Kuantitasi Mikrobia Dan Pengukuran Massa Sel Menggunakan Turbidimetrik.docx

KUANTITASI MIKROBIA DAN PENGUKURAN MASSA SEL MENGGUNAKAN TURBIDIMETRIK Mas’arisaldy Khairul Barkatullah1, Nadiya Dwi Rahayu1, Witiyasti Imaningsih2 1. Program studi S1 Biologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jendral Ahmad Yani Km 36, Banjarbaru, 70713, lndonesia 2. Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jendral Ahmad Yani Km 35,8 Banjarbaru, 70713, lndonesia Email: [email protected] Abstrak

Banyak teknik dan cara yang telah ditemukan untuk spesifikasi mikroba, teknik tersebut mengukur jumlah sel, massa sel, atau konstituen lain yang relatif pada jumlah sel. Empat metodologi umum kuantitasi mikrobia adalah direct and indirect count of cells yang direpresentasikan oleh Most Probable Number dan Total Plate Count, serta direct and indirect measurements of microbial biomass yang direpresentasikan oleh turbidimetri. Uji penduga untuk air galon menggunakan media Lactose Broth menunjukkan hasil positif pada semua ukuran sampel (0,1 mL, 1 mL, dan 10 mL), uji penduga untuk air masak menggunakan media Lactose Broth menunjukkan hasil positif hanya pada satu tabung yakni tabung 10 mL dari ketiga ukuran sampel. Penggunaan Brilliant Green Lactose Broth (BGLB) adalah karena bakteri non-koliform tidak dapat tumbuh pada media tersebut disebabkan oleh komposisi BGLB yang mengandung ox bile, seluruh sampel air galon menunjukkan hasil positif sementara pada sampel air masak hanya sampel 10 mL yang menunjukkan hasil positif. Penggunaan Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) pada uji penguat kedua adalah untuk menentukan keberadaan Eschericia coli berdasarkan parameter munculnya warna hijau metalik, berdasarkan hasil yang didapat setelah inkubasi 24 jam adalah semua hasil positif dari uji penguat pertama kembali menunjukkan hasil positif pada uji penguat kedua. Disimpulkan bahwa pertumbuhan E. coli pada air masak jauh lebih sedikit dibanding pertumbuhan E. coli pada air galon. Hal ini diduga karena terjadi kontaminasi pada air galon. Hasil turbidimetri adalah semakin encer suatu media, semakin tinggi persentase transmittance-nya, dan semakin rendah densitas optiknya, semakin sulit bagi mikroba untuk tumbuh sehingga terjadi penurunan dalam jumlah sel per mL, dan semakin berkurang jumlah koloninya. Kata kunci: Kuantitasi, Turbidimetrik, MPN

1. PENDAHULUAN Jumlah kuantitatif mikrobia penting dalam beberapa kondisi. Contohnya, adalah kapasitas untuk menentukan sehatnya makanan atau obat-obatan berdasar pada pengetahuan mengenai mikroorganisme dalam produk tersebut. Banyak teknik dan cara yang telah ditemukan untuk spesifikasi mikroba, teknik tersebut mengukur jumlah sel, massa sel, atau konstituen lain yang relatif pada jumlah sel. Empat metodologi umum kuantitasi mikrobia adalah direct and indirect count of cells yang direpresentasikan oleh Most Probable Number dan Total Plate Count, serta direct and indirect measurements of microbial biomass yang direpresentasikan oleh turbidimetri [1, 2].

