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FACULTAD DE INGENIERÍA Ingeniería Agroindustrial y Agronegocios e Ingeniería en Industrias Alimentarias INFORME DE LABORATORIO N°1 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN FRUTAS Curso: Análisis Químico Instrumental

Integrantes: Arana Copa, Oscar Oswaldo Broncano Maltese, Andrea Cecilia Iquise Mori, Angela Melany Machaca Paredes, Hasler Valero Hinostroza, Andy Rodil

Profesor: Falcón Roque, Jesus Marino

Lima – Perú 2019

INTRODUCCIÓN Los Antioxidantes son compuestos los cuales pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhibiendo la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres. Los antioxidantes se dividen en dos categorías principalmente que son: sintéticos y naturales. En general los antioxidantes sintéticos son compuestos de estructuras fenólicas con varios grados de sustitución alquílica, mientras que los antioxidantes naturales pueden ser: compuestos fenólicos (tocoferoles, flavonoides y ácidos fenólicos), compuestos nitrogenados (alcaloides, derivados de la clorofila, aminoácidos y aminas) o carotenoides así como el ácido ascórbico. Los antioxidantes sintéticos como el BHA y BHT (Butil – hidroxianisol y Butil - hidroxitolueno) han sido utilizados como antioxidantes desde principios del siglo pasado. Sin embargo, se han impuesto medidas de precaución y se ha restringido su uso debido a su carcinogenicidad. Debido a esto, el interés por los antioxidantes naturales se ha incrementado considerablemente ya que la capacidad de actuar como antioxidante se ha demostrado en el laboratorio y mencionado en la literatura. Muchos antioxidantes naturales, en especial los flavonoides, muestran un amplio rango de efectos biológicos incluyendo funciones antibacteriales, antivirales, antiinflamatorias, antialergénicas, antitrombóticas y vasodilatadores. Una terapia antioxidante provee una alternativa barata para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo ya que se ha demostrado el efecto antioxidante de productos naturales provenientes de las plantas. La actividad antioxidante y su relación con la propiedad curativa de una gran cantidad de plantas medicinales han sido reportadas en diversas investigaciones. Existe muchos métodos para medir la capacidad antioxidante de una especie o sustancia, un método muy usado se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) la cual se atribuye a la deslocalización del electrón desapareado, esta deslocalización también le otorga una coloración violeta caracterizada por una banda de absorción, en solución etanólica, centrada alrededor de 520 nm. Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que puede donar una átomo de hidrógeno o con otra especie radical (R. ) se produce la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R con la consecuente pérdida del color y por lo tanto la pérdida de la absorbancia. En el presente informe se informará sobre la práctica de laboratorio para la determinación de capacidad antioxidante en la fresa, de la cual se tomaron dos extractos de dicha muestra clasificados en hidrofílico y lipofílico, para finalmente medir la capacidad antioxidante con ayuda de equipos de laboratorio.

OBJETIVO 

Determinar la capacidad antioxidante en frutas y verduras mediante el método DPPH.

