Laporan 2 Fix.docx

A. TOPIK Pewarnaan Bakteri Secara Gram dan Pengukuran Sel Bakteri B. TANGGAL PRAKTIKUM 8 Februari 2018 C. TUJUAN PRAKTIKUM 1. Agar mahasiswa bisa melakukan pewarnaan Gram. 2. Agar mahasiswa dapat mengidentifiksi bakteri biakan berdasarkan pewarnaan Gram. 3. Agar mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroba. 4. Agar mahasiswa dapat menentukan ukuran bakteri biakan. D. DASAR TEORI Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi

dua

yaitu setengah melengkung dan melengkung

(Dwidjoseputro,1998). Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro,1998). Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay,1994). Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas

(Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo,1990). Metode pewarnaan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo, 1990). Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan

berkaitan

dengan

muatan

negatif

dalam

mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 1998).

sel,

sehingga

Ada dua teknik untuk melakukan prosedru pewarnaan gram, takni teknik Hucker dan Burke. Menurut teknik pewarnaan Hucker, pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedang pada bakteri negatif berwarna merah (Tim Pengajar Mikrobiologi, 2018). Ukuran sel mikroba bervariasi dari 1 µm sampai dengan beberapa µm. Ukuran sel bakteri lebih kecil daripada sel khamir san sel kapang. Oleh karena itu untuk memperoleh bayangan benda yang jelas pada sel bakteri, pengukuran sel bakteri dilakukan pada perbesaran kuat yakni 1000x (Tim Pengajar Mikrobiologi, 2018). Pengukuran

sel

mikroba

dilakukan

dengan

menggunakan

mikrometer okuler. Jika akan mengukur sel mikroba, skala mikrometer okuler terlebih dahulu harus ditera, karena ukuran skala mikrometer okuler pada pembesaran yang berada tidak sama. Peneran skala mikrometer okuler dilakukan dengan memasang mikrometer okuler dalam lensa okuler dan memasang mikrometer obyektif pada meja sediaan mikroskop. Harga skala mikrometer obyektif sudah terukur, yaitu 1 skala = 0,01 mm (Tim Pengajar Mikrobiologi, 2018). E. ALAT DAN BAHAN 1. Pewarnaan bakteri secara Gram Bahan : a. Biakan murni bakteri dalam media agar miring yang berumur 1x24 jam b. Air kran dalam botol pencuci c. Akuades steril d. Kertas hisap e. Minyak emersi f. Xylol g. Reagen pewarna Gram, terdiri dari : a) Amonium oksalat kristal violet b) Safranin c) Iodium d) Alkohol 95%

Alat : a. Mikroskop b. Kaca benda c. Pinset d. Kawat inokulasi kolong e. Kawat inokulasi lurus f. Mangkok dan kawat pewarna g. Lampu spiritus 2. Pengukuran sel bakteri Alat : a. Mikroskop b. Mikrometer okuler c. Mikrometer obyektif Bahan : a. Sediakan bakteri yang sudah diwarnai b. Minyak emersi c. Xylol d. Kertas lensa

F. PROSEDUR KERJA 1. Pewarnaan bakteri secara Gram Sediakan kaca benda bersih, panaskan di atas nyala api spiritus dengan menggunakan pinset, kemudian biarkan dingin dengan cara meletakkan di atas kertas tissue

Teteskan akuades steril 1 tetes menggunakan kawat inokulasi kolong

Ambil jarum dari biakan murni dengan menggunakan kawat inokulasi lurus sebanyak 1 ujung jarum, kemudian letakkan pada akuades dan ratakan menggunakan ujung kawat inokulasi Biarkan sediaan bakteri mengering sendiri, hal ini berarti anda telah membuat sediaan bakteri secara kering udara

Lakukan fiksasi dengan panas, caranya dengan melewatkan sediaan di atas api lampu spiritus Lakukan pewarnaan dengan menggenangi sediaan menggunakan reagen amonium oksalat kristal violet selama 3 menit Bilaslah dengan air kran yang mengalir perlahan, kemudian keringkan dengan menekan kertas hisap

Genangi sediaan denga iodium selama 1 menit. bilas lagi dengan air kran, lalu keringkan

Genangi sediaan di dalam etanol 95% selama 30 detik sambil menggoyang-goyangkan, dan kemudian tekan dengan kertas hisap sampai kering

Genangi sediaan dengan pewarna safranin selama 30 detik, bilas dengan air kran sampai tidak tampak lagi, adanya warna di dala air bilasan, kemudian keringkan dengan kertas hisap Amati sediaan yang telah kering di bawah mikroskop, mula mula dengan perbesaran lemah, kemuddian lanjutkan pembesaran kuat 1000x dengan memberi minyak emersi di atas sediaan.

