik atau cara pembuatan sediaan secara mikroskopis. Yang dimaksud dengan sediaan adalah semua obyek yang akan diamati atau diperiksa dalam kegiatan praktikum biologi. Sediaan dalam praktikum biologi dapat dibedakan berdasarkan macam, sifat, dan ukurannya. Berdasarkan macamnya sediaan dibedakan atas sediaan mikroskopis dan makroskopis, berdasarkan sifatnya ada sediaan basah dan permanen, sedangkan berdasarkan bentuknya dibedakan atas sediaan utuh (whole mount) dan sediaan irisan atau potongan. Mikroteknik disebut juga dengan istilah Histolgcal Techniques

yang

sangat

diperlukan

untuk

mendukung

bidang

ilmu;

mikroanatomi (histologi), sitologi, genetika sel, imunologi, mikrobiologi, patologi, dan biologi perkembangan (Jailani, 2011: l). Setiap makhluk hidup dapat berperan sebagai sumber sediaan basah maupun permanen, baik keseluruhan maupun sebagian, misalnya: darah, cairan eksudat, jaringan lunak, jaringan keras, epitel mukosa, embrio, kutu kepala, kutu kucing, spirogyra, ujung akar bawang merahm ujung batang tanaman, daun dan sebagainya. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan permanen antara lain: organ-organ yang besar diambilsebagian misalnya hepar atau liper, organ yang berongga perlu dibuat ligature, diinjeksi cairan fiksatif secukupnya, untuk organ yang tipis diperlukan perentangan di atas cawan petri dengan menggunakan alat non fiksatif, sedangkan organ yang keras seperti tulang keras diperlukan metode penggosokan memanjang atau melintang atau dengan melakukan proses deklasifikasi (menghilangkan unsur kalsium dari dalam jaringan) (Jailani, 2011: 1). Metode paraffin digunakan untuk membuat sediaan permanen yang disayat atau dipotong. Untuk mendapatkan irisan jaringan yang tipis digunakan paraffin sebagai penyokong. Paraffin dapat emberikan konsistensi yang kuat sehingga pemotongan lebih mudah dilakukan (Jailani, 2011 : 5). Menurut Jailani (2011, 5) cara oembuatan sediaan secara garis besar dengan menggunakan metode paraffin meliputi:

2

1. Collecting (pengumpulan spesimen) dan fiksasi dengan bahan fikastif 2. Washing (pencucian) untuk menghilangkan sisa-sisa bahan fiksatif 3. Dehidrasi (menarik air dalam jaringan) dengan menggunakan alkohol bertingkat dari konsentrasi 50% sampai dengan 100% (absolut) 4. Clearing (menjadikan jaringan lebih jernih dan transparan), menggunakan bahan minyak seperti xylol atau xylene 5. Infiltrasi (penyusupan paraffin ke dalam rongga-rongga sel atau jaringan) menggunakan paraffin cair yang telah dipanaskan, proses infiltrasi berlangsung di dalam pemanas paraffin 6. Embedding (pembenaman atau penanaman potongan jaringan dalam block paraffin) 7. Sectioning (pemotongan jaringan dalam block paraffin menjadi pita-pita coupes) dengan memakai mikrotom putar (rotary microtome) 8. Affiixing (penempelan coupes dalam seri pewarnaan tertentu) 9. Staining (pewarnaan coupes dalam seri pewarnaan tertentu) 10.Mounting (pemberian perekat dengan indeks bias yang sama dengan indeks bias object glass dan cover glass, sering digunakan entelan sebagai mounting media) 11.Labelling (pemberian label atau keterangan yang memuat lab penghasil, bahan sediaan, asal jaringan, arah potongan dan macam pewarnaan) Menurut Jailani (2011, 5-6) beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan sediaan dengan metode paraffin: 1. Jangan mengoleksi potongan jaringan terlalu tebal, sehingga proses fiksasi berlangsung lebih lama 2. Saat pencucian jangan terlalu lama jaringan direndam di dalam air, karena jaringan akan menyerap air terlalu banyak 3. Proses dehidrasi, clearing dan infiltrasi lakukan sesuai dengan jadwak waktu yang telah ditentukan 4. Sebelum melakukan embedding jaringan disesuaikan dulu dengan paraffin panas yang telah disiapkan 5. Saat melakukan embedding suasana suhu jaringan dengan paraffin harus sama, sehingga jaringan melekat erat dengan paraffin 6. Lakukan triming sebelum jaringan dipotong dengan menggunakan mikrotom putar, agar coupes tidak melipat pada saat pemotongan 7. Bentangkan coupes pada water bath atau langsung ditempelkan pada object glass yang sebelumnya telah diolesin gliserin-albumin 1 : 1 8. Keringkan coupes pada oven paraffin hingga paraffin melekat pada object glass 9. Warnai coupes dalam seri pewarnaan sesuai dengan metode pewarnaan yang dibutuhkan

