Klebsiella

BAKTERIOLOGI III LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM NEGATIF (-) BASIL PENYEBAB SALURAN PENCERNAAN, SALURAN NAFAS DAN UROGENITAL (Klebsiella pneumoniae)

Disusun oleh : PUTU HAWIDYA NANDA NPM : 411117093

PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN (D-3) STIKES JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI 2018/2019

A. TANGGAL PRAKTIKUM Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi STIKES Jenderal Achmad Yani Cimahi pada tanggal 19, 20, dan 21 Maret 2019. B. TEORI DASAR Bakteri ini berasal dari family Enterobacteriaceae. Klebsiella pertama kali diteliti dan diberi nama oleh bacteriologist Jerman yang bernama Edwin Klebs (1834-1913). Penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri ini antara lain adalah bronkopneumoniae dan pneumonia. Hampir semua pneumonia disebabkan oleh bakteri ini. Klebsiella pneumonia terdapat dalam saluran nafas dan feses sekitar 5 % orang normal dan dapat menyebabkan pneumonia bacterial (Patrick, 2005; Elmer, 2006)). Taksonomi dari Klebsiella pneumonia : Domain

: Bacteria

Phylum

: Proteobacteria

Class

: Gamma Proteobacteria

Ordo

: Enterobacteriales

Family

: Enterobacteriaceae

Genus

: Klebsiella

Species

: Klebsiella pneumoniae (Ramsey, 2011)

Klebsiella pneumoniae merupakan suatu bakteri gram negatif yang tidak bergerak (non motil), tidak berselubung, melakukan fermentasi laktosa, fakultatif anaerob, ditemukan sebagai flora normal di mulut, kulit dan usus. Spesies Klebsiella menunjukkan pertumbuhan mukoid, simpai polisakarida yang besar, tidak ada pergerakan dan biasanya memberikan hasil positif untuk tes dekarboksilase lisin dan sitrat. Morfologi khas dari Klebsiella dapat dilihat dalam pertumbuhan padat in vitro tetapi morfologinya sangat bervariasi dalam bahan klinik (Podscun, 1998). Tes identifikasi Klebsiella sp. Prinsip identifikasi Klebsiella sp. dengan melihat gambaran mikroskop, isolasi primer pada media, melihat penampakan koloni pada medium dan melakukan tes-tes biokimiawi antara lain : a. Mac Conkey Medium Mac Conkey

Agar termasuk salah satu media isolasi primer. Mac Conkey merupakan medium selektif differensial yang mengandung zat warna khusus dan karbohidrat untuk membedakan koloni yang memfermentasikan laktosa (bewarna merah muda) dengan yang tidak memfermentasikan laktosa (tidak bewarna), ukuran dan bentuk koloni bervariasi tergantung spesies. Kelompok lactosa fermenter seperti Klebsiella sp. menghasilkan koloni berwarna merah muda pada media isolasi primer (Gunarson,1998). Koloni Klebsiella sp. membentuk koloni yang mukoid. Medium Mac Conkey memungkinkan identifikasi persumtif secara cepat pada bakteri interik (Gupte , 1990). 1. Triple Sugar Iron Agar (TSIA) TSIA merupakan media yang dapat mengidentifikasi bakteri sesuai dengan karakter spesifik yang ditunjukkan oleh bakteri. Media TSIA mengandung 0,1% glukosa, 1% sukrosa, 1% laktosa, ferosulfat (untuk mendeteksi produksi H2S), ekstrak jaringan (substrat pertumbuhan protein), dan indikator pH (fenol merah). Zat tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi sehingga menghasilkan agar miring dengan bagian pangkal yang dalam dan diinokulasi dengan menusukkan pertumbuhan bakteri ke dalam bagian pangkal. Jika memfermentasikan glukosa bagian miring dan pangkal akan berubah warna kuning akibat sejumlah kecil asam yang dihasilkan. Apabila produk fermentasi kemudian dioksidasi menjadi CO2 dan H2O dan dilepaskan dari agar miring serta dekarbosilasi oksidatif protein masih berlanjut dengan pembentukan amino, bagian miring berubah menjadi alkalin (merah). Reaksi oleh Klebsiella sp. pada TSIA yaitu asam/asam 8 berwarna kuning pada bagian pangkal dan miring, dapat terdeteksi gas, tidak dihasilkan H2S (Brooks et al., 2008; Lehman, 2013). 2. Test motilitas pada agar semisolid Uji motilitas digunakan untuk melihat pergerakan dari bakteri yang ditandai adanya kekeruhan seperti kabut pada

media

(Bibiana,

1994).

