Laboratorio 5_accion Bacteriostaticas.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ACCIÓN BACTERIOSTÁTICA SELECTIVA DEL CRISTAL VIOLETA

LABORATORIO N° 5 DEL CURSO MICROBIOLOGÍA – SA323K

GUILLEN MANCHA, WILLIAM

DOCENTE: ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROS

Lima – Perú 2018

UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental

INDICE RESUMEN................................................................................................................ 4 SUMARY .................................................................................................................. 4 I.

INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 5

II.

OBJETIVO ......................................................................................................... 6

III.

MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 6

1.

Conceptos Previos: ........................................................................................ 6

IV.

RESULTADOS ............................................................................................... 8

V.

DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................ 9

VI.

CONCLUSIONES: ......................................................................................... 9

VII.

RECOMENDACIONES: ............................................................................... 10

VIII.

CUESTIONARIO .......................................................................................... 10

IX.

FUENTES DE INFORMACIÓN: ................................................................... 11

X.

ANEXOS: ........................................................................................................ 11

XI.

APENDICE................................................................................................... 12

1.

Metodología ................................................................................................. 12

2.

PROCEDIMIENTO ....................................................................................... 12

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INDICE DE ILUSTRACIONES Ilustración 1.Imagen de las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas. ............................................................................................................... 11 Ilustración 2.Fotografías, tubos con agar nutritivo y placas Petri dividida en zona A y B. grupos 4. ............................................................................................................ 11

INDICE DE TABLAS Tabla 1.resultados de crecimiento de los grupos 1,2, 3,4, y 5. .................................. 8 Tabla 2.Resultados crecimiento teórico. ................................................................... 8 Tabla 3.Resultados de coloración gram de placa sin coloración de los grupos 1,2, 3,4 y 5....................................................................................................................... 8

INDICE DE FIGURAS Figura 1.Microorganismos:Izquierda. Escherichia coli..Derecha Bacillus subtilis. ..... 7

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RESUMEN En el presente laboratorio se determina el efecto de la acción bacteriostática selectiva del cristal violeta, este colorante inhibe el desarrollo de las bacterias especialmente de las bacterias gram positivas (Bacillus subtilis).El cristal violeta es un derivado del trifenilmetano que posee un excelente efecto bacteriostático.Los resultados fueron analizados con bacterias con muestras en 5 grupos de alumnos,en los grupos 1,2,3,4 y 5 en la dilución de concentracion 1:10000 predomino el crecimiento(+) para todos los grupos.En la concentracion 1:100000 crecimiento(+) , excepto en el grupo 2 en la colonia A sin crecimiento(-),en la concentración 1:1000000 hay crecimiento para las placas de todos los grupos, el colorante cristal violeta no tiene ningún efecto sobre los organismos y el crecimiento se lleva a cabo como si no hubiera colorante en el medio agar. SUMARY In the present laboratory the effect of the selective bacteriostatic action of crystal violet is determined, this dye inhibits the development of bacteria especially of gram positive bacteria (Bacillus subtilis). Crystal violet is a derivative of triphenylmethane which has an excellent bacteriostatic effect The results were analyzed with bacteria with samples in 5 groups of students, in groups 1,2,3,4 and 5 in the concentration dilution 1: 10,000 growth predominated (+) for all groups. In the concentration 1 : 100000 growth (+), except in group 2 in colony A without growth (-), in the concentration 1: 1000000 there is growth for the plates of all groups, the crystal violet dye has no effect on organisms and the growth is carried out as if there was no dye in the agar medium.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental I. INTRODUCCIÓN El cristal violeta es un colorante derivado del trifenilmetano,tiene la accion bacteriostática selectiva sobre los organismos gram positivos en diluciones que no tienen ningún efecto apreciable sobre el crecimiento de las bacterias gram negativas.En general la accion bacteriostática selectiva es semejante a la reacción de gram,aunque presenta unas cuantas excepciones resaltantes.Esto quiere decir que los microorganismos gram positivos son mas susecptibles a la accion de estos colorantes que las bacterias gram negativas.Se presenta las concentraciones en la metodología del laboratorio.Es importante en la aplicación en el campo de la medicina.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental II. OBJETIVO -

Observar y determinar el efecto de la acción bacteriostática selectiva del cristal de violeta de las bacterias: Escherichia coli y del Bacillus subtilis.