Most Probable Number (MPN) adalah prosedur kuantitasi mikrobia yang telah lazim dilakukan untuk mengestimasi jumlah bakteri coliform pada air, susu, dan bahan pangan lainnya. MPN adalah metode statistik yang berdasar atas teori probabilitas. Sampel diencerkan hingga titik kepunahan, yakni titik di mana tidak ada lagi kehidupan mikroorganisme. Untuk mengetahui titik kepunahan, sampel yang telah diencerkan diinokulasi pada medium yang dapat mendukung keberadaan mikroba tersebut. Pola hasil positif yang ditunjukkan pada tiap replikasi dan tabel probabilitas digunakan untuk memperkirakan konsentrasimikroba tiap sampel, oleh karena itu disebut most probable. Tabel statistik MPN terdapat pada replikasi tiga, lima, dan sepuluh tabung bagi tiap pengenceran. Lebih banyak tabung replika yang digunakan, lebih tepat estimasi ukuran populasi mikroba [3, 4]. Pengukuran massa sel secara rapid dapat dilakukan menggunakan metode turbidimetri. Turbidimetri berdasar pada fakta bahwa sel mikrobia menyebarkan cahaya yang menghantam mereka. Karena sel mikrobia dalam suatu populasi umumnya memiliki ukuran sama, jumlah penyebaran cahaya proporsional dengan biomass dari sel yang terdapat dan secara tidak langsung berhubungan dengan jumlah sel. Salah satu karakteristik nampak dari kultur bakteri yang sedang tumbuh adalah kenaikan tingkat kekeruhan medum (turbidity). Ketika konsentrasi bakteri mencapai kira-kira 10 juta sel (107) per mL, medium akan terlihat keruh. Alat yang digunakan untuk mengukur turbiditas adalah spektrofotometer dan nefelometer [5, 6]. 2. METODE PENELITIAN Uji Penduga. 10 mL biakan diinonukulasikan ke dalam 3 tabung medium LB seri ganda. 10 mL biakan diinokulasikan kedalam 3 tabung medium LB seri tunggal. 0,1 mL biakan diinokulasikan ke dalam 3 tabung medium LB seri tunggal. Kemudian semua tabung diinkubasikan pada suhu 35ºC selama 24 jam, bila terbentuk asam dan gas, maka hasilnya dinyatakan positif. Setelah diinkubasi hasil pengamatan dicatat dan menggunakan tabel MPN diestimasi jumlah sel hidup. Hasil tersebut menyatakan MPN coliform. Uji Penguat. Tahap 1, Inokulasikan 1 ose biakan dari setiap tabung uji penduga yang postif, masing-masing ke dalam 2 seri tabung berisi medium BGLB. Inkubasikan satu seri BGLB yang telah diinokulasikan pada suhu 35ºC dan satunya pada suhu 45ºC. Amati terbentuknya asam dan gas setelah 24-48 jam kemudian catat hasil pengamatan, hitung dengan tabel MPN. Hasil tersebut menyatakan MPN coli fecal. Tahap 2, siapkan medium endo agar yang telah dituang ke dalam cawan petri steril. Ambil satu ose biakan dari tabung BGLB yang menunjukkan reaksi positif. Inokulasikan kedalam medium endo agar dengan cara menggoreskan di atas permukaan. Setelah 24-48 jam, diamati adanya koloni bakteri yang berwarna hijau metalik dan catat hasilnya kemudian hitung dengan tabel MPN. Jumlah yang diperoleh tersebut menyatakan MPN coli fecal. Uji Pelengkap. Koloni-koloni yang berwarana hijau metalik diinokulasikan dalam meidum loactose broth dan medium NA miring. Dilakukan pengecatan Gram dan pengecatan spora dari biakan yang ditumbuhkan pada NA miring,

setelah biakan 24 jam. Amati adanya asam dan gas dalam tabung lactose broth yang diinokulasikan dengan koloni yang berwarna hijau metalik. Jika timbul asam dan as, morfologi bakteri berbentuk batang. Hasil pengecatan Gram negatif dan tidak terbentuknya spora, maka bakteri yang diisolasi dari biakan berwarna hijau metalik adalah Escherichia coli. Hitung jumlah E.coli dengan tabel MPN. Pengukuran Massa Sel dengan Turbidimetrik. Melakukan kalibrasi spektrometer sebelum digunakan selama 20 menit. Panjang gelombang diatur pada skala 620 nm. Pelabelan dilakukan untuk 6 tabung spektrimeter dengan menuliskan masing-masinf 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 dan blanko. Gunakan pipet volumetrik 5 mL untuk memindahkan kaldu nutrient cair steril ke dalam masing-masing tabung 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 (catatan teknik aseptik diabaikan). Kocoklah tabung berisi biakan E.coli dalam nutrient cair 40 jam. Dengan pipet volumetrik dipindahkan sebnyak 3 mL biakan E.coli kedalam tabung 1:1 dan 3 mL ke dalam 1:2 dan seterusnya. Dalam teknik ini prosedur aseptik diabaikan dengan catatan tabung-tabung yang berisi biakan yang digunakan harus segera didestruksi. Setelah dilakukan prosedur dilanjutkan kalibrasi spektrofotometer untuk pembacaan kekeruhan sampel-sampel yang akan diukur. Hasil pengukuran kekeruhan sampel (%T) dicatat dalam tabel. Buat grafik yang menyatakan hubungan antara nilai OD dan jumlah organisme/ mL pada lembaran kertas grafik. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1.