Uji

Bakteri

diinokulasikan

dengan

menggunakan suatu kawat lurus melalui pusat medium. Organismeorganisme non-motil seperti Klebsiella sp. hanya tumbuh pada garis inokulum. Sedangkan organisme yang motil tumbuh keluar dari medium, dan tampak keruh (Brooks et al., 2008; Hart, 1997). 3. Tes Indol Uji indol untuk menilai pembentukan indol oleh bakteri dari triptopan sebagai sumber karbon. Bila positif menghasilkan warna merah

sedangkan apabila negatif menghasilkan warna kuning. Klebsiella sp. merupakan bakteri dengan indol negatif (Hart, 1997). Pembentukan indol dalam media dapat diketahui dengan penambahan reagen Kovacs yang mengandung dimetilaminobenzaldehid dan akan menghasilkan cincin merah pada permukaan media karena indol akan bereaksi dengan dimetilaminobenzaldehid sehingga membentuk rosindol yang berwarna merah (Bibiana, 1994). 4. Tes metil merah dan Voges – Prokauer (VP) Tes metil merah digunakan untuk mendeteksi produksi asam selama proses fermentasi glukosa. Pembentukan asam pada fermentasi glukosa memberikan warna merah dengan indikator metil merah. Voges – Prokauer merupakan uji untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan menentukan 9 bakteri yang menghasilkan produk netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari hasil fermentasi glukosa. Klebsiella sp. menghasilkan warna merah yang memberikan hasil positif terhadap reaksi VP (Hart, 1997). 5. Tes sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Enzim sitrat yang dihasilkan bakteri memecah sitrat yang berasal dari natrium sitrat dalam media menjadi piruvat yang selanjutnya akan direduksi pada proses fermentasi. Uji sitrat menggunakan indikator bromthymol blue. Hasil positif ditunjukkan

dengan

adanya

pertumbuhan

bakteri

dan

terjadinya

perubahan warna media dari hijau menjadi biru yang disebabkan oleh peningkatan pH medium di atas 7,6 karena adanya ammonia yang dihasilkan yang berasal dari monoammonium phosphate yang terdapat pada medium. Biakan diinokulasi pada media simmon sitrat agar dengan inokolum yang tipis kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Jika hasil positif terjadi perubahan warna indikator dari hijau menjadi biru yang bermakna pertumbuhan bakteri pada medium sitrat menghasilkan keadaan alkalis dan bakteri telah menggunakan sitrat. Klebsiella sp. memberikan reaksi positif terhadap penggunaan sitrat (Elmer, 2006). 6. Test urea Uji hidrolisis urea menunjukan bakteri menghasilkan enzim urease. Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease

yang menguraikan mikromolekul urea ((NH2)2CO) menjadi karbondioksida (CO2) dan ammonia (NH3). Dilakukan dengan cara menggoreskan pembiakan 1 ose pada permukaan agar miring. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Tes dinilai positif 10 apabila menghasilkan warna merah muda dan negatif apabila warna tidak berubah. Bakteri Klebsiella sp. menghasilkan nilai positif pada pemeriksaan ini (MacFaddin, 2000). Tabel 1 Karateristik Reaksi Uji biokimia Klebsiella sp.(Soemarno, 2003) NO Uji Biokimia 1

C.

Klebsiela Sp

TSIA Lereng/Dasar

Kuning/Kuning

Gas

Positif/+

Sulfur

Negative/-

2

SC

Positif/+

3

Urea

Positif/+

4

SIM Sulfur

Negative/-

Indol

Negative/-

Motiliti

Negative/-

TUJUAN PRAKTIKUM Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Gram negatif batang penyebab saluran pencernaan, saluran nafas, dan urogenital (Klebsiella pneumoniae) pada sampel rektal swab.

