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Pruebas de germinación en semillas de Lulo (Solanum quitoense) Carolina Ordoñez, Elizabeth Ortega, Jennifer Quiñonez Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Nariño entregado 5 de abril de 2016 Resumen Se realizó varias pruebas sobre germinación de semillas de Lulo (Solanum quitoense) para determinar el potencial de germinación de estas semillas además de determinar el efecto de varios factores físicos y químicos sobre su germinación, se realizaron pruebas de viabilidad usando el método del tetrazolio, para teñir las partes vivas de la semillas donde se obtuvo un porcentaje de viabilidad aproximadamente del 90%, pruebas de germinación en cámara de germinación que consistieron en cajas Petri con papel absorbente y agua puestas en obscuridad donde se obtuvo un 18% de germinación, prueba de vigor donde se obtuvo un 73% de plántulas, se determinó el efecto de la escarificación química con ácido sulfúrico sobre el porcentaje de germinación en semillas tratadas a diferentes concentraciones y tiempos de exposición donde se obtuvo un mayor porcentaje de germinación utilizando H2SO4 al 5% durante 1minuto, por último se determinó el efecto de la temperatura y la luz sobre la germinación de las semillas de lulo. Palabras clave: germinación, viabilidad, vigor, escarificación, luz, temperatura. Introducción. La semilla es el principal órgano reproductivo de la gran mayoría de las plantas superiores terrestres y acuáticas, esta desempeña una función fundamental en la renovación, persistencia y dispersión de las poblaciones de plantas, regeneración de los bosques y sucesión ecológica. En la naturaleza, la semilla es una fuente de alimento básico para muchos animales. También, mediante la producción agrícola, la semilla es esencial para el ser humano, cuyo alimento principal está constituido por semillas, directa o indirectamente, que sirven también de alimento para varios animales domésticos. Las semillas pueden almacenarse vivas por largos períodos, asegurándose así la preservación de especies y variedades de plantas valiosas (Doria, J. 2010) Las semillas están formadas por el embrión, que es el producto de la fusión entre el óvulo con el núcleo espermático. El endospermo que es la fuente nutritiva del embrión para el desarrollo y el crecimiento de la plántula. La testa de la semilla formada externamente por los integumentos que representan los tejidos maternos del óvulo. La germinación de las semillas inicia con la absorción de agua por imbibición con el fin de rehidratar la semilla y la ruptura final de la testa. Simultáneamente el inicio de la actividad enzimática y del metabolismo respiratorio, translocación y asimilación de las reservas alimentarias en las regiones en crecimiento del embrión, y el crecimiento y la división celular que provoca la emergencia de la radícula y posteriormente de la plúmula (Martínez, 2011). Para que el proceso de germinación de las semillas se de es necesario que se den una serie de condiciones ambientales favorables como son; un sustrato húmedo, suficiente disponibilidad de oxígeno que permita respiración aeróbica y una temperatura adecuada para los distintos procesos metabólicos y el desarrollo de la plántula. La absorción de agua por parte de la semilla desencadena una secuencia de cambios metabólicos, que incluyen la respiración, la síntesis proteica y la movilización de reservas. a su vez la división y el alargamiento celular en el embrión provoca la ruptura de cubiertas seminales, que generalmente se producen por la emergencia de la radícula (Herrera, Alizaga, Guevara y Jiménez, 2006). .