2. Pengukuran sel bakteri a. Menera skala mikrometer okuler Pasanglah mikrometer okuler ke dalam lensa okuler mikroskop dengan membuka bagian atas lensa okuler

Pasanglah mikrometer obyekif di atas sediaan mikroskop

Amati pada pembesaran lemah terlebh dahulu, kemudian dengan memutar penggerak mikro aturlah kedudukan lensa okuler sedemikian rupa sehingga didapatkan bayangan garis skala dari kedua mikrometer yang paling jelas Lakukan pengubah lensa obyektif sampai pada pembesaran kuat ( umumnya sel bakteri dan khamir, pada pembesaran 1000x, sedang sel jamur bisa diukur pada pembesaran 450x). putarlah penggerak mikro untuk memperoleh bayangan dari mikrometer obyektif yang paling jelas

Aturlah posisi garis pada mikrometer obyektif sedemikian rupa sehingga dua garis pada mikrometer obyektif dan mikrometer okuler berhimpit

Hitunglah jumlah skala mikrometer okuler dan mikrometer obyektif yang berada diantara dua garis mikrometer okuler yang berhimpit

teralah jarak satu skala mikrometer okuler dengan cara : a x 0,01 mm / n

b. Pengukuran sel bakteri Ambilah mikrometer obyektif dari meja mikroskop, gantilah dengan preparat mikroba yang akan diukur Aturlah posisi sel pada preparat sehingga berada pada daerah skala mikrometer okuler. caranya dnegan meletakkan preparat persis di daerah tengah lingkaran pandang, disamping juga dapat disertai memutar lensa okuler Lakukan pengukuran minimal 3 kali. pengukuran terhadap sel bakteru berbentuk basil meliputi diameter dan panjang, ukuran spora dalam diameter

Catatlah ukuran mikroba dengan skala mikrometer okuler, kemudian tentukan ukuran sebenarnya G. HASIL PENGAMATAN

No Koloni

Bentuk

Warna

Sifat Gram

Ukuran

A

Kokus

Merah

Negatif

D = 2µ

B

Basil

Ungu

Positif

P = 12,8 µ D = 1,6 µ

 24 Lensa okuler = 4 Lensa objektif X = a x 0,01mm N X = 0,04 24 X = 0,0016 nm X = 1,6 µ 

Bakteri A D = 2µ



Bakteri B D = 1,6 µ P = 1,6 x 8 = 12,8 µ

H. ANALISIS DATA Bakteri A memiliki bentuk kokus, berwarna merah yang menandakan bakteri tersebut memiliki sifat gram negatif, Bakteri A memiliki ukuran diameter 2µ. Bakteri B memiliki bentik basil, berwarna ungu yang menandakan bakteri tersebut memiliki sifat gram positif, bakteri B memiliki ukuran panjang 12,8 µ dan lebar 1,6 µ. I. PEMBAHASAN Praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan gram dan pengamatan morfologi pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan

yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi

untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet (Razali, 2007). Sebelum memulai dan megakhiri praktikum diperlukan proses sterilisasi dengan menggunakan teknik aseptik. Lisol yang disemprotkan pada meja untuk menstrelisasikan permukaan meja dari mikroba yang lain. Tangan praktikan sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu kemudian disemprot dengan alkohol 70%. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat. Pada saat dilakukan proses pewarnaan gram, Kultur biakan murni diambil dan diratakan diatas preparat. Pengambilan kultur biakan murni tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur biakan tidak dapat diratakan secara tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Setelah kultur biakan murni diletakkan di preparat, kemudian diberi aquade steril dan dibiarkan hingga kering,

apabila sudah kering, dilanjutkan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan reagen amonium oksalat kristalviolet sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 3 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari reagen amonium oksalat kristalviolet. Kemudian ditambahkan iodium. Iodium merupakan larutan yang berfungsi untuk memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna (Waluyo, 2007). Alkohol 95% ditambahkan selama 30 detik sambil digoyanggoyangkan pada biakan bakteri yang berfungsi untuk melarutkan lipid pada membran bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar, kemudian dilakukan pengeringan yang kemudian dilanjutkan dengan menggunakan safranin sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Kemudian cuci dengan air mengalir mengeringkan dengan kertas hisap. Larutan ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop (Sutedjo, 2003). Berdasarkanpraktikum yang dilakukan yaitu ditemukan bakteri yang pertama bentuk kokus berwarna merah yang artinya bahwa bakteri tersebut bersifat gram negatif dan bakteri yang kedua yaitu basil berwarna ungu yang artinya bakteri tersebut bersifat gram positif. Perbedaan dasar

antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Pada bakteri gram positif yaitu mempunyai struktur dan komposisi dinding selnya lebih sedikit mengandung lemak, akan mengalami dehidrasi karena perlakuan dengan alkohol, sehingga ukuran pori-pori dan permeabilitas dinding sel menjadi berkurang, ini yang menjadi sebab bakteri gram positif berwarna ungu. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal. Sedangkan bakteri gram negatif yaitu dinding selnya lebih tipis dan banyak mengandung lipid daripada bakteri gram positif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Pengecatan gram sangat penting digunakan untuk mewarnai bakteri-bakteri yang sedang mengalami petumbuhan (Madigan, 2003). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteribakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Lay, 2004). Ukuran sel bakteri sangatlah bervariasi. Ukuran sel bakteri lebih kecil daripada sel khamir dan sel kapang. Oleh karena itu untuk memperoleh bayangan benda yang jelas pada sel bakteri, pengukuran sel bakteri dilakukan dengna pembesaran yang kuat (1000x). Pengukuran

sel

bakteri

dilakukan

dengan

menggunakan

mikrometer okuler yang dimasukkan ke dalam lensa ikuler pada mikroskop..Dalam mengukur sel bakteri, skala mikrometer okuler terlebih dahulu ditera, karena ukuran mikrometer okuler pada pembesaran yang berada, tidak sama pada setiap mikroskop. Mikroskop yang ditera adalah mikroskop nomor 7 dengan lensa okuler nomor 6 dan lensa objektif nomor 6. Peneraan skala mikrometer okuler dilakukan dengan cara memasang

mikrometer okuler dalam lensa okuler mikroskop dan memasang mikrometer obyektif pada meja amatan. Skala mikrometer obyektif sudah terukur, yaitu skala = 10 μm. Tahap-tahap di atas adalah cara pengkalibrasian antara mikrometer okuler dan mikrometer obyektif agar dapat menentukan ukuran sel bakteri yang sebenarnya. Dari pengamatan yang telah dilakukan, diapatkan hasil kalibrasi sebesar 1,6 μm. Lalu dari angka kalibrasi tersebut diketahui bahwa bakteri A berbentuk kokkus dan koloni 2 berbentuk bassil. Hasil pengukuran diameter bakteri A yang sebenarnya adalah 2 μm sedangkan hasil pengukuran diameter bakteri B yang sebenarnya adalah 1,6 μm dengan panjang bakteri 12,8 μm. Hasil pengukuran tersebut sesuai dengan pernyataan Tarigan (1988) yang menyebutkan bahwa ukuran diameter bakteria yang berbentuk kokus berkisar antara 0,4-2 μm dan juga sesuai dengan pernyataan Campbel (2009) bahwa umumnya prokariot merupakan makhluk hidup uniseluler yang memiliki diameter 0.5–5 μm. Menurut Dwidjoseputro (1989), basil ada yang lebarnya antara 0.2 sampai 2.0 µ, sedang panjangnya ada yang 1 sampai 15 µ. J. KESIMPULAN Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang merupakan salah satu cara yang paling utama. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Hasil identifikasi didapatkan bahwa bakteri yang berbentuk coccus adalah bakteri gram negative karena berwarna merah dan bakteri berbentuk basil adalah bakteri positif karena berwarna ungu. Hasil pengukuran dari bakteri coccus adalah D = 2µ, serta bakteri basil adalah P = 12,8 µ dengan D = 1,6 µ.

K. DAFTAR RUJUKAN Dwidjoseputro, D. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan. Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga. Lay, Bibiana.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali. Lay, B.W, 2004. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada : Jakarta. Madigan, M.T, 2003. Brock Biology of Microorganism. Pearson Education: inc. United State of America. Neil A. Campbell, Jane B. Reece. 2009. Biology 8th Edition. San Francisco: Pearson Benjamin Cummings. Razali, U., 2007, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD. Sutedjo, M., 2003, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta. Tarigan, Jeneng. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Tim Pengajar Mikrobiologi. 2018. Panduan Praktikum Mikrobiologi. Malang : UM. Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press. Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

L. LAMPIRAN