Laboratorio 2-coloracio De Bac.docx

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

COLORACION DE BACTERIAS

PRIMER LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGÍA – SA323K

GUILLEN MANCHA, WILLIAM

DOCENTE: ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROS

Lima – Perú 2018

UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental

INDICE RESUMEN............................................................................................................................... 3 SUMARY.................................................................................................................................. 4 I.

INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 4

II.

OBJETIVO....................................................................................................................... 5

III.

MARCO TEÓRICO....................................................................................................... 6

1)

Conceptos Previos:...................................................................................................6

IV.

RESULTADOS............................................................................................................. 7

V.

DISCUSION DE RESULTADOS......................................................................................8

VI.

CONCLUSIONES:....................................................................................................... 9

VII.

RECOMENDACIONES:.............................................................................................11

VIII.

CUESTIONARIO........................................................................................................ 12

IX.

FUENTES DE INFORMACIÓN:.................................................................................13

X.

ANEXOS:....................................................................................................................... 14

XI.

APENDICE................................................................................................................. 15

1.

DIAGRAMA DE FLUJO.............................................................................................15

2.

PROCEDIMIENTO....................................................................................................16

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INDICE DE ILUSTRACIONES Ilustración 1. Formas de bacterias...........................................................................................................6 Ilustración 3.Fotografía de la placa con muestra luego de su exposición.............................................14 Ilustración 4.Fotografias, izquierda tubos de los 5 grupos. Derecha: placas numeradas de los 5 grupos expuestos en diferentes medio....................................................................................................14

INDICE DE TABLAS Tabla 1.Características de muestra utilizadas de los grupos 1,2,3,4 y 5......................................6

INDICE DE FIGURAS Figura 1.Ingredientes del Agar saboraud..............................................................................................14 Figura 2.Diagrama de flujo....................................................................................................................15

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental RESUMEN El presente trabajo determina SUMARY The distribution of microorganisms carried out in the laboratory, taking as samples in the different environments of the faculty of Environmental Engineering, verifies that microorganisms are present in every place such as soil, air, water. We also have factors that determine its proliferation such as temperature, acidity, nutrients, among others. The results obtained confirm this fact in. The three procedures A, B and C. Bacteria, fungi are living organisms that proliferate in a very short time. For what we find in the analyzed environments such as Rhizopus nigricans, Alternaria aspergillus, yeasts, these are very frequent microorganisms in the area and in places in the open air.

I. INTRODUCCIÓN El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas las células, es el proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción a la tinción Gram, las bacterías pueden dividirse en dos grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su reacción, los microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como gramnegativas.Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo o por ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la práctica, al procedimiento establecido. Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos.

II. OBJETIVO -

Identificar la tinción GRAM, forma y agrupación al que pertenecen las muestras que se analizaran en laboratorio utilizando el microscopio compuesto.

III. MARCO TEÓRICO 1) Conceptos Previos: Microorganismos: son los seres vivos más diminutos que y que pueden ser apreciados a través de un microscopio; podemos incluir las bacterias, levaduras y mohos que pululan en diferentes partes del planeta. Bacterias: Son organismos unicelulares, procariotas y cosmopolitas, con una gran diversidad de formas, funcionan como reguladoras en los ambientes, produciendo

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental oxígeno y fijando nitrógeno y carbono, degradando materia orgánica en descomposición y controlando las poblaciones de organismos ya que producen enfermedades. Tenemos:

Ilustración 1. Formas de bacterias Fuente: Ibáñez Ártica Miguel(2015).Biodiversidad del Reino Monera. Formas de bacterias.Recuperado de: http://naturarchives.blogspot.pe/2015/08/biodiversidad-el-reino-monera.html(extraido 05-042018). La tinción de gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio

Identificación de Bacterias por Tinción GRAM: Morfología Bacteriana Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión "taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. Cocos: Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño Bacilos:Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos Espirales:Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma especie. Coloración Gram Soluciones aplicadas por su orden

REACCION Y APARIENCIA DE LAS BACTERIAS Grampositivas Gramnegativas

Cristal violeta Lugol solución iodada

Células se tiñen color violeta

Células se tiñen color violeta

Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los

Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta Eliminación por extracción de grasas de las paredes

Alcohol

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Safranina

poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las bacterias que continúan teñidas de color violeta bacterias no decoloradas; quedan teñidas de color violeta.

celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la bacteria. bacterias decoloradas; se tiñen de color rosado.