El lulo (Solanum quitoense) es una planta que pertenece a la familia de las solanaceae, arbusto con 1 de alto aproximadamente con fruto redondo cubierto de tricomas con un alto contenido de vitamina C que presenta un diámetro de 4 a 6 cm, que crece semisilvestre que en los Andes entre los 1.200 y 2.100 msnm encontrándose, especialmente, en condiciones de sotobosque, en sitios frescos y sombreados, cercanos a corrientes de agua, con temperaturas entre 17° y 20° C. Se cultiva en países como Colombia, Ecuador, Panamá, Perú, República dominicana y Venezuela. Metodologia 1. PRUEBA DE VIABILIDAD Para establecer si el embrión está vivo se tomaron semillas de lulo, con cuidado se dividieron longitudinalmente para no dañar el embrión. Luego se colocaron en cajas Petri con una solución de 1,2,3 trifeniltetrazolium y fueron puestas a oscuridad por tres horas a temperatura de laboratorio (20°C) hasta que las semillas se tiñan de un color rojizo. Más adelante se las lavó para eliminar cualquier residuo de la sal. 2. CURVA DE IMBIBICIÓN: Para medir la permeabilidad de las semillas de lulo al agua, se seleccionaron 100 semillas, las cuales se dividieron en 4 grupos de 25 semillas cada uno, se introdujeron en una probeta para medir su volumen y se hizo un registro del peso fresco; a los dos primeros grupos se le agregó el doble de agua y los dos últimos grupo se les agregó el triple de agua según su volumen. Se realizó una medición cada 20 minutos hasta que las medidas se estabilizaron y por último se realizó una curva de imbibición teniendo en cuenta las variables: Peso (gr) vs Tiempo (horas) de imbibición de las semillas de agua. 3. PORCENTAJE DE GERMINACIÓN: En dos cajas pretri se colocaron 2 papeles filtro humedecido. En cada caja fueron colocadas 25 semillas de lulo. Se cubrieron con papel aluminio para crear un ambiente de oscuridad y se dejaron a temperatura ambiente. 4. PRUEBA DE VIGOR Para determinar la capacidad de la semilla de emerger una planta, se emplearon 50 semillas de lulo las cuales se sembraron en un contenedor con una mezcla de tierra (50%) y arena (50%). Se realizó un constante riego con agua. Por último se revisó con frecuencia el número de plantas que emergían a través del tiempo. 5. ESCARIFICACIÓN QUÍMICA SOBRE LA GERMINACIÓN En este ensayo se utilizaron 100 semillas de lulo. 25 semillas fueron sometidas a H2SO4 al 5% durante un minuto, 25 semillas fueron sometidas a H2SO4 al 5% durante dos minutos, 25 semillas fueron sometidas a H2SO4 al 10% durante un minuto y 25 semillas fueron sometidas a H2SO4 al 10% durante dos minutos. Posteriormente se lavaron hasta eliminar completamente el ácido, se sembraron en sustrato húmedo de suelo con arena, se realizó riego y monitoreo por 1 mes. 6. EFECTO DE TEMPERATURA Para establecer el efecto de la temperatura sobre el porcentaje de la germinación se utilizaron 50 semillas, estas se colocaron en dos cámaras húmedas (25 semillas de lulo en cada una). Luego se le colocó papel aluminio y se las dejo a una temperatura de 4ºC.

7. EFECTO DE TRATAMIENTO CON AGUA CALIENTE SOBRE LA GERMINACIÓN. Se utilizaron 100 semillas de lulo de las cuales 50 fueron inmersas por 5 segundos en agua hirviendo; mientras que las otras 50 fueron inmersas en agua hirviendo por 50 segundos. 8. EFECTO DE LUZ SOBRE LA GERMINACIÓN Se trató 150 semillas de lulo con diferentes tipos de luz para determinar la germinación. Se sembraron 50 en una caja una con luz natural, 50 con luz roja (papel celofán rojo) y 50 en oscuridad. Con los datos obtenidos se determinó el porcentaje de germinación. Resultados y discusión 1. Curva de imbibición Para esta prueba se tomó 4 lotes de 25 semillas de lulo (Solanum quitoense) cada uno para un total de 100 semillas, se obtuvo los siguientes resultados: Tabla 1. Resultados de la imbibición de semillas de lulo (Solanum quitoense) Fecha Tiempo Vol. 4 ml Vol. 4 ml Promedio Vol. 6 Vol. 6 ml (Horas) Lote 1 Lote 2 lote 1 y 2 ml Lote 4 Lote 3 23/02/16 Peso inicial 0,0672 0.0668 0,067 0.0701 0.0596 1 0.0713 0.0715 0,0714 0.0741 0.0631 2 0.0910 0.0913 0,09115 0.0914 0.0778 3 0.1085 0.1089 0,1087 0.1104 0.0939 4 0.1454 0.1459 0,14565 0.1507 0.1281 5 0.2079 0.2087 0,2083 0.2204 0.1873 6 0.3219 0.3231 0,3225 0.3458 0.2939 10 1.9829 1.9907 1,9868 2.0015 1.9231 24/02/16 24 4.7820 4.8008 4,7914 4.8826 4.6913