Metode MPN untuk Menghitung Jumlah Sel Coliform pada Air Masak dan Air Galon

Beberapa asumsi harus dipahami terlebih dahulu sebelum masuk ke metode MPN. Pertama, diasumsikan bahwa organisme terdistribusi secara acak pada seluruh bagian sampel, artinya, organisme dapat ditemukan pada setiap bagian sampel serta tidak terdapat sifat clumping (menggerombol), attracting (tarik-menarik), dan repelling (menolak) dari organisme tersebut. Asumsi ini penting ketika menimbang bahwa varietas tipe sampel yang terdapat ketika metode MPN digunakan, terlebih lagi ketika sampel terdiri atas zat yang telah ditentukan. Kedua, diasumsikan bahwa tiap alikuot dari sampel akan menunjukkan pertumbuhan saat alikuot tersebut mengandung satu mikroorganisme atau lebih dan alikuot tersebut diinkubasi dalam media pertumbuhan yang “cocok”. Ketiga, diasumsikan bahwa tidak terjadi kontaminasi [7]. Tabel 1. Hasil uji penduga jumlah coliform pada media Lactose Broth (LB) menggunakan metode Most Probable Number (MPN) Jumlah tabung MPN Indeks No Sampel Media LB positif (MPN/100 mL) DS 10 mL 3 1.

2.

Air galon

Air masak

SS 1,0 mL

3

SS 0,1 mL

3

DS 10 mL

1

SS 1,0 mL

0

>1100

4

SS 0,1 mL Tabel 2. Hasil uji penduga No. Sampel Kekeruhan + AG 0,1 mL + + + 1. AG 1,0 mL + + + AG 10 mL + +

AM 0,1 mL

2.

AM 1 mL

AM 10 mL

0

Gelembung + + + + + + + + +

+ -

Gambar

+ -

Uji penduga untuk air galon menggunakan media Lactose Broth menunjukkan hasil positif pada semua ukuran sampel (0,1 mL, 1 mL, dan 10 mL). Parameter hasil positif atau negatif adalah kekeruhan media dan terbentuknya gelembung, kekeruhan (degree of turbidity) ini diakibatkan oleh sifat mikroba yang mengkeruhkan media, sementara produksi gas dapat dideteksi oleh Durham tube yang dibalik. Uji penduga untuk air masak menggunakan media Lactose Broth menunjukkan hasil positif hanya pada satu tabung yakni tabung 10 mL dari ketiga ukuran sampel. Maka, dengan menggunakan MPN table, diestimasi bahwa dalam 100 mL sampel air galon terdapat lebih dari 1100 sel mikrobia yang hidup sementara dalam 100 mL sampel air masak terdapat 4 sel mikrobia yang hidup. Karena kedua sampel menunjukkan hasil positif akan keberadaan coliform maka dilanjutkan uji penguat pertama [8]. Tabel 3. Hasil uji penguat I jumlah coliform pada media Brilliant Green Lactose Broth (BGLB) No Jumlah tabung MPN Indeks Sampel Media BGLB . positif (MPN/100 mL) DS 10 mL 3 1.

Air galon

SS 1,0 mL

3

SS 0,1 mL

3

>1100

2.

Air masak

DS 10 mL

3

SS 1,0 mL

0

SS 0,1 mL

0

Tabel 4. Hasil uji penguat I No. Sampel AG 0,1 mL 1. AG 1,0 mL

AG 10 mL

AM 0,1 mL

2.

AM 1 mL

AM 10 mL

Kekeruhan + + + + + +

23

Gambar

+ + + + + +

Penggunaan Brilliant Green Lactose Broth (BGLB) adalah karena bakteri non-koliform tidak dapat tumbuh pada media tersebut disebabkan oleh komposisi BGLB yang mengandung ox bile. Parameter positif adalah ketika terjadi kekeruhan pada BGLB. Sama seperti uji penduga, seluruh sampel air galon menunjukkan hasil positif sementara pada sampel air masak hanya sampel 10 mL yang menunjukkan hasil positif. Maka, dengan menggunakan MPN table diestimasi bahwa pada air galon terdapat lebih dari 1100 sel hidup dalam 100 mL sampel sementara pada air masak terdapat 23 sel hidup dalam 100 mL sampel. Karena kedua sampel menunjukkan hasil positif akan keberadaan coliform maka dilanjutkan uji penguat kedua [9]. Tabel 5. Hasil uji penguat II pada media Eosin Methilen Blue Agar (EMBA) No Sampel Hijau metalik

AG 0,1 mL

1.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

AG 1 mL

AG 10 mL

2.

