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Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas

INFORME DE LABORATORIO N°6 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY LABORATORY REPORT No. 6 PROTEIN QUANTIFICATION BY THE METHOD OF LOWRY Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá D.C. . RESUMEN

ABSTRACT

La práctica de cuantificación de proteínas por el Método de Lowry, se lleva a cabo bajo diferentes procesos guiados por la docente y la monitora, involucrando en cada uno de ellos reactivos y sustancias para estudiar, en esta práctica se trabajó con tres tipos de pasta: corbata, cabello de ángel y tornillo, además de una dilución de una muestra de uno de éstos.

The practical quantitation of proteins by Lowry's method is carried out under different processes guided by the teacher and instructor, involving in each reagents and to study, in practice we worked with three kinds of pasta: tie, pumpkin and screw, along with a dilution of a sample of one of these.

Se realizaron pruebas con las soluciones de pasta las cuales fueron obtenidas mediante cocción, observando y registrando cada reacción para cada una de estas. También se midieron mediante el espectrofotómetro las absorbancias tanto delas muestras patrón que servirían como guía, como de las 4 muestras de las pastas. Para el desarrollo del laboratorio se utilizaron reactivos como el de Cobre y el de Folin, además de un factor externo como la temperatura, en la cocción de las pastas, siendo estas pruebas en sus totalidades tanto cualitativas como cuantitativas. PALABRAS CLAVE: Proteínas, Método de Lowry, Pasta, Absorbancia, Reactivos.

Tests were conducted with solutions pasta which were obtained by cooking, watching and recording every reaction to each of these. They were also measured by spectrophotometer absorbance delas both standard samples which serve as guide for the 4 samples as pasta. Development laboratory reagents such as copper and Folin were used in addition to an external factor such as temperature, on the pasta cooking, these tests being in their entireties both qualitative and quantitative. KEYWORDS: Proteins, Lowry method, Pasta, Absorbance, Reagents.

INTRODUCCIÓN Durante la práctica realizada el día 29 de septiembre de 2015, se evaluó la concentración de proteínas en diferentes

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas pastas comerciales bajo el método de con los átomos de nitrógeno de los enlaces Lowry. Inicialmente se cocina la pasta, peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína luego se realizan 6 muestras, con el agua tienen un color azul claro. Además, usada en la cocción de esta, agregando a provocan el desdoblamiento de la estructura cada una reactivo de cobre y reactivo de tridimensional de la proteína, exponiéndose Folin Ciocalteau en diferentes los residuos fenólicos de tirosina que van a proporciones, se midió la concentración en participar en la segunda etapa de la el espectrofotómetro a una longitud de onda reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con de 650nm. tartrato. El método de Lowry es un método 2) La reducción, también en medio básico, colorimétrico de valoración cuantitativa de del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los las proteínas. A la muestra se añade un grupos fenólicos de los residuos de tirosina, reactivo que forma un complejo coloreado presentes en la mayoría de las proteínas, con las proteínas, siendo la intensidad de actuando el cobre como catalizador. El color proporcional a la concentración de principal constituyente del reactivo de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= Folin-Ciocalteau es el ácido ε.l.c. fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, (Roca y Rodriguez, 2003) que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul Este método consta de dos etapas: intenso. (Roca y Rodriguez, 2003) 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Determinar la concentración de proteínas en una muestra, en este caso en una de pasta, a través del método de Lowry. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Elaboración de una curva de calibración con el fin de cuantificar los resultados obtenidos. Comparar la concentración de proteínas en diferentes tipos y marcas de pastas. Imagen 1. Reacción entre la proteína y los reactivos (Roca y Rodriguez, 2003)