Promedio lote 3 y 4 0,06485 0,0686 0,0846 0,10215 0,1394 0,20385 0,31985 1,9623 4,78695

Curva de imbibicion 6

peso en gramos

5 4 3

Series1

2 1 0 0

1

2

3

4

5

6

10

24

Horas de Imbibicion Figura 1. Curva de imbibición de semillas de Lulo (Solanum quitoense) en 4 ml de agua

Curva de Imbibicion 6

peso en gramos

5

4 3 Series1

2 1 0 0

1

2

3

4

5

6

10

24

Horas de Imbibicion Figura 2. Curva de imbibición de semillas de Lulo (Solanum quitoense) en 6 ml de agua Como se puede observar en las curvas de imbibición en agua de las semillas de lulo (Solanum quitoense), el peso de las semillas aumenta a medida que pasa el tiempo, esto se debe a que el proceso de imbibición con el cual inicia la germinación de la semilla, consiste en la rápida absorción de agua por parte de la semilla lo que hace que esta se hinche y aumente su peso y volumen a medida que pasa el tiempo, el proceso de imbibición consta de 3 fases; la fase 1 es el incremento rápido en la absorción de agua , esto se da debido a las diferencias entre el potencial hídrico de la semilla y la solución, en el cual se moviliza el agua hacia donde hay menos agua que en este caso será a la semilla, esto se observa en la gráfica desde la hora 0 hasta la hora 5 en donde se observa un incremento rápido y continuo en el peso de la semilla, la fase 2 de estabilización y movilización de nutrientes, en esta fase se reactivan las proteínas necesarias para activar el metabolismo de las semillas y para el posterior desarrollo de la semilla, por lo tanto hay un cese de la absorción de agua y una estabilidad en el peso de las semillas, esto se observa en la gráfica entre la hora 5 y 6 de la imbibición por último la fase 3, la fase de emergencia del eje embrionario por lo cual se exige una mayor presión de turgencia y hay una nueva absorción de agua para suplir esta necesidad, este comportamiento se observa en el grafico entre las horas 6 y 24 de imbibición 2. Prueba de viabilidad Para realizar esta prueba se tomó 2 lotes de 25 semillas cada uno, en cada una de las semillas se realizó un corte longitudinal de manera que quedara expuesto el embrión de la semilla para que al agregar la solución de 2, 3,5 trifenil tetrazolium, se observara si el embrión se teñía de rojo o no, para determinar si la semilla es viable o no. Tabla 2. Resultados prueba de viabilidad en semillas de lulo (Solanum quitoense) Semillas Semillas Semillas no % de viabilidad totales viables viables Lote 1 25 20 5 80% Lote 2 25 22 3 88%