Fuente:Pelczar

Bacterias gramnegativos En microbiología, se denominan bacterias gramnegativos aquellas que no se tiñen de azul oscuro o de violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "gramnegativos" o también "gramnegativos". Bacterias Gram positivas En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas, o bacterias Grampositivas, aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram.

IV. RESULTADOS Datos del Grupo 01: GRUPO

N° 1

Tabla 1.Características de muestra utilizadas de los grupos 1,2,3,4 y 5. MUESTRA CARACTERES DE COLONIA FORMA UTILIZADA  Tamaño: 4mm AULA VACIA  Borde:liso Cocos  Elevación: convexa  Carácter Ópticos: Opaca  Pigmentación: blanca  Tamaño: 1mm INNOCULADOR cocos  Borde:liso ESTERIL  Elevación: convexa  Carácter Ópticos: Opaca  Pigmentación: blanca

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AGRUPACION

GRAM

Estreptococos

Negativo

Estreptococos

Negativo

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N° 2

N° 3

(*)

Placa nº3 (grupo 1) Placa estéril Tubo Nº3 Pipeta estéril y tubo no estéril        

Huella digital (placa N°2 sector B)

Placa N°2 GRUPO 3 sector A (pelo)

Positivo Positivo

No se pudo observar

Laboratorio de Microbiología (placa N°1)

N° 4

Estafilococos Cocos

Borde: Lobular Elevación: plana Carácter Ópticos: Opaco Pigmentación: blanca Borde: Lobular Elevación: plana Carácter Ópticos: Opaco Pigmentación: blanca

Estafilococos

Positivo

Cocos

Positivo Cocos

(*)

Estafilococos Estreptococos

Negativo

Cocos

Positivo

(*) Tubo N°1(GRUPO 4) Bacilo

N° 5

 Tamaño: 1mm Sector no estéril  Borde:liso  Elevación: plana  Carácter Ópticos: Opaca  Pigmentación: crema  Tamaño: 2mm Sector estéril  Borde:ondulante  Elevación: plana  Carácter Ópticos: Opaca  Pigmentación: blanca Nota. Fuente: Grupo 01,02,03,04 y05. (*)No especifica.

Estreptobacilos Estreptobacilos

Negativo

Estreptococos

Negativo

bacilos

cocos

V. DISCUSION DE RESULTADOS  Para el GRUPO 1  Para las placa N° 2 estéril sector C del grupo 3 ,inoculador estéril, se observó un reducido grupo de 2 colonias pesar de que no debería haber esto hace suponer que hubo una mala manipulación de los instrumentos lo que ha contaminado al instrumento. PROCEDIMIENTO B :  Para el grupo 4, en pipeta y tubo estéril se observa el crecimiento de bacterias con sus respectivas características como es la manifestación de olor pútrido por lo que no debe presentarse por ser esterilizado ambos instrumentos. Puede ocurrir esto por el mal guardado de instrumentación. En cambio en el grupo 2

