L3bo Nancy Microbio 2009 N3

L’espèce procaryotique

L’espèce est l’unité taxonomique de base Eucaryotes à reproduction sexuée : Ensemble des individus d’une population capables de se reproduire entre eux et d’engendrer une descendance fertile Jument

Ane

+

Mulet (non fertile)

=

Eucaryotes à reproduction sexuée non étudiée : ensemble d’individus présentant un haut degré de ressemblance entre eux. L’espèce définie doit être nettement séparée des autres espèces.

Chez les procaryotes : Pas de reproduction sexuée.

Descendance non sexuée de type verticale

L’espèce procaryotique est définie par comparaison avec une souche type censée posséder les caractéristiques typiques de l’espèce. Toutes les souches présentant un certain degré de ressemblance avec la souche type appartiendront à la même espèce.

Souche type

L’espèce procaryotique La démarcation entre espèces bactériennes est difficile à définir et peut parfois être arbitraire, anthropocentrique, voire fausse ! Historiquement, la plupart des espèces ont été définies en fonction de leur intérêt pour l’être humain Exemple: Espèces pathogènes définies en fonction de la maladie qu’elles confèrent (Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis…)

Pb : Cette approche ne permet pas de définir un concept de classification applicable à l’énorme majorité des bactéries qui n’ont pas d’intérêt pour l’homme ou qui n’ont pas des caractéristiques marquées

L’approche polyphasique de caractérisation des espèces bactériennes (milieux années 1980)

But: Délimiter, grâce à des conditions standardisées, un ensemble de souches/isolats (préférentiellement) cohérent au niveau génomique et qui partagent un fort degré de similarités sur (beaucoup) d’autres caractères.

Définition actuelle d’une espèce procaryotique

L’espèce polyphasique La taxonomie polyphasique est une approche consensus pour classifier les procaryotes en intégrant diverses informations qui possèdent le moins de contradictions possibles: Intégration de données génomiques: Ex: Hybridation ADN-ADN, DNA fingerprint…

Intégration de données phénotypiques: Ex: composition en acides gras, tests biochimiques, résistances antibiotiques, utilisation de différents composés carbonés ou azotés…

Intégration de données phylogénétiques: Ex: Construction d’arbres phylogénétiques avec un ou plusieurs gènes de ménage…

Pratiquement: Une espèce polyphasique est considérée comme un groupe de souches (incluant la souche type) qui possèdent entre elles un certain degré de cohérence phénotypique, 97% d’identité en 16S rRNA et 70% d’hybridation ADN-ADN

L’espèce polyphasique L’approche polyphasique a l’avantage d’être applicable à tous les procaryotes, sans a priori Elle a permis de corriger quelques erreurs de classification (fragmentation d’une espèce en plusieurs ou regroupement)

Ex: Escherichia coli et Shigella E. coli est une bactérie commensale du tube digestif, mais certaines souches peuvent devenir pathogènes, provoquant par exemple des gastro-entérites Les Shigella sont des pathogènes intestinaux Les études polyphasiques ont révélé que E.coli et 4 espèces de Shigella appartiennent en fait à la même espèce génomique La différence du caractère pathogène s’expliquerait par l’acquisition ou la perte de plasmides portant des gènes de virulence

Rq: la reclassification n’a pas été faite, car cette erreur de classification reste pratique d’un point de vue clinique et évite des confusions en microbiologie médicale

L’hybridation ADN-ADN Technique qui reste considérée comme la pierre angulaire de la caractérisation des espèces procaryotes Repose sur la réassociation de l’ADN de 2 souches, qui est fonction de leur nombre de bases complémentaires

Contrôle

Souche type

Souche type

Souche à tester

Souche type

Extraction ADN Fragmentation (mécanique) et marquage radioactif uniquement de l’ADN de la souche type Dénaturation à la chaleur (ADN simple brin)

Mélange (1500X plus d’ADN de la souche à tester) Diminution de la T° pour permettre la réassociation de l’ADN (ADN double brin) Statistiquement négligeable

Elimination des ADN sb (ex: nuclease S1)