D.

ALAT DAN BAHAN 1. Alat Tabel 2. Alat yang Digunakan Praktikum No.

Nama Alat

Spesifikasi

1.

Tabung Reaksi

Kecil dan besar

2.

Tabung Durham

Tinggi 35 mm ; Diameter 6mm

3.

Batang pengaduk

P=15 cm

4.

Objek glass

25,4x76,2 mm

5.

Cawan Petri

Volume 20 mL, Ø 15 cm

6.

Ose tusuk dan bulat

Kawat NiCr

7.

Bunsen

Volume 200 mL

8.

Korek Api

-

9.

Rak Tabung Reaksi

12 Lubang; Ukuran 20 x 10 cm, Ø 1 cm

10.

Inkubator

Suhu 37°C

11.

Autoklaf

Portable 26.4 L

12.

Mikroskop

Fase kontras

13.

Pipet tetes

-

2. Bahan Tabel 3. Bahan yang Digunakan Praktikum No.

Nama Bahan

Spesifikasi

1.

Sampel air sumur

100 mL

2.

Media

a. Mac Conkey Agar b. TSIA c. SIM d. SC e. MR f.

3.

Deret uji gula-gula

VP

a. Glukosa 1% b. Laktosa 1% c. Manitol 1% d. Sukrosa 1%

4.

Akuades

-

5.

Alkohol

96%

6.

Pewarnaan Gram

a. Lar. Krystal violet b. Lar. Lugol c. Alkohol 95% d. Lar. Safranin

7.

Pewarnaan Kapsul

a. Tinta cina b. Methylen blue

E.

8.

NaCl fisiologis

PA (Pro Analisa)

9.

Pepton

PA (Pro Analisa)

10.

Sampel

Urin

PROSEDUR KERJA 1. Hari Ke-1 Dilakukan isolasi dari urin dengan ditanamkan pada media Mac Conkey Agar dengan strik Isolasi 4 kuadran. Diinkubasi secara aerob pada suhu 370C selama 24 jam. 2. Hari Ke-2 Diamati koloni hasil isolasi pada media Mac Conkey Agar, koloni Klebsiella pneumoniae akan tampak berwarna pink pucat basah, mukoid, kemudian dilakukan pewarnaan Gram dan pewarnaan kapsul pada koloni tersangka, lalu diamati di bawah mikroskop. Kemudian dengan ose tusuk diambil koloni yang sama lalu diinokulasikan pada media gula-gula (sukrosa, menitol, laktosa, glukosa), TSIA, SIM, Urease, MR, VP, dan SC, pada media TSIA dibuat goresan pada lereng dan ditusukkan ose hingga dasar tabung, pada SIM diinokulasikannya dengan ditusuk, pada Urease dan SC hanya digoreskan pada bagian lereng. Lalu diinkubasi semua media secara aerob pada suhu 370C selama 24 jam. 3. Hari Ke-3 Dilakukan pengamatan perubahan yang terjadi pada media Gula-gula ( sukrosa, menitol, laktosa, glukosa ) SIM, MR, VP, TSIA, Urease, dan SC a. Untuk media SIM menambahkan dengan Reagen covac’s 5 tetes. b. Untuk media MR menetesi media dengan Methyl red 5 tetes jangan digoyang. c. Untuk media VP menetesi media dengan KOH 10% % tetes dan alpha Naftol 5 tetes jangan digoyang.

F.

HASIL PENGAMATAN 1. Hasil Pengamatan Hari Ke-1 Ditanamkan sampel urin pada media Mac Conkey Agar (MCA)

2. Hasil Pengamatan Hari Ke-2 Terjadi pertumbuhan pada media MCA

Gambar 1 Hasil Isolasi Swab Fecal Tabel 4 Hasil Pertumbuhan Koloni No

Hasil pertumbuan koloni

1.

Bentuk

Bulat

2.

Ukuran

1-2 mm

3.

Warna

Pink

4.

Elevasi

Cembung

5.

Piggiran

Rata

6.

Ciri khas lain

Fermenter

7.