Comprender los procesos y fundamentos del método de Lowry. JUSTIFICACÓN

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas La realización de esta práctica es Existen diferentes métodos para la importante ya que nos permite comprender cuantificación de proteínas. Muchos de uno de los procedimientos en la estos métodos se basan en: a) la propiedad determinación de la concentración de intrínseca de las proteínas para absorber luz proteínas en una muestra biológica; siendo en el UV, b) para la formación de derivados esta una técnica de rutina básica cuando se químicos, o c) la capacidad que tienen las aborda un esquema de purificación de una proteínas de unir ciertos colorantes. En la proteína concreta, cuando se quiere conocer Tabla I se recogen los métodos más usados la actividad específica de una preparación así como sus respectivas sensibilidades. enzimática, para el diagnóstico de Cada uno de estos métodos tiene sus enfermedades, así como para otros muchos ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II. (Reyes y Galvan, propósitos. 2010) MARCO TEORICO

(Reyes y Galvan, 2010)

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(Reyes y Galvan, 2010) El complejo proteínaCu2+ se hace reaccionar con el reactivo de FolinCiocalteus, dando una coloración azul, con un máximo de absorción a 650 nm. Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+. Las características del método son:

La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína. Es más sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml. La modificación de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml. Presenta

muchas

interferencias.

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Imagen 2. Esquema de la reacción de Lowry El método de Lowry tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de proteína; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante varia entre las distintas proteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el método con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina. (Serrano y otros 2009) La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+ , en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico. (Serrano y otros 2009) 2.-Reacción Ciocalteau

con el para

reactivo de Folinfenoles (ácido

(Reyes y Galvan, 2010)

fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada. Dado que este método da resultados variables se requiere una curva de calibración que se hace a partir de seroalbúmina bovina. En la presente práctica haremos esta curva de calibración, practicando la reacción de Lowry y aprendiendo el uso del espectrofotómetro. (Serrano y otros 2009)

MATERIALES Y REACTICVOS MATERIALES Vaso de precipitado Vidrio de reloj Agitador de vidrio Balón aforado Pipeta Pipeteador Espectotrofometro

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REACTIVOS Pasta Agua Agua Reactivo de Reactivo de folin ciocalteau

destilada cobre

RESULTADOS En nuestra práctica de laboratorio de Cuantificación de proteínas, utilizamos 3 muestras, tres tipos de pasta (M1: corbata, M2: cabello de ángel y M3: tornillo). Para comenzar la práctica empezamos a preparar la pasta:

Imagen 4. Cocción de la pasta, tomada el 29 de Septiembre del 2015. Después de esto, se filtraron hacia un nuevo beacker cada una y a continuación se pasaron a los balones aforados.

Se pesó 10g de cada pasta

Imagen 5. Muestras con las soluciones de la cocción de cada una de las pastas, tomada el 29 de Septiembre del 2015. Imagen 3. Peso corbatas, tomada el 29 de Septiembre del 2015. Se introdujeron cada una en un beacker junto a 200 ml de agua y se dejaron durante 20 minutos al calor.

Posteriormente se procedió a añadir 0,1 ml de nuestras muestras problema en 3 tubos de ensayo, y seguido, 1ml del Reactivo de Cobre a cada una de ellas:

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas (15min.), éste color se fue haciendo cada vez más fuerte y oscuro.

Después de esto se realizó una cuarta dilución utilizando 1ml de una sola muestra y 1ml de agua destilada, luego se realizó el mismo procedimiento que antes, añadiéndole los reactivos y esperando los tiempos necesarios: Antes:

Después:

Imagen 6. Tubos de ensayo con las muestras después de aplicar el reactivo de cobre, tomada el 29 de Septiembre del 2015. Se puede observar que las muestras toman una coloración azul, la cual puede variar de una a otra. Se dejaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se les añadió 2ml del Reactivo de Folin; después de 15 minutos se procedió a realizar la toma de sus absorbancias:

Imagen 8. Tubo de ensayo antes de Imagen 9. Tubo de aplicársele el ensayo después de reactivo de Folin, aplicar el reactivo tomada el 29 de de Folin, tomada el Septiembre del 29 de Septiembre del 2015. 2015. Tabla 1. Cambios de la muestra diluida al aplicársele los reactivos. Al tener ya las cuatro muestras, pasamos a medir su absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650 nm:

Imagen 7. Tubos de ensayo después de aplicar el reactivo de Folin, tomada el 29 de Septiembre del 2015. Al añadir el Reactivo de Folin, las muestras se fueron tornando de un color verde claro, y a medida que fue transcurriendo el tiempo

Muestra Absorbancia 1,620 M1 (corbata) 0,383 M2 (cabello de ángel) 1,025 M3 (tornillo) 0,164 M4 (corbata diluido) Tabla 2. Absorbancia de las 4 muestras. Como parte de la práctica de laboratorio, se preparó una muestra blanco y tres muestras patrón con albúmina a concentraciones ya establecidas, luego realizaron los mismos

Absorbancia

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas ensayos con iguales cantidades de muestra y reactivos que en las pruebas anteriores; éstas Curva de Calibración Muestras Patrón muestras fueron realizadas por la monitora Conc. vs Abs. 0.9 previamente.

Imagen 10. Muestras patrón con albumina al aplicar el reactivo de Cobre, tomada el 29 de Septiembre del 2015.

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

y = 0.585x + 0.0764 R² = 0.9335

1.2 0.6

Linear (Absorbancia)

0.3

0

0.5 1 Concentración p/v

1.5

Grafica 1. Curva de calibración de las muestras patrón Concentración vs. Absorbancia con el cálculo de regresión lineal.

Absorbancia Imagen 11. Muestras patrón con albumina al aplicar el reactivo de Folin, tomada el 29 de Septiembre del 2015. A las muestras patrón también se les midieron sus absorbancias: Muestr a Patrón Blanco A B C Tabla 3.

Concentració Absorbanci n a p/v --0,3 0.292 0,6 0.520 1,2 0.722 Patrones de albumina y blanco.

1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Absorbancia Muestras

Grafica 2. Absorbancias de las muestras.

CÁLCULOS

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas 1,620 − 0,0764 Calcularemos la concentración de cada 𝑥= muestra realizada (4), mediante la ecuación de 0,585 la regresión lineal: 𝑥 = 2,63mg/ml Ecuación de regresión lineal: M2 (Cabello de ángel) > Absorbancia: 0,383 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 0,383 − 0,0764 𝑥= 0,585 y = 0,585x + 0,0764

Donde:

𝑥 = 0,52 mg/ml

y: Absorbancia de la muestra

M3 (Tornillo) > Absorbancia: 1,025

m: Pendiente de la recta

𝑥=

1,025 − 0,0764 0,585

x: Concentración de la muestra 𝑥 = 1,62 mg/ml b: Intersección en y o error en la medición. (UNAM, 2010). Teniendo en cuenta lo anterior, despejamos la concentración (x) de la ecuación: 𝑥=

𝑦−𝑏 𝑚

Ahora procedemos a calcular las concentraciones desconocidas de las 4 muestras preparadas: M1 (Corbata) > Absorbancia: 1,620

M4 (Corbata diluido) > Absorbancia: 0,164 𝑥=

0,164 − 0,0764 0,585

𝑥 = 0,15 mg/ml Ya que tenemos calculadas las concentraciones de las muestras problema, realizaremos una curva de calibración (Concentración vs. Absorbancia) de éstas y las muestras patrón, para comprobar con ello si la Ley de Beer se cumple.