25

numero de semillas

20

15 lote 1

lote 2

10

5

0 1

2

Figura 3. Prueba de viabilidad en semillas de lulo (Solanum quitoense) La prueba de viabilidad consiste principalmente en la solución de 2,3,5-trifenil tetrazolio, este se utiliza como indicador de varios procesos de reducción que ocurre en las células vivas de tejidos, el principio de este método consiste en las reacciones de óxido-reducción que ocurren en los tejidos vivos en la cual participan las enzimas deshidrogenasas, en este proceso se liberan protones de hidrogeno los que causan que la sal se tetrazolio se reduzca a formazan, esta es una sustancia química de color rojiza por lo cual los tejidos vivos donde ocurren las reacciones dichas anteriormente se pintan de color rojizo y las zonas muertas no se pintan. (Douglas, 1991) Durante la evaluación de la viabilidad de semillas hay que tener en cuenta principalmente la homogeneidad del color rojizo y cuáles son las partes de las semillas que se tiñen de rojo, para determinar la viabilidad real y no apresurar a un criterio erróneo. Como se observa en la gráfica 3, los lotes 1 y 2 cada uno con 25 semillas de lulo (Solanum quitoense), el número de semillas viables es muy alto en comparación de las semillas no viables que fueron muy pocas, el porcentaje de viabilidad corresponde al 80% y 88% respectivamente lo que es un porcentaje de viabilidad muy alto que nos dice que las semillas tiene una alta capacidad de germinación 3. Porcentaje de germinación Para esta prueba se tomaron 2 lotes de 25 semillas cada uno, y se colocaron en las cámaras germinación en oscuridad, se tomó resultados cada semana, los resultados tomados se encuentran a continuación: Tabla 3. Resultados de la prueba de germinación en semillas de lulo (Solanum quitoense) Fecha Número de Total de Semillas % de días semillas germinadas germinación 01/03/2016 7 50 0 0% 08/03/2016 14 50 0 0% 15/03/2016 21 50 0 0% 22/03/2016 28 50 3 6% 29/03/2016 35 50 6 12%

100% 90%

% de germinacion

80% 70% 60% 50% Series1

40% 30% 20% 10% 0% 7

14

21

28

35

dias de germinación

Figura 4. Porcentaje de germinación de semillas de lulo (Solanum quitoense) de acuerdo a los días de germinación Como se puede observar en la gráfica de germinación de semillas de lulo, estas presenta una baja capacidad de germinación ya que solo germinaron 6 semillas de las 50 semillas colocadas para la prueba, lo que corresponde a un 12% en la tasa de germinación, estos resultados no concuerdan con los resultados de viabilidad donde se obtuvieron porcentajes de aproximadamente del 90% del capacidad germinativa de la semilla, esto puede deberse a diversos factores pero el más influyente es la dormancia y latencia que presentan las semillas de lulo (Cárdenas W et. al 2004). 4.

Prueba de vigor

Para realizar esta prueba se tomó 100 semillas de lulo (Solanum quitoense), y se sembraron en suelo de tierra más arena, se contabilizo el número de plántulas cada semana, se obtuvieron los siguientes resultados: Tabla 4. Resultados de la prueba de vigor en semillas de lulo (Solanum quitoense) Numero Numero de % de Fecha de días plántulas germinación 01/03/2016 7 0 0% 08/03/2016 14 0 0% 15/03/2016 21 10 10% 22/03/2016 28 40 40% 29/03/2016 35 23 23% % Tota germinación 73 73% plántulas total

porcentaje de germinacion

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 7

14

21

28

35

Dias de dias

Figura 5. Prueba de vigor en semillas de Lulo (Solanum quitoense) La prueba de vigor en semillas es un método mediante el cual es posible seleccionar la semilla según sus diferentes niveles de vigor, el vigor es la suma de aquellas propiedades de la semilla que determinan el nivel de actividad potencial y el comportamiento de la semilla durante la germinación y la emergencia de las plántulas (International Seed Testing Association, 1995), como se observa en el grafico hubo mayor número de plántulas a los 28 días después de sembradas las semillas, se obtuvo un porcentaje de plántulas del 73% lo que significa que las semillas tienen una buena capacidad de germinación como ya se había determinado con la prueba de viabilidad de semillas, siempre y cuando haya condiciones adecuadas para que esto suceda por lo cual en la prueba de % de germinación no se obtuvo buenos resultados porque las semillas de Lulo inducen en dormancia primaria y entran en un periodo de latencia cuando las condiciones no son las adecuadas para su germinación. 5.