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental donde tomaron una muestra del lugar biblioteca FIA, hubo la característica de olor imperceptible, es compatible con lo esperado.  Para los dos grupos las condiciones de pipeta y tubo estéril muestran un escaso-nulo crecimiento de bacterias y hongos, lo cual se puede deber a un cierto grado de contaminación al momento de transportar los tubos. En teoría no es lo esperado. PROCEDIMIENTO C :  Se observaron en todas las placas el crecimiento de hongos y levaduras.  En la placa del grupo 1 se obtiene muy poca cantidad de colonias(6),lo cual está acepción no es muy correcta por ser en el lugar del baño de hombres por tener mayor concentración de humedad, puesto que el crecimiento de los hongos se incrementa. Por lo que no es muy convincente esos resultados.  El ambiente más contaminado de hongos(75 colonias) fue observado a través de la placa del grupo 5 ,donde la muestra fue tomada en el laboratorio de fisicoquímica de la FIA .Aunque el que debió tener el mayor número de hongos es el baño de hombres por tener mayor concentración de humedad, puesto que el crecimiento de los hongos se incrementa con la presencia de abundante oxígeno. VI.CONCLUSIONES: PROCEDIMIENTO A: 1) Grupo 01:Aula 261-Vacía  Para la Placa N°1;la cual fue expuesta en el Aula 261-vacía se observa la presencia de 12 colonias donde los tamaño oscilan entre 1mm a 6mm,con un tipo de margen liso, de elevación plana y convexas con pigmentación crema y caracteres ópticos opacos.  En la Placa N°2:el cual se dividió en 4 sectores A,B,C y D se observó lo siguiente, para el sector A(pelo),se encontró 4 colonias, en el sector B(huella)se encontró 35 colonias debido al aseo incorrecto de las manos, en el sector C(inoculador estéril) y en el sector D(inoculador no

estéril) se

encontró solo una colonia de cada uno.Con un tipo de margen liso, de elevación plana,de pigmentación blanco en el sector A y en los demás crema.caracter óptico opaco.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental  En la Placa N°3, se encontró 3 colonias.  Y para la Placa N°4,se observó la presencia de 2 colonias, con las siguientes características morfológicas predominantes las de 1mm,de margen liso, elevación plana, pigmentación blanco y caracteres ópticos opacos y translúcida. 2) Grupo 03: Laboratorio de microbiología.  Para la Placa N°1;expuesta al laboratorio de microbiología se observaron la formación de 52 colonias de microorganismos cuyos tamaños oscilan de 1 a 3mm,con margen liso predominante elevación plana , de pigmentación blanca amarilla y naranja, y de carácter óptico opacos y triangulados.  En la Placa N°2:el cual se dividió en 4 sectores A,B,C y D se observó lo siguiente, para el sector A(cabello),la formación de 53 colonias, en el sector B(huella)se encontró 24 colonias debido al aseo incorrecto de las manos, en el sector C(inoculador estéril) se observaron 2 colonias y en el sector D(inoculador no estéril) se encontró 6 colonias.  En la Placa N°3, se observó 29 colonias. Tamaño varía de 1 a 4mm de margen liso en su mayoría, ondulante y lobular, elevación plana convexa, de pigmentación blanca carácter óptico opacos translucidos.  Y para la Placa N°4, se observó la presencia de 37 colonias, con las siguientes características morfológicas predominantes las de 1mm,de margen ondulante, liso y lobular, elevación plana y convexa, pigmentación blanco y caracteres ópticos opacos y translúcidos. PROCEDIMIENTO B: 1) Grupo 02: Biblioteca FIA.  En el tubo N°1(tubo y pipeta estériles), no debe haber presencia de bacterias aunque se dio las siguientes observaciones presencia escasa de bacterias con distribución sedimentada y olor imperceptible lo cual indica que hubo contaminación en los instrumentos.  En el tubo N°2(tubo y pipeta no estéril), se observó abundante presencia de bacterias, con distribución sedimentada y con olor pútrido debido al uso de la pipeta no estéril.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental  En el tubo N°3(tubo no esteril y pipeta estéril), se observó una moderada cantidad de bacterias con distribución de crecimiento en forma de sedimento y olor pútrido esto debido al uso del tubo no estéril.