MATERIALES

TUBOS DE ENSAYO

FIOLA

AGITADOR MAGNÉTICO

BALANZA ANALITICA

PAPEL FILTRO

ESPECTROFOTÓMETRO

PIPETAS

METANOL

PIPETAS DE PLASTICO

MARCO TEÓRICO

Un antioxidante es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de un sustrato oxidable, actuando como donador de electrones (agente reductor). Un antioxidante dietético es una sustancia que forma parte de los alimentos de consumo cotidiano y que puede prevenir los efectos adversos de especies reactivas sobre las funciones fisiológicas normales de los humanos. Las propiedades antioxidantes no sólo deben estudiarse por sus interacciones químicobiológicos, sino por su función en el deterioro oxidativo que afecta a los alimentos. Se utilizan en la industria alimentaria adicionados a las grasas u otros productos para retrasar los procesos de oxidación, en tanto previenen el comienzo de la rancidez oxidativa (grasas). Asociado a la función antioxidante se considera el proceso de óxido-reducción que remite a dos momentos básicos: la oxidación que implica pérdida de electrones de hidrógeno con la ganancia de oxígeno en la molécula y la reducción que significa ganancia de electrones de hidrógeno con la pérdida de oxígeno. Así el oxidante se reduce al reaccionar con aquella molécula que oxida. Este proceso es cotidiano en el organismo humano y representa el conocido par óxido-reductor o balance redox. Todos los seres vivos que utilizan el oxígeno para obtener energía, liberan radicales libres, lo cual es incompatible con la vida a menos que existan mecanismos celulares de defensa que los neutralice. A estas defensas se las denomina antioxidantes. Los niveles bajos de los mismos, o la inhibición de las enzimas antioxidantes causan estrés oxidativo y pueden dañar o matar las células. Desde el punto de vista químico, es cualquier especie (átomo, molécula o ión) que contenga un electrón desapareado en su órbita más externa, y que sea capaz, a su vez de existir en forma independiente (libre). Desde el punto de vista molecular, actúan como potentes agentes oxidantes y son causa de envejecimiento al combinarse con moléculas esenciales, como el DNA y proteínas, a las cuales desactivan. Los radicales libres se forman a partir de moléculas estables por procesos de fisión homolítica y reacciones de transferencia de electrones. Se producen en el organismo continuamente por medio de reacciones bioquímicas de oxidación y reducción con oxígeno (redox). El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de desintoxicar rápidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. En términos químicos, es un gran aumento en la reducción del potencial celular o una disminución en la capacidad reductora de los pares redox celulares como el glutatión. Un aspecto “destructivo” del estrés oxidativo es la producción de especies reactivas derivadas del oxígeno, incluyen los radicales libres y los peróxidos. La fuente más importante de oxígeno reactivo en condiciones normales en organismos aeróbicos y probablemente la pérdida de oxígeno activado de las mitocondrias durante el funcionamiento normal de la respiración oxidativa.

PROCEDIMIENTO Extracción de la muestra: 1. Pesar 5 g de la muestra y añadir metanol (25 mL)

2. Homogenizar y agitar por 15 min con agitador magnético.

3. Centrifugar por 20 min. 4. Tomar el sobrenadante con ayuda de una pipeta (guardar para la medición del extracto hidrofílico).

5. Añadir a la muestra 10 mL de isopropanol y 15 mL de hexano. 6. Homogenizar y agitar por 15 min con agitador magnético.

7. Centrifugar por 20 min 8. Tomar el sobrenadante con la ayuda de una pipeta (extracto lipofílico)

Medición en el espectrofotómetro: 1. Tomar una alícuota de 150 μl del extracto y mezclar con 2850 μl de la solución diluida de DPPH en un tubo. 2. Tomar 150 μl del solvente (metanol y isopropanol/hexano) y mezclar con 2850 μl de la solución diluida de DPPH en un tubo (blanco). 3. Dejar reaccionar la muestra y el blanco por 30 min protegida de luz. 4. Poner el espectrofotómetro en cero utilizando metanol en 515 nm. 5. Leer la absorbancia de las muestras y el blanco después de los 30 minutos en 515 nm. 6. Calcular la disminución de la absorbancia con la siguiente formula: ΔDPPH = DPPHb – (A 515) muestra Donde: ΔDPPH = la disminución de la absorbancia debido a los antioxidantes DPPHb = Absorbancia del blanco A515 muestra = absorbancia de la muestra después de los 30 min

Calcular los porcentajes de inhibición del radical DPPH con la siguiente formula: % de inhibición = (ΔDPPH/DPPHb) x 100

RESULTADOS Tabla 1. Muestra y blanco con su respectiva absorbancia leídos en el espectrofotómetro. MUESTRA Y BLANCO

ABSORBANCIA

HIDROFILICO

0.050

BLANCO HIDROFILICO LIPOFILICO BLANCO LIPOFILICO

1.077 0.963 1.030

Calcular la disminución de la absorbancia con la siguiente formula: ∆𝐃𝐏𝐏𝐇 = 𝐃𝐏𝐏𝐇𝐛 − (𝐀𝟓𝟏𝟓)𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚 Dónde: ∆DPPH = la disminucion de la absorbancia debido a los antioxidantes DPPHb = Absorbancia del blanco (A515)muestra = absorbancia de la muestra despues de los 30min Calculando el porcentaje de inhibición del radical DPPH con la siguiente formula: ∆𝐃𝐏𝐏𝐇 % 𝐝𝐞 𝐢𝐧𝐡𝐢𝐛𝐢𝐜𝐢𝐨𝐧 = ( ) × 𝟏𝟎𝟎 𝐃𝐏𝐏𝐇𝐛  Para la muestra Hidrofilica: ∆𝐷𝑃𝑃𝐻 = 1.077 − 0.050 ∆𝐷𝑃𝑃𝐻 = 1.027 Calculando el porcentaje de inhibición del radical DPPH para la muestra hidrofilica: 1.027 % 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 = ( ) × 100 1.077 % 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 = 95.36