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas % 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 Curva de Calibración Concentración 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 = 𝑥100% vs. Absorbancia 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 1.8

Absorbancia

1.6

y = 0.5866x + 0.076 R² = 0.9901

1.4 1.2

0,36𝑚𝑔 0,3𝑚𝑔 − 𝑚𝑙 𝑥100% % 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 𝑚𝑙 0,36𝑚𝑔/𝑚𝑙 %𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 16,6

1

Linear (Absorbancia)

0.8 0.6

ANÁLISIS DE RESULTADOS

0.4 0.2 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Concentración mg/ml

Grafica 3. Curva de calibración de todas las muestras Concentración vs. Absorbancia con el cálculo de regresión lineal. Para realizar un cálculo correcto del porcentaje de error de las concentraciones obtenidas experimentalmente para nuestras muestras patrón, realizaremos el ejemplo con una muestra de éstas: Calculamos la concentración teórica, mediante la ecuación de regresión lineal: 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏

y = 0,585x + 0,0764

Muestra patrón A > Absorbancia: 0,292 Concentración experimental: 0,3 mg/ml 𝑥=

0,292 − 0,0764 0,585

𝑥 = 0,36 mg/ml Procedemos a calcular el error porcentual mediante la fórmula:

Al realizar los experimentos con las muestras problema, pudimos observar cómo al agregar el Reactivo de Cobre se tornaban de un tono azul, y al agregar el Reactivo de Folin éste azul cambiaba a verde claro, que luego se tornaba más oscuro con el tiempo. Según Serrano y otros (2009), cuando hablamos del método de Lowry hacemos referencia al empleo del reactivo fenol-folinciocalteu como ocurrió en nuestro laboratorio, en este método se desatollan dos reacciones coloridas, la primera es desarrollar un color azul de poca intensidad con el cobre en medio alcalino; después se forma un color azul-verde con el reactivo mencionado, que contiene molibdato de sodio y tungstato de sodio en presencia de ácido fosfórico y clorhídrico, que reacciona con los aminoácidos aromáticos, fenilalanina y triptófano de la proteína. Este método permite determinar la concentración de proteína en rangos de 0.01-1 mg/ml.

La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas tartrato para evitar la precipitación. Es Como objetivo fundamental de la práctica, se esencialmente idéntica a la reacción del realizaron los cálculos de la Concentración de Biuret, formándose un complejo de las muestras obtenidas de las pastas, haciendo coordinación entre el cobre y el nitrógeno uso de la ecuación de regresión lineal (y=mx+b) obtenida mediante la gráfica de la peptídico. Curva de calibración (concentración vs. 2.-Reacción con el reactivo de Folinabsorbancia) de las muestras patrón, donde Ciocalteau para fenoles (ácido partíamos de los datos conocidos como la fosfomolibdotungstico), que se reduce por absorbancia de la muestra, y gracias a la medio de los grupos fenol (y en menor medida ecuación: la pendiente (0,585) y el error en la imidazol e indol) presentes en la proteína a un medición (0,0764). complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, Esto nos fue de gran ayuda para realizar una cuya composición es desconocida, presenta Curva de Calibración de Concentración vs. dos máximos de absorción a las longitudes de Absorbancia, tanto de las muestras problema onda de 560 y 680 nm. (Arellano y Vásquez, como de las patrón y también para comprobar, mediante la Ley de Beer, que “La s.f.) absorbancia de una solución es directamente Refiriéndonos ahora a los colores verde claro proporcional a la concentración y a la y oscuro que observamos en las muestras longitud del paso de la luz”. (Skoog y West, obtenidas de las pastas al añadirles el último 1993). reactivo, según Romero (s.f.), “el matiz del color depende del tipo de proteína y su Al representar gráficamente la Curva de intensidad depende del contenido de proteína Calibración de los valores de la absorbancia presente. Estas reacciones, en las que el color obtenida experimentalmente, en función de la formado es proporcional a la cantidad de concentración de las soluciones diluidas, se sustancia se llaman reacciones obtuvo un comportamiento lineal, con un colorimétricas.” Por lo tanto esta variabilidad coeficiente de regresión lineal de 0,9901 muy de tonos se debe a que a mayor concentración cercano a la unidad, lo cual es acorde con la de proteínas, mayor intensidad de color tendrá. ley de Beer.