2) Grupo 04: Centro de estudiantes(CEIA)  En el tubo N°1(tubo y pipeta estériles); también no debe haber presencia de bacterias dado que el tubo y pipeta son estériles pero se vio las siguientes observaciones presencia escasa de bacterias con distribución sedimentada y olor putrido lo cual indica que hubo contaminación en los instrumentos.  En el tubo N°2(tubo estéril y pipeta no estéril), se observó escasa presencia de bacterias, con distribución sedimentada y con olor pútrido debido al uso de la pipeta no estéril.  En el tubo N°3(tubo no estéril y pipeta estéril), se observó una moderada cantidad de bacterias con distribución de crecimiento en forma de sedimento y olor pútrido esto debido al uso del tubo no estéril. PROCEDIMIENTO C:  Se observaron 4 tipo de hongos: Aspergillus, Alternaria y Rhizopus.  Se usó el agar sabourand, para aislar hongos de ciertas levaduras, ya que es útil para el crecimiento de hongos patógenos.  Se concluye de las muestras que se recogieron en cada ambiente que se encuentran contaminadas en especial el laboratorio de físico-química, debido a la gran diferencia de desarrollo de número de hongos. VII.

RECOMENDACIONES:

EN EL PROCEDIMIENTO A:  Se debe tener presente la adecuada esterilización de los instrumentos a utilizar para tener un mejor resultado en los experimentos.  Tratar de agarrar las placas Petri a costados evitando tocar los lados en el proceso del experimento.  Colocar el inoculador estéril en una gradilla para evitar contaminación en el agar.  Se debe sellar las placas los bordes de las placas antes de colocarlos a la incubadora, debido a que la humedad afecta a los microorganismos.  Al colocar el pelo en el agar, trata de evitar de tocar con los dedos el agar.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental  Hay que tomar en cuenta la vida media de los microorganismos,lo cuales viven aproximadamente 48 horas luego de ser cultivados, pasado este tiempo para su estudio e identificación no se obtendría resultados óptimos a lo esperado. EN EL PROCEDIMIENTO B:  Se debe tener presente la adecuada esterilización de los instrumentos a utilizar para tener un mejor resultado en los experimentos.  Tapar bien los tubos de ensayo con algodón al momento de esterilizarlas.  Utilizar de manera adecuada la pera al transferir el caldo nutritivo con la pipeta al tubo para evitar contaminación en la pipeta estéril o en el tubo estéril de acuerdo al procedimiento.  Hay que tomar en cuenta la vida media de los microorganismos,lo cuales viven aproximadamente 48 horas luego de ser cultivados, pasado este tiempo para su estudio e identificación no arrojaría resultados óptimos. EN EL PROCEDIMIENTO C:  Tratar de agarrar la placa Petri a los costados evitando tocar los lados en el proceso del experimento.  No poner la placa cerca de la puerta del ambiente que ha cada grupo les ha tocado, debido a que puede haber contaminación de afuera del ambiente.  En el ambiente que tenga mayor humedad o menos iluminación tendrá más desarrollo de hongos.  Se debe sellar los bordes de las placas antes de colocarlos a la incubadora, debido a que la humedad afecta a los microorganismos.  Tomar en cuenta el tiempo y los factores que afectan a la proliferación de microorganismos. VIII.

CUESTIONARIO

Coloración de Bacterias 1. Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son transmitidas por el aire, agua y alimento. 2. Responder: a) ¿Cuáles son las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas? GRAM POSITIVAS

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental Las bacterias grampositivas cuentan con una envoltura celular que comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la interior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico, la capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y una de las responsables de retener el tinte durante la tinción de Gram. Una de las diferencias de las bacterias grampositivas con gramnegativas es que presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared celular. GRAM NEGATIVAS Esta característica está íntimamente ligada a la estructura didérmica dada por la envoltura celular, ya que presenta doble membrana celular (una es externa y la otra citoplasmática) lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales supergrupos de bacterias y cuando se trata como taxón se le puede llamar con el nombre de Negibacteria o bien Didermata. Las que restan son las bacterías grampositivas. b) ¿Afecta la edad de cultivo a la reacción de tinción de gram?