Efecto de la escarificación química sobre la germinación de la semillas

Para realizar esta prueba se tomaron 4 lotes de 40 semillas cada uno, el lote 1 de semillas se trató con ácido sulfúrico (H2SO4) al 5% durante 2 minutos, el lote 2 se trató con ácido sulfúrico (H2SO4) al 5% durante 1minuto, el lote 3 se trató con ácido sulfúrico (H2SO4) al 10% durante 1 minuto y el lote 4 se trató con ácido sulfúrico (H2SO4) al 10% durante 2 minutos. Los resultados se presentan a continuación: Tabla 5. Resultados prueba del efecto de escarificación química en semillas de lulo (Solanum quitoense) Semillas germinadas Fecha Numero Semillas H2SO4 10% H2SO4 10% H2SO4 5% H2SO4 5% de días totales x 1 min x 2 min x 1 min x 2 min (tratamiento (tratamiento (tratamiento (tratamiento 1) 2) 3) 4) 01/03/2016 7 40 0 0 0 0 08/03/2016 14 40 5 5 2 0 15/03/2016 21 40 22 16 11 15 22/03/2016 28 40 7 7 14 10 29/03/2016 35 40 7 5 11 8 Total semillas germinadas 37 33 38 38

Tabla 6. Porcentaje de germinación de semillas de lulo (Solanum quitoense) sometidas a escarificación química % de germinación Fecha Número Semillas H2SO4 10% H2SO4 10% H2SO4 5% H2SO4 5% de días totales x 1 min x 2 min x 1 min x 2 min (tratamiento 1) (tratamiento (tratamiento (tratamiento 4) 2) 3) 01/03/2016 7 40 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 08/03/2016 14 40 2,5% 12,5% 5,0% 0,0% 15/03/2016 21 40 55,0% 40,0% 27,5% 37,5% 22/03/2016 28 40 17,5% 17,5% 35,0% 25,0% 29/03/2016 35 40 17,5% 12,5% 27,5% 20,0% Porcentaje total semillas germinadas 92,5% 82,5% 95,0% 82,5%

60.0%

porcentaje de germinacion

50.0% 40.0% tratamiento 1

30.0%

tratamiento 2 tratamiento 3

20.0%

tratamiento 4 10.0% 0.0% 7

14

21

28

35

numero de dias

Figura 6. Efecto de la escarificación química con H2SO4 a diferentes concentraciones y tiempos en el porcentaje de germinación de semillas de lulo (Solanum quitoense)

porcentaje de germinacion

100.0% 90.0% 80.0% 70.0% 60.0% 50.0% 40.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0% 1

2 3 tratamientos

4

Figura 7. Porcentaje de germinación total de semillas escarificadas con diferentes tratamientos de acido sulfúrico Como se puede observar en las gráfica la escarificación química con ácido sulfúrico tiene efectos positivos sobre la germinación de las semillas, siendo mayor el porcentaje de germinación en las semillas escarificadas con ácido sulfúrico al 5% por 1 minuto, esto es debido a que el ácido sulfúrico quema las paredes de la semilla permitiendo que haya un rápido intercambio gaseoso y de nutrientes lo que acelera la germinación de las semillas ya que no necesitan de mucho tiempo en agua para debilitar la testa ya que e acido se encarga de esto, hay que tener cuidado con el tiempo y la concentración de ácido que se utilice ya que este puede dañar el embrión de la semilla y causar su muerte. 6. Efecto de la temperatura en la germinacion de semillas de Lulo (Solanum quitoense) Para esta prueba se tomó 3 lotes de 25 semillas cada uno, el lote 1 las semillas se pusieron en cámara de germinación a temperatura ambiente (control), el lote 2 se expuso las semillas a calentamiento durante 50 segundos y el lote 3 se colocó en cámara de germinación a 4°C, se tomó datos cada semana. Tabla 7. Resultados efecto de la temperatura en semillas de lulo (Solanum quitoense) semillasgerminadas Número Semillas T° Calentamient Fecha 4°C de días totales ambiente o x 50 seg. 01/03/2016 7 25 0 0 0 08/03/2016 14 25 2 0 0 15/03/2016 21 25 8 0 0 22/03/2016 28 25 7 0 0 29/03/2016 35 25 4 0 0 En esta prueba se obtuvieron 21 semillas germinadas a los 35 días después del inicio de la prueba, en temperatura ambiente, se concluye que la temperatura es muy importante en la germinación de semillas de lulo ya que si se expone a temperaturas muy bajas la semilla entra dormancia y periodo de

