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Extracción de ADN en lentejas

Objetivos 1. Indicar las funciones biológicas del ADN. 2. Demostrar la presencia de AN en tejidos biológicos. 3. Explicar los principios físico-químicos en que se basa la extracción y purificación del ADN. 4. Indicar los usos del ADN genómico humano en el diagnóstico molecular, en genética forense e ingeniería genética. Introducción La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro. La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN

EXTRACCIÓN DE ADN

Cuestionario de Revisión 1. Describa los principios generales de Extracción de ADN. El ADN se encuentra en el núcleo celular, muy replegado y unido a proteínas formando la cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido, romper las células para separar el núcleo, romper el núcleo y liberar el ADN, separar las proteínas y precipitarlo para extraerlo de la solución. El ADN aparecerá como un agregado de fibras blanquecinas que se adhiere.

1 Fragmentación del tejido

5

2

Análisis

Lisis celular

Purificación del ADN

4 } Purificación 4

3 Clarificación

EXTRACCIÓN DE ADN

1. Fragmentación del tejido (Homogenización del tejido): La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético, es decir no es más que la disociación de las células para que pierdan contacto entre ellas y así volverse más vulnerables a la lisis celular.

2. Lisis celular: Rotura de las membranas celulares y nucleares para liberar el ADN. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.); tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles) y digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).

3. Clarificación: Separación de los ácidos nucleicos de los restos celulares. La clarificación se puede realizar por centrifugación, filtración o por método mixto de enzimas + centrifugación.

4. Purificación: Separación del ADN de proteínas solubles, de otros acidos nucleicos no desados, de lípidos, de carbohidratos, de sales y otros compuestos orgánicos. Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes: Extracción/precipitación (Ej. Salting out y la desproteinización con fenol, Cromatografía (de intercambio iónico, de adsorción selectiva, de permeación sobre gel), Centrifugación y Separación por afinidad.

5. Análisis: puede ser cualitativo determinando la calidad del ADN (electroforesis) o cuantitativo para determinar la concentración de ADN (espectrofotometría UV).

EXTRACCIÓN DE ADN

2. Diga usted para qué utilizamos detergentes en el procedimiento.

EL DETERGENTE EN LA EXTRACCIÓN DEL ADN

Cabezas

Colas

Lípidos de la Membrana

Agente tenso activo, reduce la tensión superficial de las membranas

Detergente

Separa las membranas celulares del tejido vivo

Captura los restos de lípidos y proteínas de las membranas

Permite la salida del ADN al exterior

EXTRACCIÓN DE ADN

3. Diga usted para qué utilizamos alcohol en el procedimiento.

Neutraliza las cargas de la solución

Deja expuestos los grupos fosfatos del ADN

Hace precipitar el ADN, haciéndolo visible.

Remueve del ADN componentes como las concentraciones residuales de sales

4. Diga usted qué tipo de enzimas contienen los suavizadores de carne y el jugo de piña y para qué lo utilizamos en este procedimiento.

Contiene

Tiene papaína, que es una enzima proteolítica (proteasa), la cual es una proteína especializada en la degradación de otras proteínas

Función

Degrada completamente todo tipo de proteínas y las separa del ADN

ABLANDADOR DE CARNE

EXTRACCIÓN DE ADN

5. Diga usted cuántos usos se les puede dar al ADN una vez extraído.

Estudios de variación genética

Pruebas de Paternidad

Diagnóstico Molecular de enfermedades

Organismos genéticament e modificados

Ingeniería Genética

Secuenciació n del ADN

Detección de Cepas de Virus y Bacterias

Investigación de trastornos genéticos

Análisis de la escena de un crimen

Medicina Forense

Terapia genética

Fabricación de fármacos con genética recombinante

EXTRACCIÓN DE ADN

6. Diga usted qué relevancia tiene e l ADN en el diagnóstico clínico.

Utilizado para la búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa, como es el caso de la detección de alelos de un gen normales y mutados.