AM 10 mL

Penggunaan Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) pada uji penguat kedua adalah untuk menentukan keberadaan Eschericia coli berdasarkan parameter munculnya warna hijau metalik (metallic green sheen) yang diakibatkan sifat metakromatik dari penyusun EMBA yakni eosin dan methylene blue, pergerakan E. coli yang mengginakan flagella, dan produk fermentasi berupa asam kuat. Berdasarkan hasil yang didapat setelah inkubasi 24 jam adalah semua hasil positif dari uji penguat pertama kembali menunjukkan hasil positif pada uji penguat kedua, hasil ini menurut literatur berarti pada sampel air galon dan air masak terdapat E. coli [10]. Mengacu pada asumsi yang diberikan yakni distribusi mikrobia terjadi secara acak, tiap alikuot tumbuh di media yang cocok, dan tidak terjadi kontaminasi serta melihat pada hasil uji penduga, uji penguat I, dan uji penguat II dapat dilihat bahwa pertumbuhan E. coli pada air masak jauh lebih sedikit dibanding pertumbuhan E. coli pada air galon. Hal ini diduga karena terjadi kontaminasi pada air galon dalam prosedur pengumpulan air, transportasi air, atau

penyimpanan air, sementara air dari pipa yang dimasak (piped water) memiliki kualitas air yang jauh lebih tinggi [11]. 3.2.

Pengukuran Massa Spektrofotometer

Sel

dengan

Turbidimetrik

menggunakan

Tabel 6. Pengukuran kekeruhan suspensi shift 1 Pengenceran Blanko 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16

%T 92 79,2 87,6 90,4 92,8 100,4

Optical Density (OD) 0,04 0,10 0,06 0,04 0,03 0,00

Tabel 7. Pengukuran kekeruhan suspensi shift 2 Pengenceran Blanko 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16

%T 91,8 72,2 84,4 89,6 90,8 90,6

Optical Density (OD) 0,04 0,14 0,07 0,05 0,04 0,04

Prinsip dasar spektrofotometer adalah pengukuran densitas optik (OD) yang didapat dari transmittance (%T) atau berapa persen cahaya yang dapat melewati kekeruhan sampel. Karena wavelength yang digunakan pada praktikum ini adalah 620 nm maka diasumsikan perhitungan massa menggunakan UV-visible spectrophotometer. Berdasarkan waktu pengamatan spektrofotometri, hasil dibagi menjadi dua shift, dan tiap shift dibagi menjadi enam pengenceran. Dari pembagian ini dapat terbentuk suatu kurva distribusi sesuai dengan hasil perhitungan densitas optik. Pada shift pertama, pengenceran blanko menunjukkan hasil transmittance 92, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,04; pengenceran 1:1 menunjukkan hasil transmittance 79,2, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,10; pengenceran 1:2 menunjukkan hasil transmittance 87,6, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,06; pengenceran 1:4 menunjukkan hasil transmittance 90,4, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,04; pengenceran 1:8 menunjukkan hasil transmittance 92,8, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,03; dan pengenceran 1:16 menunjukkan hasil transmittance 100,4, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,00. Pada shift kedua, pengenceran blanko menunjukkan hasil transmittance 91,8, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,04; pengenceran 1:1 menunjukkan hasil transmittance 72,2, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,14; pengenceran 1:2 menunjukkan hasil transmittance 84,4, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,07; pengenceran 1:4 menunjukkan hasil transmittance 89,6, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,05; pengenceran 1:8 menunjukkan hasil transmittance 90,8, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya

adalah 0,04; dan pengenceran 1:16 menunjukkan hasil transmittance 90,6, setelah dimasukkan dalam perhitungan ditemukan OD-nya adalah 0,04 [12]. Kedua hasil tersebut menunjukkan bahwa semakin encer suatu media, semakin tinggi persentase transmittance-nya, dan semakin rendah densitas optiknya. Dapat diduga bahwa semakin encer suatu media maka semakin sulit mikroba dapat tumbuh. Hal ini sesuai literatur yang menyatakan media yang telah mengalami serial dilution akan sulit ditumbuhi mikroba kecuali untuk mikroba tertentu, maka dari itu serial dilution adalah salah satu cara isolasi mikroba [13]. 3.3.