III. MARCO TEÓRICO 1. Conceptos Previos: Colorantes: Los colorantes se utilizan ampliamente en bacteriología para tinción y como indicadores. La incorporación de un colorante a un medio de cultivo con frecuencia lo torna selectivo. La acción bacteriostática de los colorantes se debe a la modificación del potencial de óxido-reducción del medio, lo que inhibe el desarrollo de los microorganismos. En general, son más activos contra bacterias gran positivas y algunos hongos. Los principales colorantes son los derivados dela acridina (proflavina), y los derivados deltrifenilmetano (verde brillante, cristal violeta).  Los derivados de la acridina interfieren en la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. Este se inserta entre dos bases sucesivas del ADN separándolas físicamente provocando errores en la duplicación del ADN.  Los derivados del trifenilmetano interfieren en la síntesis de la pared celular. Para lograr su objetivo bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámil péptido. Cristal violeta: El violeta cristal es un colorante básico bacteriostático potente perteneciente al grupo trifenilmetano, estos colorantes presentan una marcada acción bacteriostática selectiva sobre las bacterias gram positivas, en diluciones que aparentemente no afectan a las gram negativas. Esta propiedad se aprovecha mediante la incorporación de alguno de esos colorantes en medios de cultivo con el fin de facilitar el aislamiento de bacterias gram negativas.Otros colorantes usados con estos propósitos son4 fucsina básica, verde brillante,verde malaquita. Coloración Gram Bacterias Gram positivos Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram. Esta característica química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental organización bacteriana. Incluyen especies tanto móviles como inmóviles como la forma bacilo(Bacillus subtilis). Bacterias Gram negativas Se denominan bacterias granm negativas a aquellas que no se tiñen de azul ocuro o violeta por la tinción de Gram,estos se tiñen de un color rosado tenue.Estas presentan membranas lipídicas. Estas pierden el cristal violeta.Tenemos a la Escherichia coli. Escherichia coli: también conocida por la abreviación de su nombre, E. coli, es una bacteria gramnegativa con forma de bacilo de la familia de las enterobacterias que se encuentra en el tracto digestivo gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente .

Figura 1.Microorganismos:Izquierda. Escherichia coli..Derecha Bacillus subtilis. Fuente: Sagar Aryal.Biochemical Test of Escherichia coli (E. coli). Escherichia, Gram Negative Bacteria Recuperado de: https://biochemicaltest.com/biochemical-test-of-escherichia-coli-e-coli/ (extraido 0905-2018).

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental IV. RESULTADOS Datos del Grupo 01: Tabla 1.resultados de crecimiento de los grupos 1,2, 3,4, y 5. GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 CONCENTRACIÓN A B A B A B

GRUPO 4 A B

GRUPO 5 A B

1:10000

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

1:100000

+

+

-

+

+

+

+

+

+

*

1:1000000

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Sin + + colorante Nota. Fuente: Grupo 01, 02, 03,04 y 05. *No especifica (+) Hay crecimiento, (-) Sin crecimiento. Tabla 2.Resultados crecimiento teórico.

colorante

concentración

Cristal violeta

1:10000 1:100000 1:1000000 Sin colorante

Control

Escherichia coli (gram negativo) + + +

Bacillus subtilis (gram positivo) + +

*(+) Hay crecimiento, (-) Sin crecimiento. COLORACION GRAM GRUPOS N° 1 ( BAÑO FIA DE HOMBRES PRIMER PISO) N° 2 (Aula 171 vacía )

COLONIA “A”

COLONIA”B”

Gram(+) Estreptobacilos

Gram(+) Estreptobacilos

Gram(-) cocos

Gram(+) bacilos

N° 3 N° 4 N° 5 Tabla 3.Resultados de coloración gram de placa sin coloración de los grupos 1,2, 3,4 y 5. Nota. Fuente: Grupo 01,02,03,04 y 05.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental V. DISCUSION DE RESULTADOS  En la concentración 1:10000 el colorante cristal violeta debería inhibir el crecimiento tanto de la Escherichia coli(gram negativa),como del Bacillus subtilis(gram positiva),pero se observa crecimiento en todos los grupos.Puede ocurrir por una mal observación de cada grupo.Tambien por no seguir el procedimiento adecuado.  En la concentración 1:100000 hay crecimiento para las placas de todos los grupos, excepto en el grupo nro. 2 en la colonia A, sin crecimiento. Esto ocurre si las bacterias son de tinción gram positivas(Bacillus subtilis), por lo que inhibe su crecimiento.  En la concentración 1:1000000 hay crecimiento para las placas de todos los grupos, ocurre porque el colorante cristal violeta no tiene ningún efecto sobre los organismos y el crecimiento se lleva a cabo como si no hubiera colorante en el medio agar. VI. CONCLUSIONES:  Para el grupo N° 1,se observa que en la placa petri de las diluciones con colorante cristal violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 predomina el crecimiento(+), tanto en las zonas A y B.También se ve crecimiento en la placa sin colorante.  En el grupo N° 2,se observa que en la placa petri de las diluciones con colorante cristal violeta de concentración 1:10000 y 1:1000000 crecimiento(+), tanto en las zonas A y B.Mientras que en la concentración 1:100000 sin crecimiento(-) en la zona A pero si se observa en el sector B crecimiento(+).Se ve crecimiento en la placa sin colorante.  Para el grupo N° 3,se observa que en la placa de las diluciones con colorante cristal violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 hay crecimiento(+), tanto en las colonias A y B.También se ve crecimiento en la placa sin colorante.  En el grupo N° 4,se observa que en la placa de las diluciones con colorante cristal violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 ,crecimiento(+), tanto en las colonias A y B.También se ve crecimiento en la placa sin colorante.  Para el grupo N° 5, se observa que en la placa de las diluciones con colorante cristal

violeta

de

concentración

1:10000,1:100000,1:1000000

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predomina

UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental crecimiento (+), tanto en las colonias A y B,excepto en la concentracion 1:100000 zona B que no especifica. Se ve crecimiento en la placa sin colorante.