Diagnóstico de infecciones virales y bacterianas, así como la distinción de cepas de los mismos, también para el diagnóstico de contaminación bacteriana de alimentos.

Ha permitido el avance en investigaciones médicas sobre las enfermedades hereditarias, permitiendo hallazgos en las terapias genéticas.

EL ADN EN EL DIAGNOSTICO CLÍNICO

EXTRACCIÓN DE ADN

7. Diga usted cuáles son las funciones biológicas del ADN.

Codificación de proteínas

Permite la capacidad de mutación (Cambios evolutivos)

Almacena información genética

Funciones Biológicas del ADN

Su replicación asegura la transmisión a las células hijas

Controla la actividad de las células

8.

Diga usted cuáles son las diferencias en cuanto a la extracción de ADN y ARN.

EXTRACCIÓN ADN   

El ADN es muy estable y sólo se requiere mantener las muestras congeladas antes de su extracción. Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular. Algunos paquetes comerciales de alto rendimiento son: PURIGEN, QUIAGEN, MILIPORE, GENTRA y MoBio.

ARN     

ARN total o Sub-celular (citosólico y nuclear) Primero es necesario agregarle una solución que estabilice al ARN lo antes posible Se minimiza la actividad de ARNasa liberadas de las células lisadas Extracción con fenol ácido (pH 4.5 ) Paquetes comerciales de compañías como QIAGEN, Ambion y RNA-works

EXTRACCIÓN DE ADN

REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIÓN DE: ADN               

Tris (Hidroximetil amonio metano) como tampón biológico estabilizante del pH de la solución entre 7,0 y 8,0 EDTA (ácido etilendiamintetracético) como agente quelante, atrapa Mg+ inhibiendo las endonucleasas Cloruro de Sodio, a altas concentraciones solubiliza el ADN Cloruro de Potasio, sal equilibrante de fuerzas iónicas Acetato de Sodio, sal que precipita el ADN Acetato de Potasio, sal que precipita proteínas Fenol, solvente orgánico que denatura proteínas; es tóxico Cloroformo, solvente orgánico, que denatura proteínas, remueve lípidos, solubiliza fenol o lo elimina; es tóxico SDS (dodecil sulfato de sodio), detergente aniónico que solubiliza proteínas y membranas; es tóxico Sarkosyl (Lauril sarcosina), detergente aniónico que solubiliza proteínas y membranas CTAB (hexadecil trimetil bromuro de amonio), detergente catiónico que solubiliza polisacáridos Tritón X-100, detergente que solubiliza proteínas y membranas B-Mercaptoetanol, antioxidante que inactiva proteínas por reducción de puentes disulfuro DTT (Ditiothreitol), antioxidante que reduce los grupos sulfuro de las proteínas Octanolilsoamilalcohol, alcohol funciona como agente antioxidante y disminuye la formación de espumas e interfases

ARN 



 



Uso de inhibidores de ARNasa y denaturantes fuertes de proteínas (HCL Guanidina o Tiosanato de Guanidina con agentes reductores) Dado que las ARNasas no van a ser inactivadas en su totalidad en el autoclave, resulta esencial trabajar con material estéril y de preferencia de un solo uso. Las micro esferas de vidrio, generalmente utilizadas en la extracción para incrementar la lisis celular por acción física Es importante que los reactivos que se utilicen en la extracción de ARN se mantengan en alícuotas con los volúmenes mínimos necesarios para cada etapa del proceso y en caso de ser posible se pasen dos veces por el autoclave El método utilizado con más frecuencia es el de GIPS (por sus siglas en inglés; ácido Tiosanato de Guanidina, fenol, Sarkosyl)  El ácido Tiosanato de Guanidina es sumamente fuerte y tiene un alto poder denaturalizante  El fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule en la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase acuosa  El Sarkosyl, por su parte, es un detergente muy potente que ayuda a la lisis celular, pero no reemplaza la ruptura física de las células que generalmente se logra con micro esferas de vidrio agitadas con la ayuda de un vórtex o de un homogenizador celular (como BeadBeater)