latencia y las semillas al ser expuesta a calentamiento daña agresivamente el embrión y por lo tanto las semillas no germinan. 7. Efecto de la luz en la germinación de semillas de lulo (Solanum quitoense) Para esta prueba se tomó 3 lotes de 25 semillas cada uno los cuales fueron expuestos a luz norma, obscuridad y luz roja Tabla 8. Resultados del efecto de la luz en la germinación de semillas de lulo (Solanum quitoense) Semillas germinadas Número Semillas Luz normal Obscuridad Luz roja Fecha de días totales 01/03/2016 7 25 3 0 7 08/03/2016 14 25 8 0 8 15/03/2016 21 25 5 0 5 22/03/2016 28 25 3 0 1 29/03/2016 35 25 3 0 1 Total semillas germinadas 22 0 22

9

semillas germindas

8 7 6 5

luz normal

4

obscuridad

3

luz roja

2 1 0 7

14

21

28

35

numero de dias

Figura 8. semillas germinadas en diferentes tipos de luz Como se observa en el grafico el tipo de luz es un factor determinante en la germinación de semillas de Lulo, siendo la falta luz u obscuridad un factor limitante en la germinación de las semillas, ya que sin luz las semillas no germinan como se ha podido observar también en las pruebas anteriores realizadas en obscuridad, la luz roja apoya en el inicio de la germinación, este tipo de luz hace que la dormancia de la semilla termine y se active el proceso de germinación es decir que estas semillas empezaran su proceso de germinación más rápido que las semillas expuestas luz normal ( Campbell N, Reece J. 2007).

Conclusiones El proceso de germinación de semillas consiste de varios pasos, el primero es la toma de agua por parte de la semilla para activar su metabolismo e iniciar el proceso de germinación a esta fase se le conoce como imbibición, y es en donde la semilla absorbe tanta agua como sea posible para activar su metabolismo para permitir el paso de nutrientes hacia el embrión de la semilla y finalmente para romper la testa de la semilla y permitir la emergencia del eje embrionario ya sea la radícula o la plúmula, en este proceso se necesita que haya una buena disposición de agua y que las condiciones de germinación sean las optimas Varios factores pueden influir en la capacidad germinativa de las semillas, como por ejemplo la luz, la temperatura, la disponibilidad de nutrientes, cuando estas condiciones no son las apropiadas las semillas inducirán el proceso de dormancia entrando en un periodo de latencia hasta que las condiciones sean las óptimas para su germinación. Hay varios métodos para interrumpir la dormancia en las semillas uno de ellos es la escarificación con sustancias químicas como el ácido sulfúrico esto para debilitar la testa que es la barrera entre el medio y el embrión de la semilla, esto permite que la semilla inicie rápidamente el proceso de imbibición y como su testa está debilitada el eje embrionario mayor dificultad para emerger. Hay que tener mucho cuidado sobre cómo se realiza la escarificación química ya que las sustancias químicas en concentraciones muy elevadas o exposiciones de las semillas muy prolongadas puede causar la muerte del embrión y por ende la muerte de la semilla

Bibliografía Doria, J. (2010). Generalidades sobre las semillas: su producción, conservación y almacenamiento. Reserva Científica del departamento de Fitotecnia, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, gaveta postal 1, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Herrera, J., Alizaga, R., Guevara, E. y Jiménez, V. 2006. Germinación y crecimiento de la planta. Editorial universidad de Costa Rica. Costa Rica. Martínez F. (2011). Curso fisiología vegetal, La semilla. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería. Santiago de Cali Azcón Bieto J., Talon M. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Mc Graw Hill, Interamericana. Nadrid. 1993 Cronquist A. 1981. An integrated system of classification of flowering plants. Columbia University Press, N Y, EEUU, pag 1262.