Kromatografi Gas.docx

KROMATOGRAFI GAS

GC (Gas Chromatography) yang biasa disebut juga Kromatografi gas (KG) merupakan teknik instrumental yang dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an. GC merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-senyawa gas anorganik dalam suatu campuran Perkembangan teknologi yang signifikan dalam bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi yang meningkat. (3) GC menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya. Ada 2 jenis kromatografi gas, yaitu :

1. Kromatografi gas–cair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam. 2. Kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa polimerik.

1. Kontrol dan penyedia gas pembawa; 2. ruang suntik sampel; 3. kolom yang diletakkan dalam oven yang dikontrol secara termostatik; 4. sistem deteksi dan pencatat (detektor dan recorder); serta 5. komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data.

Sistem Kromatografi Gas 1. Fase gerak Fase gerak pada GC juga disebut dengan gas pembawa karena tujuan awalnya adalah untuk membawa solut ke kolom, karenanya gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas pembawa adalah: tidak reaktif; murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor; dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (biasanya merah untuk hidrogen, dan abu-abu untuk nitrogen) 4).

2. Ruang suntik sampel Lubang injeksi didesain untuk memasukkan sampel ecara cepat dan efisien. Desain yang populer terdiri atas saluran gelas yang kecil atau tabung logam yang dilengkapi dengan septum karet pada satu ujung untuk mengakomodasi injeksi dengan semprit (syringe). Karena helium (gas pembawa) mengalir melalui tabung, sejumlah volume cairan yang diinjeksikan (biasanya antara 0,1-3,0 μL) akan segera diuapkan untuk selanjutnya di bawa menuju kolom. Berbagai macam ukuran semprit saat ini tersedia di pasaan sehingga injeksi dapat berlangsung secara mudah dan akurat. Septum karet, setelah dilakukan pemasukan sampel secara berulang, dapat diganti dengan mudah. Sistem pemasukan sampel (katup untuk mengambil sampel gas) dan untuk sampel padat juga tersedia di pasaran(1). Pada dasarnya, ada 4 jenis injektor pada kromatografi gas, yaitu: a. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang diinjeksikan akan diuapkan dalam injector yang panas dan 100 % sampel masuk menuju kolom. b. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan diuapkan dalam injector yang panas dan selanjutnya dilakukan pemecahan. c. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana hampir semua sampel diuapkan dalam injector yang panas dan dibawa ke dalam kolom karena katup pemecah ditutup; dan d. Injeksi langsung ke kolom (on column injection), yang mana ujung semprit dimasukkan langsung ke dalam kolom. Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap; karena kalau penyuntikannya melalui lubang suntik secara langsung dikhawatirkan akan terjadi peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi atau pirolisis(2).

3. Kolom Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada GC. Ada 3 jenis kolom pada GC yaitu kolom kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column); dan kolom preparative (preparative column). Perbandingan kolom kemas dan kolom kapiler dtunjukkan oleh gambar berikut :

Kolom kemas terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium. Panjang kolom jenis ini adalah 1–5 meter dengan diameter dalam 1-4 mm. Kolom kapiler sangat banyak dipakai karena kolom kapiler memberikanefisiensi yang tinggi (harga jumlah pelat teori yang sangat besar > 300.000 pelat). Kolom preparatif digunakan untuk menyiapkan sampel yang murni dari adanya senyawa tertentu dalam matriks yang kompleks. Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-5) dan fenil 5%-metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL-8). Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50%-metilpolisiloksan 50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CPWAX; Carbowax-20M).

4. Detektor Komponen utama selanjutnya dalam kromatografi gas adalah detektor. Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fase diam dan fase gerak. Pada garis besarnya detektor pada KG termasuk detektor diferensial, dalam arti respons yang keluar dari detektor memberikan relasi yang linier dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang teresolusi. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik komponen-komponen oleh GC disajikan oleh detektor sebagai deretan luas puncak terhadap waktu. Waktu tambat tertentu dalam kromatogram dapat digunakan sebagai data kualitatif, sedangkan luas puncak dalam kromatogram dapat dipakai sebagai data kuantitatif yang keduanya telah dikonfirmasikan dengan senyawa baku. Akan tetapi apabila kromatografi gas digabung dengan instrumen yang multipleks misalnya GC/FTIR/MS, kromatogram akan disajikan dalam bentuk lain.