Pengukuran Massa Haemositometer

Sel

dengan

Turbidimetrik

menggunakan

Tabel 8. Jumlah sel dan rata-rata sel E. coli shift 1 Jumlah sel Eschericia coli pada kotak dalam haemositometer (sel/mL) Kotak Kanan Bawah

Jumlah

Kotak Tengah

Kotak Kanan Atas

RataRata

441

506

422

479

519,96

103,99

18

54

28

20

83

48,23

9,65

1:4

69

52

102

85

89

90,07

18,01

1:8

34

38

34

44

12

37,44

7,49

1:16

0

0

0

0

0

0,00

0,00

Pengenceran

Kotak Kiri Atas

Kotak Kiri Bawah

1:1

414

1:2

Tabel 9. Jumlah sel dan rata-rata sel E. coli shift 2 Jumlah sel Eschericia coli pada kotak dalam haemositometer (sel/mL) Kotak Kanan Bawah

Jumlah

Kotak Tengah

Kotak Kanan Atas

RataRata

607

353

528

567

701,48

140,30

167

226

286

201

174

237,76

47,55

1:4

80

86

82

80

69

91,87

18,37

1:8

3

3

10

3

3

4,60

0,92

1:16

3

5

5

3

8

5,55

1,11

Pengenceran

Kotak Kiri Atas

Kotak Kiri Bawah

1:1

878

1:2

Pengukuran menggunakan haemositometer memungkinkan untuk menghitung jumlah sel atau partikel dalam volume zat cair tertentu, yang artinya konsentrasi sel secara keseluruhan dalam zat cair tersebut juga dapat dihitung. Wilayah berpetak haemositometer terdiri atas sembilan kotak berukuran 1 mm2 yang dibagi menjadi tiga arah: 0,0625 mm2, 0,05 mm2, dan 0,04 mm2. Kotak tengah dibagi lagi menjadi 0,0025 mm2. Setelah didapat jumlah sel pada masingt masing petak, digunakan rumus ( ) untuk mendapatkan jumlah sel tiap satu n×0,25

mL. Pada kedua hasil yang diamati yakni hasil dari shift 1 dan shift 2 terjadi kecenderungan menurunnya jumlah sel tiap satu mL yang berbanding lurus dengan semakin encer biakan yang diamati. Pada pengenceran 1:1 shift 1 mendapatkan jumlah sel 519,96 dan shift 2 mendapatkan jumlah sel 701,48; pada pengenceran 1:2 shift 1 mendapatkan jumlah sel 48,23 dan shift 2 mendapatkan jumlah sel 237,76; pada pengenceran 1:4 shift 1 mendapatkan jumlah sel 90,07 dan shift 2 mendapatkan jumlah sel 91,87; pada pengenceran 1:8 shift 1 mendapatkan jumlah sel 37,44 dan shift 2 mendapatkan jumlah sel 4,60; dan pada pengenceran 1:16 shift 1 tidak menemukan sel dan shift 2 mendapatkan jumlah sel 5,55. Penurunan drastis pada pengenceran 1:2 dari shift 1 diduga disebabkan kondisi mikroskop yang tidak optimal sehingga praktikan tidak dapat mengamati dengan jelas jumlah sel dalam haemositometer. Seperti pada perhitungan menggunakan spektrofotometer, diduga semakin encer suatu medium semakin sulit bagi mikroba untuk tumbuh sehingga terjadi penurunan dalam jumlah sel per mL [14] 3.3.

Pengukuran Jumlah Sel dengan Total Plate Count (TPC)

Tabel 10. Hasil isolasi tanah buah Tipe koloni yang diperoleh Karakterist Tanah Tanah Buah 10Tanah Buah -4 4 ik Buah 10 10-5 (NA) 1 (NA) 1 (NA) 2 Jumlah 7 14 6 Koloni

Tanah Buah 10-5 (NA) 2 1

Cawan Petri

Tabel 11. Hasil isolasi tanah sampah Tipe koloni yang diperoleh Karakterist Tanah Sampah Tanah Sampah Tanah Sampah ik 10-4 (NA) 1 10-4 (NA) 2 10-5 (NA) 1 Jumlah 304 256 81 Koloni

Tanah Sampah 10-5 (NA) 2 166

Cawan Petri

Tabel 10. Perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Standard Plate Count (SPC) Jumlah No. Sampel Pengenceran SPC (CFU’s.mL-1) koloni 1. Tanah Buah SP 10-4 7 0,7x10-6

2.