IX.FUENTES DE INFORMACIÓN: M.J.PELCZAR Jr. Y R.D.REID.MICROBIOLOGíA Editorial Mc.Graw-Hill Book Co.Inc.New York 4ta.Edic.1984. (pág. 57-86). Ibáñez Ártica Miguel (2015).Biodiversidad del Reino Monera. Formas de bacterias. Recuperado

de:

http://naturarchives.blogspot.pe/2015/08/biodiversidad-el-reino-

monera.html(extraido 05-04-2018).

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental Micología,

Microscopía

de

las

Setas,

Recuperado

de:http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20caracteres.html(Extraido 0504-2018) Universidad Complutense Madrid, Grupo de investigación: hongos y levaduras de interés

en

agroalimentación.

Líneas

de

Investigación,

Recuperado

https://www.ucm.es/hongos-y-levaduras/lineas-de-investigacion(Extraído

de:

05-06-

2018) Fungal infection.Colonias verdes de A. flavus en agar Sabouraud , Recuperado de: http://www.life-worldwide.org/esp/fungal-diseases/aspergillus-flavus.Extraído(04-042018)(22hrs.) IZQUIERDO LOPEZ, Gady Sadith, CALIDAD MICROBIOLOGICA AMBIENTAL DEL AIRE EN LOS INTERIORES DEL HOSPITAL EsSALUD EN TINGO MARIA, PERÚ, (Abril,2016). Cultura,E.a.Microorganismos

y

alimentos.Obtenido

de

http://www.epralima.com/infoodquality/materiais_espanhol/Manuais/3.Microorganism os_y_alimentos.pdf Luna, M. M. GESTION INTEGRA. Obtenido de https://gestionintegra.com/factoresque-favorecen-el-crecimiento-bacteriano/(3 de abril de 2018).

X. ANEXOS:

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Figura 1.Imagen de las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas. Fuente: crecimiento microbiano.Diefrencias entre gram positivas y gram negativas.Recuperado de: https://es.slideshare.net/toons1233/capitulo-6-14297911 (Extraído 11-04-2018)

Ilustración 2.Fotografía de la placa con muestra luego de su exposición. Fuente: Grupo 4.

Ilustración 3.Fotografias, izquierda tubos de los 5 grupos. Derecha: placas numeradas de los 5 grupos expuestos en diferentes medio. Fuente: Grupo 4

XI.APENDICE 1. DIAGRAMA DE FLUJO

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA Facultad de Ingeniería Ambiental Figura 2.Diagrama de flujo. Fuente: Elaboración propia.

2. PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO: Método Gram (Tinción de Gram). 1) Usar laminas limpias y pasarlas varias veces cortando la llama del mechero bunsen. 2) Dejar enfriar la lámina y colocar sobre ella una gotita de suero fisiológico con el inoculador. 3) Con el inoculador estéril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser examinado y transferir un poquito del sobre la gotita de suero fisiológico. 4) Esterilizar el inoculador y dejarlo enfriar. 5) Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo sobre la parte central del porta-objeto, cuidando de que se forme una película muy delgada. 6) Dejar que la película seque al aire. 7) Fijar la preparación sobre pota-objeto pasándola por la llama del mechero tres veces, manteniendo la película hacia arriba de la llama. Dejar enfriar. 8) Cubrir la película con el colorante cristal violeta (Gram #1) y dejar cubierto así por un espacio de 60 segundos. 9) Lavar la lámina con agua durante 20 segundos. 10) Tratar la lámina con la solución lugol (Gram #2), durante un minuto. 11) Decolorarla con alcohol-acetona (Gram #3) durante 15 a 20 segundos. 12) Lavar la lámina con agua durante 2 segundos. 13) Contracolorar con safranina (Gram #4) y dejar que se tiña por un espacio de 20 segundos. 14) Lavar la lámina con agua durante 2 segundos. 15) Dejar de secar y examinar al microscopio la preparación. Un organismo gram positivo retendrá el color cristal violeta y aparecerá teñido de azul o morado y un organismo gram negativo tendrá el color rosado o rojo de la safranina.

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