EXTRACCIÓN DE ADN

   

PVP (polivinil pirrolidona), detergente que elimina compuestos fenólicos que inhiben la actividad enzimática Etanol, alcohol que precipita los AN Isopropanol, alcohol que precipita los AN ARNasa, enzima que degrada el ARN



El método BOOM, lleva a cabo la extracción con el ácido Tiosanato de Guanidina, separando los ácidos nucleicos con base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de sílica, en vez de utilizar fenol. Dado que este método aisla tanto ADN como ARN, resulta esencial utilizar las nucleasas específicas para ADN que lo eliminen de la muestra. Durante su precipitación es común utilizar cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas). Este método no debe ser utilizado para ARN que será sometido a transcripción reversa

EXTRACCIÓN DE ADN 9. Diga usted cuáles son las diferencias entre los procedimientos de extracción de ADN animal y ADN vegetal.

Extraccion de ADN Vegetal El ADN genómico de las plantas es más difícil de extraer a causa de la pared celular de la planta, que se elimina por homogeneización o mediante la adición de celulasa para degradar la celulosa que forma la pared celular.

Además, los metabolitos presentes en la célula vegetal pueden interferir con la extracción de ADN genómico por la contaminación de la muestra de ADN durante el proceso de precipitación.

Extraccion de ADN Animal

Los leucocitos de sangre periféricos son una fuente principal de ADN genómico en animales, pero la recogida de muestras es difícil ya que la sangre debe ser retirada del animal.

La sangre contiene una serie de compuestos como proteínas, lípidos, glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas y plasma, que pueden contaminar la muestra de ADN. El contaminante principal del ADN de animal extraído por muestras de sangre es hemo, el componente no proteíco de la hemoglobina.

Diferencias Las diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se encuentran en la secuencia de bases en la hélice. Los compuestos que se encuentran en las células vegetales están ausentes en las células animales y las secuencias de bases de ADN reflejan esto, puesto que el ADN genómico de la planta es a menudo mayor que el ADN de los animales. Estas diferencias afectan los métodos de extracción, ya que impacta en el rendimiento y la pureza del ADN.

10. Diga usted qué principio de extracción se usa para ADN plasmídico.

EXTRACCIÓN DE ADN Las técnicas de Minipreps o mini preparaciones de plásmidos, permiten la recuperación de plásmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las células con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuración superenrrollada del plásmido se mantiene estable.

Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos básicos.  Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación.  Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared celular del huésped.  Resuspender las células en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa. 

Lisar las células con NaOH y SDS.

 Unión de las hebras de DNA y remoción de contaminación mediante el acetato de potasio.  Precipitación del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio).  Enjuague del material genético con EtOH al 70%.  Resuspender el material genético.

11. Explique usted por qué la concentración de ADN se mide a 260 nm. Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha señalado anteriormente, la absorbancia máxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm. 12. Indique usted qué tipo de contaminantes podemos encontrar en un extracto de ADN.

EXTRACCIÓN DE ADN

Fisicos

Biologicos Quimicos

13. Explique usted por qué la medición de una muestra de ADN a 260/280 nos da información sobre la pureza de la muestra. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puro son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.

La absorbancia máxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen proteínas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280)

EXTRACCIÓN DE ADN proporciona una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 μg/ml de ADN bicatenario, 37 μg/ml de ADN monocatenario, 40 μg/ml de ARN o 30 μg/ml de oligonucleótidos. Si la muestra también contiene proteínas, el cociente A260/A280 será considerablemente inferior a dichos valores y no podrá determinarse con exactitud la cantidad de ácidos nucleicos.

14. Diga para qué fines se puede utilizar el ADN genómico humano.

Medicina Forense

Bioinformática

Ingeniería genética y Criminalística Nanotecnología del ADN

15. Cuando realizamos una extracción de ADN, aparte de concentración y pureza, qué otros parámetros de calidad de la extracción de ADN se deben investigar?