Mesure de radioactivité

Rapport de ces mesures donne le % de réassociation

Mesure de radioactivité

L’hybridation ADN-ADN Autre mesure complémentaire: Au cours de la phase de réassociation, les Tm de l’homoduplexe et de l’hétéroduplexe sont mesurés, c’est-à-dire la T° où la moitié de l’ADN est dénaturé

Tm hétéroduplexe

homoduplexe

Deux souches seront considérées comme appartenant à la même espèce, si : - leur % de réassociation ADN-ADN est supérieur à 70% - Les Tm de l’homoduplexe et de l’hétéroduplexe ne diffèrent pas de plus de 5°C

Une souche caractérisée sous ces seuls critères de réassociation de génome est appelée espèce génomique (ou genospecies). Des données phénotypiques et phylogénétiques supplémentaires sont nécessaires pour caractériser une espèce.

Les méthodes phénotypiques Pris individuellement, ces caractères ne sont pas pertinents pour estimer les relations taxonomiques. Toutefois, pris dans leur ensemble, ils procurent une certaine information. Forme, flagelles, coloration Gram etc… Composition en acides gras, analyse des protéines totales (par SDS-page), spectre de résistances antibiotiques Analyse du métabolisme de différents substrats (carbonés, azotés…). Exemple de résultats métaboliques utilisés pour la caractérisation d’une nouvelle espèce de bactérie

Les méthodes phylogénétiques La phylogénie du gène codant l'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) La comparaison phylogénétique de l’ARNr 16S a été une véritable révolution pour la taxonomie des bactéries !

Le 16S évolue lentement, présent chez toutes les bactéries, généralement en copie unique et très peu de recombinaison Son séquençage est facile et rapide (primers PCR universels) et permet d’avoir une idée rapide sur un isolat Blast et/ou comparaison inconnu Isolat inconnu

Extraction ADN

PCR 16S

Séquençage du produit PCR

phylogénétique avec souches de référence

On considère généralement que 2 isolats appartiennent à la même espèce s’ils ont au moins 97% d’identité en 16S L’information fournie par le 16S n’est néanmoins pas suffisante à elle seule pour caractériser un isolat au niveau de l’espèce !

Le gène de l’ARNr 16S est un excellent marqueur et est le plus utilisé (de loin). Toutefois, il existe également de nombreux autres gènes de ménage répondant aux mêmes caractéristiques et qui possèdent selon les cas un meilleur pouvoir résolutif (recA, dnaK, atpD, gyrB, etc…).

Les méthodes phylogénétiques La MLST (Multi Locus Sequence Typing) Méthode qui repose sur l’utilisation de la séquence de plusieurs gènes pour obtenir une meilleure information phylogénétique comparaison phylogénétique avec souches de référence

PCR 16S

Isolat inconnu

Extraction ADN Concaténation des séquences PCR recA

PCR atpD

Jusqu’à 7 marqueurs différents

Exemple: Avec 7 marqueurs (3399bp concaténées) regroupement de B. mallei et B. pseudomallei et définition de B. thailendensis comme une espèce à part

76% hyb ADN-ADN

B. mallei (pathogène)

B. mallei

44% hyb ADN-ADN

B. pseudomallei

B. thailendensis

(saprophyte)

(saprophyte)

99% identité 16S

Rq: Marqueurs doivent être choisis sur le core génome

MLST

B. pseudomallei

B. thailendensis outgroup

Les limitations de l’espèce polyphasique Long ! Techniquement difficile (hybridation ADN-ADN) Les regroupements restent larges En 16S: 1-2% de divergence, représentent grossièrement 50 Ma 40 Ma

Le polymorphisme génétique de l’espèce polyphasique Génomique comparative de génomes entièrement séquencés de souches d’une même espèce montrent que le contenu en gènes peut être très différent et que certains gènes sont présents ou absents chez les différentes souches Concerne quelques gènes jusqu’à des fractions importantes du génome (15, voire 50%)

Comparaison du génome complet de 3 souches d’une même espèce

Les notions de core génome et de génome accessoire Core génome (gènes d’ossature) : Ces gènes peuvent varier en terme de séquence (allèles) mais sont présents chez toutes les souches de l’espèce. Ils correspondent souvent aux gènes de ménage et sont généralement indispensables ou utiles à l’espèce bactérienne quelque soit ses conditions de vie Leur transmission est majoritairement verticale