5. Komputer Komponen GC selanjutnya adalah komputer. GC modern menggunakan komputer yang dilengkapi dengan perangkat lunaknya (software) untuk digitalisasi signal detektor dan mempunyai beberapa fungsi antara lain:    

Memfasilitasi setting parameter-parameter instrumen seperti: aliran fase gas; suhu oven dan pemrograman suhu; serta penyuntikan sampel secara otomatis. Menampilkan kromatogram dan informasi-informasi lain dengan menggunakan grafik berwarna. Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan dengan statistik. Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa tertentu

DERIVATISASI Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifatsifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas (menjadi lebih mudah menguap). Alasan dilakukannya derivatisasi:  



  

Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis dengan GC terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya. Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal puncak kromatogram saling tumpang tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan GC. Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi adalah untuk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatil). Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap karena adanya gaya tarik-menarik inter molekuler antara gugus-gusug polar karenanya jika gugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi akan mampu meningkatkan volatilitas senyawa tersebut secara dramatis. Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid. Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi parsial karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan stabilitasnya. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap elektron (ECD).

Inilah contoh derivatisasi yang digunakan untuk memperbaiki bentuk puncak pseudoefedrin:

Caranya: Sirup dekongestan dibasakan dengan amonia dan diekstraksi ke dalam etil asetat sehingga akan menjamin bahwa semua komponen yang terekstraksi berada dalam bentuk basa bebasnya daripada bentuk garamnya. Bentuk basa inilah yang bertanggungjawab pada bagusnya bentuk puncak kromatografi. Garam-garam atau basa-basa akan terurai karena adanya panas pada lubang suntik GC, sehingga dengan adanya proses ini akan dapat menyebabkan terjadinya peruraian. Jika ekstrak pada sirup dekongestan di lakukan kromatografi gas secara langsung maka kromatogram yang dihasilkan seperti gambar dibawah. Basa bebas triprolidin dan dekstrometorfan menunjukkan bentuk puncak yang bagus, akan tetapi pesudoefedrin yang merupakan basa yang lebih kuat karena adanya gugus hidroksil dan gugus amin memberikan bentuk puncak yang kurang bagus. Hal ini dapat diatasi dengan menutup gugus polar (gugus hidroksi dan amin) pada pseudoefedrin dengan cara mereaksikannya menggunakan trifluoroasetat anhidrida (TFA). Perlakuan dengan TFA ini tidak menghasilkan senyawa derivatif terhadap senyawa-senyawa basa tersier dalam ekstrak (sirup dekongestan) ini.

Reagen TFA ini sangat bermanfaat karena reagen ini sangat reaktif dan bertitik didih rendah (400C) sehingga kelebihan reagen TFA ini mudah dihilangkan dengan cara evaporasi sebelum dilakukan kromatografi gas. Ini kromatogram sebelum dilakukan derivatisasi

Yang derivatisasi.

Sumber: http://lansida.blogspot.com/2010/06/gc-kromatografi-gas.html

ini kromatogram

sesudah

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1.1. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawasenyawa kiral.

1.2 Jenis- Jenis HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi) Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi penukar ion HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekulmolekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

1.3 Instrument HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini : 1.3.1 Wadah fase gerak (Reservoir) Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

v Fase Gerak Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

v Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. 2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. 3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. 4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise). 6. Sesuai dengan detector.

v Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter. b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril. Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

1.3.2 Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Ø Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC: a)

Pompa reciprocating Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b)

Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c)

Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

1.3.3 Tempat Injeksi Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Ø Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan : a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Ø Syarat- syarat injektor yang baik : 

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin



Mudah digunakan



Keberulangan tinggi



Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

1.3.4 Kolom Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: Ø Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit). Ø Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Ø Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

v Fase Diam Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

1.3.5 Detektor Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel; b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil; c. stabil dalam pengopersiannya; d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Pendeteksian

Jenis

Maksimum sensitifitas

Peka terhadap Sensitivitas suhu kecepatan alir

Absorbsi UV

Spesifik

2 x 10-16

Tidak

Rendah

Absorbsi IR

Spesifik

10-6

Tidak

Rendah

Flourometri

Spesifik

10-11

Tidak

Rendah

Indek bias

Umum

1 x 10-7

Tidak

+ 10-4 0 C

Konduktometri

Spesifik

10-8

Ya

2% 0C

Spektometri massa

Umum

10-10

Tidak

Tidak ada

elektrokimia

Spesifik

10-12

Ya

1,5% 0C

1.4 Prinsip Kerja HPLC Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam. HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama. Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil. Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.