3

10. Bersihkan kaca objek dari sisa-sisa pewarnaan dan xylol yang masih menempel sebelum memberikan mounting media berupa entellan 11. Saat mounting usahakan tidak ada gelembung udara yang terjebak diantara object glass dan cover glass Metode yang digunakan pada penelitian kali ini adalah metode paraffin yaitu metode yang paling sering digunakan. Keuntungan menggunakan metodi ini yaitu pertama, irisan dapat lebih tipis dibandingkan enggunakan metode lainnya yaitu daoat mencapai ketebalan rata-rata 6 mikrometer. Kedua, irisan yang sifatnya seri dapat mudah dikerjakan. Ketiga, prosespengerjaannya lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin (mikrotom beku). Selain keuntungan tentu ada kerugian dari metode ini yaitu jaringannya akan menjadi keras, mengerut dan mudah patah serta untuk jaringan yang besar akan sulit dikerjakan dan enzim-enzim akan Iarut pada metode ini (Sari, 2015: 1l). Proses pengolahan pembuatan block ini dimulai dari fiksasi, pencucian (washing), dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi paraffin, penanaman (embedding), penyayatan (section), penempelan (affixing), deparafinisasi pewarnaan (staining), penutupan (mounting), dan labelling (Sari, 2015: 1l). Fiksasi

merupakan

suatu

usaha

untuk

mempertahankan

komponenkomponen sel atau jaringan agar tidak mengalami perubahan dan tidak mudah rusak. Proses fiksasi ini diharapkan setiap molekul pada jaringan yang hidup tetap berada pada tempatnya dan tidak ada molekul baru yang timbul. Pada prosesnya ini tentu tidak akan berjalan dengan sempurna, apabila timbul molekul asing baru padajaringannya disebut artefak (Sari, 2015: 11-12). Menurut Jailani (2011, 7) tahap dalam fiksatif, yaitu: 1. Larutan fixatif: Bouin's solution Bahan: Picric acid jenuh, aquosa 75 ml, Formaldehyde 25 ml, Glacial acetic acid 5 ml 2. Potong-potong jaringan yang akan dibuat sediannya (insang, jantung, ginjal, otak, tulang, dan lain-lain) sebesar 1x1 cm 3. Isilah botol plakon dengan Iarutan fiksatif. Usahakn organ atau jaringan sediaannya terendam. Usahakan jaringan tidak melipat atau melengkung dan banyaknya Iarutan fiksatif yang digunakan paling sedikit 10 kali besarnya jaringan sehingga dapat terendam 4. Beri labellah botol plakon tersebut sesuai dengan jenis yang ada di dalamnya dengan pensil 2B 5. Rendam selama 24 jam untuk jaringan otot. 5-6 jam untuk jaringan yang lunak seperti rendan hepar. Dehidrasi merupakan metode yang digunakan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan setelah dilakukan proses fiksasisehingga nantinya dapat diisi dengan paraffin untuk membuat block preparat. Proses dehidrasi ini menggunakan alkohol bertingkat. Mulai dari alkohol 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, dan alkohol absolut. Prosesnya, suatu