VII.

RECOMENDACIONES:



Seguir el procedimiento de manera ordenada.

 Concentrarse al momento de la observación para ver si hay crecimiento o no.  Tener una correcta manipulación de los instrumentos.  Reconocer una bacteria con la tinción gram positiva y negativa. VIII.

CUESTIONARIO

ACCIÓN BACTERIOSTÁTICA SELECTIVA DEL CRISTAL VIOLETA 1. ¿Qué es un Agente bacteriostático? Es aquél que tiene la propiedad de inhibir la multiplicación bacteriana, inhiben la tinción de las bacterias, la misma que se reanuda cuando se retira el agente. Algunos agentes tienen finalidad particular por medio de genes o los lesionan específicamente. 2. ¿Qué quiere decir una acción bacteriostática selectiva? La incorporación de un colorante a un medio de cultivo con frecuencia lo torna selectivo. La acción bacteriostática selectiva se debe a la modificación del potencial oxido-reducción del medio, lo que inhibe el desarrollo de los microorganismos .En general, son más activos con las bacterias gram positivas y algunos hongos. Los principales colorantes son los derivados de la acridina (proflavina) y los derivados del trifenilmetano (verde brillante y violeta cristal) (Negroni, 2009) 3. Aplicaciones Evitar el deterioro de los alimentos y evitar la contaminación tanto en procesos industriales que requieran cultivos puros como en laboratorios de diagnóstico o investigación. Además se ha difundido mucho el uso de agentes bacteriostáticos en la industria farmacéutica para la producción de antibiótico.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental IX. FUENTES DE INFORMACIÓN: M.NEGRONI.MICROBIOLOGIA

ESTOMATOLOGICA

Editorial

Médica

Panamericana S.A.Buenos Aires 2da.Edic.2009. (pág. 114-116). Sagar Aryal.Biochemical Test of Escherichia coli (E. coli). Escherichia, Gram Negative Bacteria Recuperado de: https://biochemicaltest.com/biochemical-test-of-escherichiacoli-e-coli/ (extraido 09-05-2018). Cristóbal Chaidez Quiroz.El Agua Embotellada y calidad bacteriológica.Octubre 2002(pág. 38-39) X. ANEXOS:

Ilustración 1.Imagen de las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas. Fuente: crecimiento microbiano.Diefrencias entre gram positivas y gram negativas.Recuperado de: https://es.slideshare.net/toons1233/capitulo-6-14297911 (Extraído 08-05-2018)

Ilustración 2.Fotografías, tubos con agar nutritivo y placas Petri dividida en zona A y B. grupos 4. Fuente: Propio

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental XI. APENDICE 1. Metodología

1mL

1mL

1mL 9mL de agua de dilución estéril

1:1000

1:10000

1:100000

1:1000000 Sin colorante

Cristal violeta

PLACAS PETRI ESTERILES

Invertir las placas e incubarlos a 37 ºC por 48 horas Fuente propia

TUBO CONTENIENDO AGAR NUTRITIVO FUNDIDO A 45 ºC

2. PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO: ACCIÓN BACTERIOSTÁTICA SELECTIVADEL CRISTAL VIOLETA Recibir en el laboratorio, las muestras enumeradas o etiquetadas. 1) Mantener 4 tubos con agar nutritivo fundido en el baño maría a 45 ºC. 2) Transferir 1ml de la solución acuosa de cristal violeta de 1:1000 a uno de los tubos con 9 ml de agua. Esto da una disolución de 1:10000. 3) Usando la misma pipeta, transferir 1ml de la dilución 1:10000 a una placa Petri y 1 ml al segundo tubo con 9ml de agua. Esto da una disolución de 1:100000.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental 4) Transferir 1ml de la solución 1:100000 a una placa de Petri y 1 ml a un tercer tubo con 9 ml de agua esto da una dilución de 1:1000000. 5) Transferir 1ml de la dilución 1:1000000 a una placa Petri. 6) Vertir el agar fundido en las tres placas de Petri y mezclar bien el colorante con el agar rotando suavemente la placa,para obtener una distribución uniforme del colorante. 7) Vertir el contenido del ultimo tubo de agar en la placa de petri sin colorante para que sirva de control. 8) Cuando se ha solidificado el agar se invierte la placa y dividir cada una en en dos partes iguales con un lápiz de cera. 9) Marcar cada mitad con el nombre del organismo con el que se va sembrar por el método de estrías. 10) Rayar en estrías la mitad de una placa de petri con una gotita ,tomada con el asa del inoculador ,del cultivo Sector A: Siembra de Escherichia. Coli,y la otra mitad iguakmente con una gotita del cultivo Sector B: Siembra de Bacillus Subtillis. 11) Proceder de igual forma con las demás placas de Petri. 12) Invertir las placas e incubarlas a 37 ºC por 48 horas. 13) Anotar los resultados obtenidos,indicando la presencia y ausencia de crecimiento por los signos (+) y (-) respectivamente.

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