EXTRACCIÓN DE ADN

Pureza Cantidad Calidad

Concentración

16. Diga usted para que utilizamos la sal en este procedimiento. La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN, es decir la sal evita la unión de las proteínas al ADN.

17 .Para qué se hace uso de la licuadora en este procedimiento. La licuadora ayuda en la rotura de membranas celulares y cubiertas nucleares, permitiendo la separación del ADN. Rompe las células y expone las paredes celulares y membranas a la acción del detergente.

EXTRACCIÓN DE ADN Reporte de Laboratorio MATERIALES:               

Arvejas Balanza de compensación NaCl Agua destilada Licuadora Beaker de 250 ml Colador plástico, o Filtro para cafetera Jabón líquido Reloj Tubos de ensayo 13 x 100 mm Gradillas Ablandador para carne Alcohol al 70% Reloj Pinchos de madera para carne

PROCEDIMIENTOS:

3

2

1

Pesar 100g de lentejas

Agregar 1g NaCl y 200 mL de H2O

4

Licuar todo por 15 seg.

7

En un Beaker colar la sopa resultante

6

5

8

9

Con un pincho limpio extraer el ADN

Agregar alcohol y dejar reposar 10 min.

Agregar 1g gramo de ablandador, mezclarlo 5 min.

Distribuir la solución en tubos de ensayo

Agregar 30 mL de jabón líquido, esperar 10 min.

EXTRACCIÓN DE ADN

Para realizar el laboratorio, nos dispusimos a trabajar activamente cada uno en un procedimiento inicial diferente, sin embargo a partir del procedimiento de dividir la solución en tubos de ensayo, nos reagrupamos en parejas. Cada pareja era encargada de un tubo de ensayo, por lo cual a través de un apoyo mutuo finalizamos el procedimiento exitosamente. Resultados:

Luego de ciertas dificultades con los filtros, la innovación de utilizar papel toalla fue la solución para acelerar la realización de los procedimientos restantes, en la imagen observamos en un matraz la mezcla de la solución colada con el detergente.

EXTRACCIÓN DE ADN

Alcohol Solución de lentejas

En esta imagen observamos los cinco tubos de ensayo, cada uno ya con ablandador de carne y alcohol. En cada uno de los tubos de ensayo se puede observar la interfase entre el alcohol y la solución. Poco a poco está ocurriendo la precipitación del ADN.

Finalmente logramos apreciar un poco la precipitación del ADN, a pesar que no se precipito hasta arriba en estas dos muestras es donde mejor se observaba la precipitación en la interfase.

Conclusiones 1. La extracción de ADN, es un método esencial y multidisciplinario, ya que sus aplicaciones abarcan la Medicina clínica, Biotecnología, Ingeniería Genética, Medicina Forense entre muchas más disciplinas científicas en las cuales se ha abierto campo con los avances tecnológicos de la última década. 2. La extracción de ARN difiere de la extracción de ADN, ya que los reactivos empleados son diferentes por las características físico-químicas de las moléculas, en la extracción de ARN el pH debe ser ácido mientras que en el de ADN debe ser neutro. 3. Entre los buffer de extracción de ADN tenemos el buffer CTAB, el buffer CTAB 2x, el buffer STE. Los cuales contienen Tris-HCL, EDTA, CTAB, NaCl, b-Mercaptoetanol entre otros reactivos. 4. En la extracción de ARN se utiliza mayormente el método GIPS, porque el método BOOM no es recomendable para ARN que será sometido a la técnica de transcripción reversa. El reactivo en común de ambos métodos es el ácido Tiosanato de Guanidina. 5. Los parámetros de la calidad de la extracción de ácidos nucleicos incluyen la concentración, la pureza, la integridad, el alto rendimiento de la muestra, la exactitud y su fiabilidad para reproducir los datos.

Webgrafía 1. 2. 3. 4.

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