Permukaan

Basah

Pewarnaan kapsul dibaca pada mikroskop perbesaran 1000X dengan oil imersi Berdasarkan pewarnaan kapsul didapat :

Gambar 2 Hasil pengamatan pewarnaan kapsul

Bentuk

: Basil (Batang)

Sifat

: Kapsul positif (+)

Susunan

: monobasil

Tersangka

: Bacillus sp.

Pewarnaan Gram dibaca pada mikroskop perbesaran 1000X dengan oil imersi Berdasarkan pewarnaan Gram didapat : Bentuk

: Basil (Batang)

Sifat

: Gram Negatif (-)

Susunan

: monobasil

Tersangka

: Bacillus sp.

Gambar 3 Hasil Pewarnaan Gram 3. Hasil Pengamatan Hari Ke-3 Pada uji biokimia didapatkan hasil sebagai berikut : Tabel 5 Hasil Uji Biokimia No Uji Biokimia 1.

Pada

media

Hasil

Gambar

gula-

gula a. Glukosa

Fermenter Glukosa,

b. Laktosa

Fermenter Laktosa,

c. Manitol

Fermenter Manitol,

d. Sukrosa

Fermenter Sukrosa Gas positif(+) Gambar 4 Hasil Uji Biokimia Gula-gula

2.

Uji Sitrat (media

Terjadi perubahan

Simmon’s Citrate)

warna hijau menjadi biru, Uji sitrat positif (+) dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya. Gambar 5 Hasil uji sitrat

3.

Uji Urease

Terjadi perubahan warna kuning menjadi pink, uji urease positif (+), memiliki enzim urease sehingga dapat membentuk amoniak yang pHnya basa.

4.

Gambar 6 Hasil uji urease

Media SIM : a. Sulfur

Tidak hitam, Negatif (-)

b. Indol

Tidak terbentuk cincin ungu, Negatif (-)

c. Motilitas

Pinggiran bening tidak terdapat zona pergerakan bakteri seperti akar, Negatif (-)

Gambar 7 Hasil Uji Biokimia Sulfur, Indol, Motilitas

5.

Media TSIA

Asam/asam karena Pada lereng kuning (Fermenter glukosa/ asam) Pada dasar kuning (Fermenter sukrosa dan laktosa/ asam) Gas positif (+), Tidak hitam sulfur Negatif (-).

6.

Uji MR

Gambar 8 Hasil Uji Biokimia pada Media TSIA

Terjadi perubahan warna menjadi merah pH = 4,4, uji MR positif (+)

Gambar 9 Hasil uji MR

7.

Uji VP

Terjadi perubahan warna menjadi cokelat, Uji VP negative (-)

Gambar 10 Hasil uji VP

Rincian parameter yang diamati : Warna koloni pada MCA, hasil pewarnaan Gram, hasil pewarnaan kapsul, glukosa, laktosa, sukrosa, manitol, Methyl red (MR), Voges-Proskeuer (VP), Sulfur Indol Motility (SIM), Simmons’s Citrate (SC), Urease, dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Hasil perhitungan persentasi bakteri : 14 × 100% = 87,5% 16 G. PEMBAHASAN Pada praktikum yang telah di lakukan di atas didapatkan hasil: 1. Hari ke-I Dilakukan isolasi dari sampel rektal swab pada media Mac Conkey agar (MC) dengan strik isolasi. 2. Hari ke-II Ditemukan koloni berbentuk bulat, ukuran 2-3 mm, dengan pinggiran rata, berwarna merah muda pucat dan koloni basah. a. Dilakukan pewarnaan Gram Didapatkan hasil bakteri berwarna merah, dengan susunan mono basil,Gram negative, tersangka Klebsiela Sp. b. Dilakukan pewarnaan kapsul (Pewarnaan Burri-Gins) Didapatkan hasil bakteri memiliki kapsul, berwarna biru, berbentuk batang, tersangka Klebsiela Sp. c. Penanaman pada media uji Biokimia. 3. Hari ke-III Uji Biokimia : a. Gula-gula Didapatkan hasil fermenter dan gas positif/+ pada glukosa, fermenter dan gas positif/+ pada sukrosa, fermenter dan gas positif/+ pada laktosa, dan fermenter dan gas positif/+ pada inulin. b. VP Didapatkan

hasil

negative

yang

terbentuknya asetil metal karbinol (asetoin).