Génome accessoire (gènes d’adaptation): Ces gènes sont présents chez certaines souches, mais pas toutes ! Ils sont utiles, voire indispensables, mais uniquement sous certaines conditions environnementales. Ils permettent une adaptation à différentes niches écologiques. Ils sont transmis de manière verticale, mais peuvent être facilement perdus ou acquis de manière horizontale. Ils sont souvent portés par des éléments particuliers (mobilome), permettant leur transfert de manière horizontale entre différentes souches, espèces, genres. La perte ou acquisition de gènes accessoires participe essentiellement au polymorphisme intraspécifique. Exemple: gènes d’interactions (pathogénicité, de symbiose), de résistance (antibiotique, bactériophage, polluants), de synthèse (antibiotique, bactériocine)…

environnement non sélectif (en terme de rat)

Perte de gènes accessoires

Acquisition de nouveaux gènes accessoires

Core génome Génome accessoire

Les échanges génétiques Les procaryotes n’ont pas de reproduction sexuée, mais échangent des gènes de manière unidirectionnelle Chez les eucaryotes, contrairement aux procaryotes, la quasi totalité des gènes présents dans une espèce se retrouve dans les autres espèces du même genre, famille, ordre (98.8% de gènes en commun entre l’homme et le chimpanzé.

Les échanges de gènes chez les procaryotes apportent donc un brassage et une dynamique génétiques importants. C’est une force évolutive très forte! Un transfert horizontal de gène (HGT pour Horizontal Gène Transfer) implique trois étapes successives: 1) Le transfert

2) Le maintien

3) Le succès évolutif de la bactérie ayant acquis de nouvelles séquences

Les échanges génétiques Le transfert La transformation naturelle

La conjugaison

La transduction

(acquisition d’ADN libre)

(Transfert d’ADN entre 2 cellules par contact physique)

(transfert d’ADN par l’intermédiaire d’une particule virale)

Les échanges génétiques Le maintien Cas de séquences chromosomiques (transduction, transformation) : intégration se fait par recombinaison homologue, c’est-à-dire entre séquences très proches. Aboutit généralement au remplacement d’un allèle par un autre

Fragment d’ADN transféré

Chromosome

A’

B’

C’

D’

A

B

C

D

E’

E

A

B’

C’

D’

E

Chromosome recombiné

Un plasmide, un élément intégratif ou un élément transposable devront se répliquer, s’intégrer ou se transposer pour se maintenir.

Les échanges génétiques Le succès évolutif des séquences transférées Si les gènes nouvellement transférés apportent un avantage sélectif important, les organismes récepteurs vont se multiplier de façon plus efficace que les souches concurrentes. HGT expliquent l’émergence de bactéries multirésistantes aux antibiotiques (super bug)

antibiotique2

antibiotique1

Dispersion de la résistance à un antibiotique à différentes espèces Gènes transférés

taxonomie

Phylogénie gène transféré

Ex: Les gènes strAB quasiment identiques en séquence sont retrouvés chez E. coli, Salmonella, Vibrio cholerae, Corynobacterium striatum…

Conclusion Le concept d’espèce tel qu’on l’entend pour les eucaryotes à reproduction sexuée, ne s’applique pas aux procaryotes asexués. De plus, les transferts de gènes et la plasticité génomique importante qu’ils génèrent brouillent encore plus l’image que l’on a de l’espèce procaryote. Si la notion d’espèce procaryote est sujette à débat, elle reste néanmoins primordiale pour pouvoir comprendre la biologie des procaryotes et appréhender leur évolution et leur écologie . L’apparition de la taxonomie polyphasique, malgré des limitations, a permis de fournir un cadre pour étudier la diversité procaryotique de façon standardisée. La différenciation actuelle du génome des bactéries en core génome et génome accessoire permet de pondérer les effets des transferts de gènes lors de la définition de l’espèce.

Le core génome permet d’obtenir information taxonomique plus fiable. L’étude du génome accessoire est intéressante pour comprendre l’écologie et l’adaptation des procaryotes

Le concept de core génome et de génome accessoire appliqué à l’espèce … 2 chevaux

Core génome

Génome accessoire