Tanah Sampah

SP 10-4’ SP 10-5 SP 10-5’ PP 10-4 SP 10-4’ PP 10-5 SP 10-5’

14 6 1 304 256 81 166

1,4x10-6 6x10-6 1x10-6 3,04x10-6 25,6x10-6 8,1x10-6 166x10-6

Perhitungan jumlah koloni menggunakan Plate Count adalah metode enumerasi organisme aerobik dan mesofilik yang tumbuh pada kondisi aerobik dalam temperatur dari 20ºC hingga 45ºC. Pada sampel tanah buah, jumlah koloni pengenceran 10-4 memiliki jumlah koloni lebih banyak dibanding pengenceran 105 , begitu juga pada tanah sampah. Namun secara komparatif jumlah koloni pada tanah sampah jauh lebih banyak dibanding jumlah koloni pada tanah buah. Hasil ini menunjukkan bahwa setiap pengenceran mengurangi jumlah koloni bakteri serta mempengaruhi hasil dari SPC [15]. 4. KESIMPULAN Uji penduga untuk air galon menggunakan media Lactose Broth menunjukkan hasil positif pada semua ukuran sampel (0,1 mL, 1 mL, dan 10 mL), uji penduga untuk air masak menggunakan media Lactose Broth menunjukkan hasil positif hanya pada satu tabung yakni tabung 10 mL dari ketiga ukuran sampel. Seluruh sampel air galon pada uji penguat menunjukkan hasil positif sementara pada sampel air masak hanya sampel 10 mL yang menunjukkan hasil positif. Hasil yang didapat setelah inkubasi 24 jam adalah semua hasil positif dari uji penguat pertama kembali menunjukkan hasil positif pada uji penguat kedua. Disimpulkan bahwa pertumbuhan E. coli pada air masak jauh lebih sedikit dibanding pertumbuhan E. coli pada air galon. Hal ini diduga karena terjadi kontaminasi pada air galon. Hasil turbidimetri adalah semakin encer suatu media, semakin tinggi persentase transmittance-nya, dan semakin rendah densitas optiknya, semakin sulit bagi mikroba untuk tumbuh sehingga terjadi penurunan dalam jumlah sel per mL, dan semakin berkurang jumlah koloninya. DAFTAR PUSTAKA [1]

Andrews, J. H. 2017. Comparative Ecology of Microorganisms and Macroorganisms. Springer, New York.

[2]

Goldman, E., & L. H. Green. 2015. Practical Handbook of Microbiology. CRC, London.

[3]

Sant’ana, A. S. 2017. Quantitative Microbiology in Food Processing: Modeling the Microbial Ecology. John Wiley & Sons, New York.

[4]

Hurst, C. J. 2017. Modeling the Transmission and prevention of Infectious Disease. Springer, New York.

[5]

Lunblad, R. L., & F. MacDonald. 2018. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. CRC, London.

[6]

Rae, P. 2018. Clinical Biochemistry Lecture Notes. John Wiley & Sons, New York.

[7]

Fasman, G. D. 2018. Handbook of Biochemistry: Physical Chemical Data. CRC, London.

[8]

Heidrich, E. S., T. P. Curtis, S. Woodcock, and J. Dolfing. 2016. Quantification of effective exoelectrogens by most probable number (MPN) in a microbial fuel cell. Bioresource technology 218(2016): 27-30.

[9]

Romesberg, J., & Henderson, J. O. 2018. Analysis of Total Coliform and Total Escherichia coli Levels in the Fox River Watershed. Journal of Student Research, 6(2): 66-70.

[10] Batabyal, Kunal, A. Banerjee, S. Pal, S. Dey, S. N. Joardar, I. Samanta, D. P. Isore, & A. D. Singh. 2018. Detection, characterization, and antibiogram of extended-spectrum beta-lactamase Escherichia coli isolated from bovine milk samples in West Bengal, India. Veterinary World 11(10): 1423-1427. [11] Shields, K. F., R. E. S. Bain, R. Cronk, J. A. Wright, & J. Bartram. 2015. Association of supply type with fecal contamination of source water and household stored drinking water in developing countries: a bivariate meta-analysis. Environmental Health Perspectives 123(12): 1222-1231. [12] Jackson, A. R. W., J. M. Jackson, H. Mountain, & D. Brearley. 2017. Forensic Science. Pearson Education, London. [13] Teixeira, M. G., & J. L. Zatz. 2017. Pharmaceutical Calculations. John Wiley & Sons, New York. [14] Stopa, P. J., & M. A. Bartoszcze. 2015. Rapid Methods for Analysis of Biological Materials in the Environment. Springer, New York. [15] Pitt, S. J. 2018. Clinical Microbiology for Diagnostic Laboratory Scientists. Wiley-Blackwell, New York.