 Para la muestra Lipofilica: ∆𝐷𝑃𝑃𝐻 = 1.030 − 0.963 ∆𝐷𝑃𝑃𝐻 = 0.067

Calculando el porcentaje de inhibición del radical DPPH para la muestra hidrofilica: 0.067 % 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 = ( ) × 100 1.030 % 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛 = 6.50 Tabla 2. Datos obtenidos de diferente mesa del laboratorio. MUESTRA Y BLANCO HIDROFILICO BLANCO HIDROFILICO LIPOFILICO BLANCO LIPOFILICO

FRESAS(ABS) 0.050 1.077 0.963 1.030

UVAS(ABS) 0.089 1.017 0.734 1.064

Tabla3. Resultados de las 2 mesas del laboratorio:  Hidrofilica: MUESTRA FRESA UVA  Lipofilica: MUESTRA FRESA UVA

∆𝑫𝑷𝑷𝑯 1.027 0.928

% 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊𝒐𝒏 95.36 91.25

∆𝑫𝑷𝑷𝑯 0.067 0.33

% 𝒅𝒆 𝒊𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊𝒐𝒏 6.50 31.02

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES - Este método (DPPH) es uno de los más utilizados para determinar antioxidantes, lo cual proporciona resultados en tiempos relativamente cortos. Su fundamento se basa en medir la capacidad de una muestra de captar radicales libres, reacción que al mismo tiempo se da una transferencia de electrones y de átomos de hidrógeno. El antioxidante es un donador de hidrógeno y el DPPH es un aceptor de hidrógeno estable, el efecto antioxidante es proporcional a la decoración DPPH, en muestras de problemas. - Este laboratorio nos ha ayudado a determinar la capacidad antioxidante en frutas, en el caso de este grupo se determinó en fresas y la otra mesa en uvas. Según nuestros resultados obtenidos mediante el método de DPPH, hemos podido calcular que la disminución de absorbancias debido a los antioxidantes presentes en la fruta ya sea en el extracto hidrofílico o lipofílico. - En el extracto hidrofílico en la fresa según nos lo muestran nuestros resultados, la disminución de absorbancia es mayor que en el lipofílico. En conclusión, esto nos quiere decir que hay una mayor capacidad de antioxidantes en el extracto hidrofílico de la fresa que en el lipofílico. Esta disminución de absorbancia se debe a que el DPPH es un radical desapareado, el cual busca al antioxidante para poder llegar a su estabilidad, ocurre que el antioxidante de la fruta reacciona con el DPPH y este se decolora. - Comparando los resultados obtenidos de la fresa con los de la otra mesa (uva) notamos que en el caso de el extracto hidrofílico la capacidad de antioxidantes es mayor en la fresa y en el caso de la uva, esta tiene mayor capacidad de antioxidantes en el extracto lipofílico.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué compuestos son los responsables de la capacidad antioxidante en cada caso? - La actividad antioxidante es dependiente de los compuestos bioactivos o fitoquímico de la materia prima, por ejemplo: polifenoles, flavonoides, taninos, antocianinas, etc. Mientras más presencia o cuantificación de los C.B. más actividad antioxidante.

REFERENCIAS - Allen RG, tresini M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radic Biol Med. 2000; 28, 463-499. - Llancari, A., Matos, A. Valoración de los nutrientes y antioxidantes en la salud humana e industria alimentaria. En: Universidad Peruana Unión. I Congreso Nacional de Investigación. Perú, Lima, 2-4 noviembre, 2011. - Pastene, E. Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante. Boletín Latinoam Caribe Plantas Med Aromáticas. 2009; 8 (6), 449- 55. - Patthamakanokporn, O., Puwastien, P., Nitithamyong, A., Sirichakwal. P. Changes of antioxidant activity and total phenolic compounds during storage of selected fruits. J Food Composition Analysis. 2008; 21, 241-8. - Quintanar, M., Calderón, J. La capacidad antioxidante total. Bases y Aplicaciones. Rev Educación Bioq. 2009; 28 (3), 89-101.