menandakan

tidak

c. MR Didapatkan hasil positif/+ kerena adanya fermentasi asam campuran (metilen glikon) sehingga terbentuk cincin merah setelah di tambahkan metilen red 1% d. SIM Didapatkan hasil sulfur negatif/- ditandai dengan tidak adanya warna hitam pada media. Indol negatif ditandai dengan tidak terbentuk cincin ungu pada permukaan tabung, karena bakteri ini tidak memiliki enzim Triptofanase yang dapat mengoksidasi asam amino menjadi indol. Motilitas negatif hal ini ditandai bengan atas media yang tidak berawan, jernih pada pinggir media, karena tidak ada pergerakan bakteri yang membebtuk seperti akar di sekitar daerah penusukan hal ini karena bakteri ini tidak memiliki flagel/alat gerak tetapi memiliki kapsul yang besar. e. TSIA Didapatkan hasil sulfur negative/-,

karena bakteri tidak

membentuk sulfur. Gas positif, karena bakteri saat memfermentasi menghasilkan O2. Dan warna dasar dan lerengnya kunung/kuning, akibat terbentuknya suasana asam oleh bakteri yang memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa. f.

SC ( Simon Citrat) Didapatkan hasil positif/+, karena bakteri menggunakan Citrat sebagai sumber karbonnya sehingga berwarna biru.

g. Urease Didapatkan hasil positif/+ karena bakteri memiliki enzim urease yang dapat menghasilkan amoniak yang bersifat basa dengan bantuan inikator Phenol Red sehingga berwarna merah muda. H.

KESIMPULAN Dari hasil praktikum isolasi dan identifikasi bakteri Gram negatif batang penyebab saluran pencernaan, saluran nafas, dan urogenital (Klebsiella pneumoniae) dapat disimpulkan dengan derajat persamaan 87,5% bahwa bakteri tersebut mengarah pada Klebsiella pneumoniae.

I.

DAFTAR PUSTAKA Anderson, K.F., Lonsway, D.R. & Rasheed, J.K., 2007. Evaluation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol, 45, pp.2723-5. Anderson, K.F., Patel, J.B. & Wong, B., 2009. Characterization of Enterobacteriaceae with a falsepositive modified Hodge test, Abstracts of the Forty-ninth Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. American Society for Microbiology, pp.719-41. Brisse, S., Grimont, F., and Grimont, P. A. D. 2009. The Genus Klebsiella. The Prokaryotes. 6(3): 159–196. Beesley, T., Gascoyne, N. & KnottHunziker, V., 1983. The inhibition of class C β-lactamases by boronic acids. Biochem J, 209, pp.229-33 Center of Disease Control and Prevention. 2009. Klebsiella pneumonia in Healthcare Setting Davin-Regli, A., Bolla, J. M., James, C., Lavigne, J. P., Chevalier, J., Garnotel, E., Molitor, A., dan Pagès, J. M., 2008. Membrane Permeability and Regulation of Drug "Influx and Efflux" in Enterobacterial Pathogens, Current Medical Chemistry Targ 9: 750-759. Musjaya, Guli, M. 2011. Mikrobiologi kesehatan (Untuk Fakultas MIPA) . Universitas Tadulako. Palu. Nordmann, P., Cuzon, G. & Naas, T., 2009. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemaseproducing bacteria. Lancet Infect Dis, 9, pp.228-36. Nouvellon, M. et al., 1994. Clonal outbreaks of extended-spectrum βlactamase-producing strains of Klebsiella pneumoniae demonstrated by antibiotic susceptibility testing, βlactamase typing, and multilocus enzyme electrophoresis. J. Clin. Microbial., 32, pp.2625-27. Phage Therapy Center. 2009. Klebsiela pneumoniae WHO. 2014. Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance 2014th ed. France: World Health Organization.

Pembimbing Praktikum,

..........................................

Praktikan,

Putu Hawidya Nanda (411117093)