En cuanto a la formación de espuma que presentaron las muestras patrón de albúmina; según Álvarez y otros (1989) “la albúmina forma espuma por agitación, principalmente cuando se la ha mezclado con agua, enverdece los colores violetas e intensos, propiedad que debe a una pequeña cantidad de carbonato de sosa que contiene”

Las desviaciones de la linealidad se pueden deber a errores en la preparación de las soluciones, donde éstos afectan directamente la concentración de las muestras, afectando de manera significativa la tendencia de la curva de calibración. (Requena y Zúñiga, 2003). Para la prueba realizada con una de las muestras de solución de pasta, a la cual se le midió su absorbancia mediante el espectrofotómetro (0,164), además de calcular teóricamente su concentración (0,15mg/ml);

Informe de Laboratorio N°6 Cuantificación de Proteínas pudimos evidenciar con éstos dos datos que aumente, la absorbancia aumenta también; por como era de esperarse al ser la única muestra lo tanto presentan una relación lineal. diluida en 1ml de agua destilada, su A mayor cantidad de proteína, mayor cantidad concentración iba a ser menor que las demás, de producto de reacción y por lo tanto, mayor y como ésta es directamente proporcional a la intensidad de color. absorbancia, también ésta última sería menor.

La precisión de las medidas de absorbancia depende mucho del uso y del mantenimiento que se haga de las celdas. Las huellas dactilares, la grasa u otras señales sobre las paredes de las celdas alteraran notablemente las características de transmisión. (Requena y Zúñiga, 2003).

Mediante la ecuación de regresión lineal es posible calcular la concentración de una solución de una sustancia conocida.

Finalmente, en cuanto al cálculo realizado del error porcentual, obtuvimos un valor de 16% el cual para el tema tratado no produjo unos resultados equivocados y tampoco fueron grandes las variaciones que produjo; pero aun así se debe mejorar las técnicas al momento de realizar este tipo de prácticas, ya sea al momento de la cocción, en la toma de muestras o al añadir los reactivos, todo esto puede afectar los resultados esperados.

Álvarez, F. y otros (1989). Nuevos elementos de química. España. Ed. Imprenta que Fue de Fuentenebro.

Con esto concluimos que se realizó una buena práctica y un buen trabajo, ya que los resultados obtenidos fueron en su mayoría óptimos, además de obtener unas concentraciones y absorbancias casi lineales, lo cual era lo esperado.

CONCLUSIONES: Se logró cumplir con los objetivos propuestos para el desarrollo de la práctica. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración, por tanto, siempre que la concentración de colorante o muestra se

BIBLIOGRAFÍA

Arellano, H. y Vásquez, R. (s.f.) Cuantificación de proteínas. [en línea]. México. Instituto de Biotecnología UNAM. [Fecha de consulta: 5 de Octubre del 2015]. Disponible en: http://www.smbb.com.mx/revista/Revi sta_1998_2/bitacora.pdf Requena & J. Zúñiga. (2003). Espectroscopía. Madrid, España. Ed. Pearson Pentice Hall. Reyes y Galvan. (2010). Métodos para la cuantificación de proteínas. [en línea]. México. [Fecha de consulta: 5 de Octubre del 2015]. Disponible en: http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS% 20PARA%20LA%20CUANTIFICAC I%C3%93N%20DE%20PROTE%C3 %8DNAS.pdf

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Roca P. y Rodríguez A. (2003). Bioquímica técnicas y métodos. México. Editorial Hélice. Romero, N. (s.f.). Métodos de análisis para la determinación de constituyentes nitrogenados en alimentos. [en línea]. México. FAO. [Fecha de consulta: 5 de Octubre del 2015]. Disponible en: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/ah833s /AH833S08.pdf Serrano, M., Ibáñez, J., Mainero, R y otros. (2009). Experimentos de química en microescala para nivel medio superior. México. Universidad Iberoamericana. Skoog, D. y West, D. (1993). Principios de Análisis instrumental. Madrid, España. Grupo editorial Mc Graw Hill/ Interamericana de España.