4

jaringan akan dicelupkan dimasing-masing alkohol dengan kisaran waktu tertentu sampai prosesnya berakhir (Sari, 2015: 12). Berbagai jenis dehidratan yang dapat digunakan antara Iain adalah etanol atau alkohol, isopropil alkohol, dan aseton. Dehidratan yang digunakan berseri mulai dari kadar rendah yang banyak mengandung air hingga kadar tinggi. Untuk jaringan embrionik akan memberikan hasil lebih baik jika dimulai dengan etanol 30%. Etanol merupakan cairan bening, mudah terbakar, hidrofilik, dan larut dalam air hingga kadar tinggi (Jailani, 2011: 2). Menurut Jailani (2011, 7-8) tahapan dehidrasi bertahap, yaitu: 1. Siapkan larutan alkohol dengan urutan konsentrasu menaik dari 70%, 80%, 90%, 95% dan alkohol absolut. Tempatkan masing-masing larutan tersebut dalam suatu tempat atau botol dan beri label Iuarnya. 2. Buanglah larutan fiksatif bouin's tersebut dengan alkohol 70%, dikosvokkocon hingga bersih dan diganti setiap 1/2 jam sekali (tidak mutlak) jangan berpindah kelarutan diatasnya jika dalam larutan alkohl 70% ini belum jernih untuk proses selanjutnya pekerjaan tidak boleh dihentikan kembali pada tahap dehidrasi dalam alkohool 70% relatif cukup aman dapat ditunda hingga beberapa hari 3. Gantilah semua larutan alkohol 70% dengan alkohol 80% selama 3x 1/2 jam 4. Gantilah semua larutan alkohol 80% dengan alkohol 90% selama 3x 1/2 jam 5. Gantilah semua larutan alkohol 90% dengan alkohol 95% selama 3x l/2 jam 6. Gantilah semua larutan alkohol 95% dengan alkohol absolut selama3x1/2 jam Penjernihan adalah metode yang digunakan mengeluarkan alkohol dari jaringan dan menggantikannya dengan suatu larutan yang berikatan dengan paraffin. Pada proses clearing ini sangat kruisal karena apabila di jaringan masih tersisa alkohol walaupun sedikit, paraffin tidak akan nisa masuk ke dalam jaringan. Sehingga jaringan nantinya tidak akan sempurna dalam pembuatan blocking, pemotongan, dan pewarnaan. Proses clearing ini menggunakan bermacam-macam zat penjernih yaitu xylol atau xylene dan toluol atau toluene yang memiliki kelebihan dan kekurangannya masingmasing. Xylol atau xylene kelebihannya yaitu prosesnya cepat dan harganya tidak terlalu mahal. Kekurangannya yaitu jaringan dapat dipindahkan hany dari alkohol absolut, dan jaringan yang dijernihkan dengan xylene tidak begitu jelas menjadi transparan, sehingga tidak diketahui proses ini berjalan sempurna atau tidak (Sari, 2015: 12). Toluol atau toluene kelebihannya yaitu sudah banyak dipergunakan oleh kebanyakan laboratorium, harganya murah, mudah didapat, dan jaringan yang penjernihannya sempurna akan terlihat jelas transparan. Tetapi apabila jaringan tidak terlihat transparan berarti proses dehidrasi yang sebelumnya belum sempurna. Kekurangannya yaitu jaringan hanya bisa dipindahkan dari alkohol absolut apabila jaringan terlalu lama di toluol akan menyebabkan kerasnya jaringan sehingga sukar untuk dipotong menggunakan mikrotom (Sari, 2015: 1213).