LAMPIRAN PERHITUNGAN A. PERHITUNGAN SHIFT 1 Perhitungan Optical Density Pengenceran Blanko

Pengenceran 1:4

OD = 2– log %T OD = 2– log 92 OD = 0,04

OD = 2– log %T OD = 2– log 90,4 OD = 0,04

Pengenceran 1:1

Pengenceran 1:8

OD = 2– log %T OD = 2– log 79,2 OD = 0,10

OD = 2– log %T OD = 2– log 92,8 OD = 0,03

Pengenceran 1:2

Pengenceran 1:16

OD = 2– log %T OD = 2– log 87,6 OD = 0,06

OD = 2– log %T OD = 2– log 100,4 OD = 0,00

Perhitungan jumlah sel Eschericia coli menggunakan haemositometer Pengenceran 1:1

Rata-rata (x̄):

Kotak kiri atas

519,96 5

Jumlah sel/mL t

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

= 103,99

Pengenceran 1:2

414

= (n×0,25) = (16×0,25) = 103,50

Kotak kiri atas

Kotak kiri bawah

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

= (n×0,25) = (16×0,25) = 4,50

t

t

441

= (n×0,25) = (16×0,25) = 110,25

18

Kotak kiri bawah

Kotak tengah

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

= (n×0,25) = (16×0,25) = 13,50

t

=(

n×0,25

)=(

t

506

) = 80,96

25×0,25

54

Kotak tengah

Kotak kanan atas

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

= (n×0,25) = (25×0,25) = 4,48

t

t

422

= (n×0,25) = (16×0,25) = 105,50

28

Kotak kanan atas

Kotak kanan bawah

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

= (n×0,25) = (16×0,25) = 5,00

t

=(

n×0,25

)=(

479

t

) = 119,75

16×0,25

20

Kotak kanan bawah

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 103,50+110,25+80,96+105,50+119,75 = 519,96

=

Jumlah sel/mL t

Jumlah sel/mL 83

t

38

= (n×0,25) = (16×0,25) = 20,75

= (n×0,25) = (16×0,25) = 9,50

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 4,50+13,50+4,48+5,00+20,75 = 48,23

Kotak tengah

Rata-rata (x̄): 48,23 5

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

=

= 9,65

Jumlah sel/mL t

Kotak kanan atas

Pengenceran 1:4

Jumlah sel/mL

Kotak kiri atas

t

t

Kotak kanan bawah

69

= (n×0,25) = (16×0,25) = 17,25

Jumlah sel/mL

Kotak kiri bawah

t

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 8,50+9,50+5,44+11,00+3,00 = 37,44

52

= (n×0,25) = (16×0,25) = 13,00 Kotak tengah

Rata-rata (x̄):

Jumlah sel/mL t n×0,25

)=(

102

12

= (n×0,25) = (16×0,25) = 3,00

Jumlah sel/mL t

44

= (n×0,25) = (16×0,25) = 11,00

Jumlah sel/mL

=(

34

= (n×0,25) = (25×0,25) = 5,44

37,44

) = 16,32

5

25×0,25

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

= 7,49

Kotak kanan atas

Pengenceran 1:16

Jumlah sel/mL

Kotak kiri atas

t

85

Jumlah sel/mL

= (n×0,25) = (16×0,25) = 21,25

t

0

Kotak kanan bawah

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0

Jumlah sel/mL

Kotak kiri bawah

t

89

= (n×0,25) = (16×0,25) = 22,25

Jumlah sel/mL

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 17,25+13,00+16,32+21,25+22,25 = 90,07

Kotak tengah

Rata-rata (x̄): 90,07 5

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

= 18,01

=

0

Jumlah sel/mL t

0

= (n×0,25) = (25×0,25) = 0 Kotak kanan atas

Pengenceran 1:8 Kotak kiri atas Jumlah sel/mL t

t

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0

34

= (n×0,25) = (16×0,25) = 8,50 Kotak kiri bawah

Jumlah sel/mL t

0

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0 Kotak kanan bawah Jumlah sel/mL t

0

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0

=

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 0+0+0+0+0 = 0

Rata-rata (x̄): 0 5

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

=

=0

B. PERHITUNGAN SHIFT 2 Perhitungan Optical Density Pengenceran Blanko

Pengenceran 1:4

OD = 2– log %T OD = 2– log 91,8 OD = 0,04

OD = 2– log %T OD = 2– log 89,6 OD = 0,05

Pengenceran 1:1

Pengenceran 1:8

OD = 2– log %T OD = 2– log 72,2 OD = 0,14

OD = 2– log %T OD = 2– log 90,8 OD = 0,04

Pengenceran 1:2

Pengenceran 1:16

OD = 2– log %T OD = 2– log 84,4 OD = 0,07

OD = 2– log %T OD = 2– log 90,6 OD = 0,04

Perhitungan jumlah sel Eschericia coli menggunakan haemositometer Pengenceran 1:1 Kotak kiri atas

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 219,50+151,75+56,48+132,00+141,75 = 701,48

Jumlah sel/mL

Rata-rata (x̄):

t

878

= (n×0,25) = (16×0,25) = 219,50 Kotak kiri bawah Jumlah sel/mL t

607

= (n×0,25) = (16×0,25) = 151,75 Kotak tengah Jumlah sel/mL t

353

= (n×0,25) = (25×0,25) = 56,48 Kotak kanan atas Jumlah sel/mL t

528

= (n×0,25) = (16×0,25) = 132,00 Kotak kanan bawah Jumlah sel/mL t

567

= (n×0,25) = (16×0,25) = 141,75

701,48 5

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

= 140,30

Pengenceran 1:2 Kotak kiri atas Jumlah sel/mL t

167

= (n×0,25) = (16×0,25) = 41,75 Kotak kiri bawah Jumlah sel/mL t

226

= (n×0,25) = (16×0,25) = 56,50 Kotak tengah Jumlah sel/mL t

286

= (n×0,25) = (25×0,25) = 45,76 Kotak kanan atas

=

Jumlah sel/mL t

Jumlah sel/mL

201

t

3

= (n×0,25) = (16×0,25) = 50,25

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0,75

Kotak kanan bawah

Kotak kiri bawah

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

t

174

t

= (n×0,25) = (16×0,25) = 43,50

3

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0,75

Kotak tengah Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 41,75+56,50+45,76+50,25+43,50 = 237,76 Jumlah sel/mL Rata-rata (x̄): 237,76 5

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

t

=

Kotak kanan atas

= 47,55

Jumlah sel/mL

Pengenceran 1:4

t

Kotak kanan bawah

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

80

= (n×0,25) = (16×0,25) = 20,00

t

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 0,75+0,75+1,60+0,75+0,75 = 4,60

Jumlah sel/mL t n×0,25

)=(

86

) = 21,50

16×0,25

Rata-rata (x̄):

Kotak tengah

4,60

Jumlah sel/mL t

3

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0,75

Kotak kiri bawah =(

3

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0,75

Kotak kiri atas t

10

= (n×0,25) = (25×0,25) = 1,60

5

82

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

= 0,92

= (n×0,25) = (25×0,25) = 13,12

Pengenceran 1:16

Kotak kanan atas

Kotak kiri atas

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

t

80

t

3

= (n×0,25) = (16×0,25) = 20,00

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0,75

Kotak kanan bawah

Kotak kiri bawah

Jumlah sel/mL

Jumlah sel/mL

t

69

t

5

= (n×0,25) = (16×0,25) = 17,25

= (n×0,25) = (16×0,25) = 1,25

Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 20,00+21,50+13,12+20,00+17,25 = 91,87

Kotak tengah

Rata-rata (x̄): 91,87 5

∑ (Jumlah sel tiap kotak)

= 18,37

Pengenceran 1:8 Kotak kiri atas

n

Jumlah sel/mL t

=

5

= (n×0,25) = (25×0,25) = 0,80 Kotak kanan atas Jumlah sel/mL t

3

= (n×0,25) = (16×0,25) = 0,75 Kotak kanan bawah

=

Jumlah sel/mL t

8

= (n×0,25) = (16×0,25) = 2,00 Jumlah (∑ Jumlah sel tiap kotak): 0,75+1,25+0,80+0,75+2,00 = 5,55 Rata-rata (x̄): 5,55 5

= 1,11

∑ (Jumlah sel tiap kotak) n

=