5

Penanaman (embedding) merupakan proses untuk mengeluarkan cairan pembening dari jaringan dan digantikan dengan paraffin. Jaringan ini harus terbebas dari cairan pembening karena nantinya akan mengkristal dan sewaktu dipotong jaringan akan dibenamkan di larutan parffin selama 3x dan dalam jangka waktu tertentu sambil dipanaskan agar paraffinnya tidak membeku. Keuntungan menggunakan paraffin dengan titik lebur rendah yaitu jaringannya tidak mudah menjadi rapuh. Sedangkan keuntungan memakai paraplast yaitu sifat paraffinnya sangat elastis sehingga tidak mudah robek atau rusak ketika dipotong (Sari, 2015: 13). Menurut Jusuf (2009, 19) zat pembenam (impregnasi agent) yang dipakai adalah: 1. Paraffin cairan panas yang mempunyai temperatur lebur (melting temperature) 2. Paraffin hisotek khusus (tissue mat) dengan suhu 560C 3. Paraplast yaitu campuran paraffin murni dengan beberapa polimer plastik Keuntungan memakai paraffin dengan titik lebur rendah adalah jaringan tidak mudah menjadi rapuh/ garing. Keuntungan memakai paraplast adalah sifat paraffinnya lebih elastis sehingga tidak mudah sobek ketika dipotong dengan mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah (Jusuf, 2009: 20). Pembuatan blocking merupakan proses pembuatan proses agar dapat dipotong menggunakan mikrotom. Proses ini menggunakan paraffin sebagai alat menempelkan jaringannya agar mudah dipotong. Prosesnya yaitu dengan menyiapkan tempat blockingnya, dan menuangkan paraffin dilanjutkan dengan memasukkan organ ke dalam paraffin yang sudah disediakan. Selanjutnya setelah block paraffin kering dan sudah beku dapat dikeluarkan dari tempat blocking dan dapat dilanjutkan ke proses selanjutnya. Block paraffin yang sudah beku akan dipotong harus diberi label atau disebut affiksing, metode ini bertujuan agar diketahui organ yang akan dipotong nanti. Pengecoran (blocking) adalah proses pembuatan block preparat agar dapat dipotong dengan mikrotom (Sari, 2015: 13). Pemotongan (mounting) adalah proses pemotongan block preparat dengan menggunakan mikrotom (Jusuf, 2009: 21). Menurut Jusuf (2009, 21) sebelum melakukan pemotongan rangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah: l. Persiapan pisau mikrotom Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau mikrotom kemudian diletakkan pada tempatnya di mikrotom dengan

sudut

tertentu.

Rekatkan

block

paraffin

pada

holder

denganmenggunakan spatula atau scalpel. Letakkan tempat duduk blok paraffin beserta block preparat pada tempatnya pada mikrotom 2. Persiapan kaca objek

6

3. Persiapak waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C 4. Persiapan sengkelit atau kuas Menurut Jusuf (2009, 21-22) teknik pemotongan paraffin

yang

mengandung preparat adalah sebagai berikut: l. Rekatkan blok paraffin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok paraffin beserta blok paraffinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat 2. Letakkan pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya sudut kemiringan berkisar 20-300 C 3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya diapaki ketebalan antara 5-7 mikrometer 4. Gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok preparat secara teratur dn ritmis. Buang pita-pita paraffin yang awal tanpa jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan 5. Pita paraffin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati menggunakan sengkelit atau kuas ke dalam waterbath yang temperaturnya diatur 37-40 0C dan biarkan beberapa saat hingga pita paraffin tersebut mengembang 6. Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan pita paraffin tersebut pada kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu ke dalam waterbath dan menggerakannya ke arah pita paraffin. Dengan menggunakan sengkelit atau kuas pita paraffin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita paraffin tidak melipat 7. Letakkan kaca objek yang berisi pita paraffin di atas hot plate dengan temperatur 40-45 0C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca objek diatas api sehingga pita paraffin melekat erat di atas kaca objek 8. Setelah air kering dan pita paraffin telah melekat dengan kuat. Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai Pewarnaan adalah teknik untuk memberikan warna pada komponen selular dengan tujuan dapat membedakan antar sel tersebut. Warna adalah persepsi dari mata yang dapat dibedakan berdasarkan panjang gelombang. Teknik pewarnaan ini membantu dalam menghasilkan kontras dimana setiap warna memiliki afinitasnya masing-masing (Sari, 2015: 15). Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin (HE) adalah jenis pewarnaan rutin yang paling umum dipakai. Prosedur ini digunakan dalam proses pembuatan preparat histopatologi dan berbagai spesies hewan sakit atau mati akan memerlukan pemeriksaan histopatologi untuk peneguhan diagnosis hewan yang bersangkutan (Muntiha, 2011: 1).

7

Hematoksilin yang berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik) serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dnegan nuansa yang berbeda (Jusuf, 2009: 24). Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863. Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawa lainnya seperti aluunium, besi, krom, dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang sering dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini dikenal sebagai ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida, potassium pennaganat dan sodium iodat (Jusuf, 2009: 24). Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hamtoksilin untuk mewarnai inti sel akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk memperpanjang proses ini larutan hemaktosilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan diganti sekurangkurangya seminggu sekali. Jenis hemaktosilin y sering dipakai adalah mayer, delafied, erlich, safranin, dan phloxine (Jusuf, 2009: 24).