Kelompok 3.docx

PENETAPAN KADAR THIAMIN DALAM SAMPEL TEPPUNG KACANG HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. TUJUAN 1. Dapat menetapkan kadar thiamine dalam sampel tepung kacang hijau dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 2. Dapat memahami cara kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) II. PRINSIP Thiamin (Vitamin B1) merupakan gabungan dari senyawa dengan cincin utama pirimidinnya dan senuyawa dengan cincin utama tiasol. Thiamin terdapat jumlah yang banyak pada biji-bijian terutama bagian kecambah dan bekatul padi. Kadar thiamin dapat ditetapkan dengan KCKT berdasarkan luas peak atau tinggi peak pada sampel. Hal ini disebabkan karena perbedaan distribusi senyawa analit dalam dua fasa yaitu laju migrasi Vitamin B1 antara fasa diam dan fasa gerak buffer methanol (35:65) dengan membandingkan waktu retensi sampel dan standar sehingga dapat ditetapkan kadar Thiamin. Prinsip KCKT menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur sampel. Dalam kromatografi, analisa dilakukan dengan cara memisahkan molekul berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat sampel bergerak melewati fasa diam karna terbawa oleh fasa gerak berdasarkan afinitas sampel terhadap fasa diam. III. DASAR TEORI Vitamin adalan senyawa organik yang dibutuhkan tubuh untuk mengatur fisiologi tubuh sesorang. Vitamin merupakan salah satu 5 kelompok gizi yang sangat diperlukan oleh tubuh. Di dalam tubuh vitamin berperan sebagai zat pengatur keseimbangan proses dalam tubuh. Vitamin dibagi menjadi dua kelompok yaitu vitamin yang dapat larut dalam air dan vitamin yang dapat larut dalam lemak. Vitamin B 1 adalah vitamin yang berasal dari kelompok vitamin yang larut dalam air. Jumlah kebutuhan vitamin dan mineral untuk manusia berbeda-beda sesuai dengan umur dan jenis kelamin. Tubuh manusia tidak dapat memproduksi vitamin sendiri, untuk itu kita sangat membutuhkan makanan yang mengandung vitamin dan mineral seperti sayur, buah,dan lain-lain. Selain dari makanan kita juga bisa mendapatkan itu dari mengkonsumsi suplemen. Thiamin juga dikenal sebagai vitamin B1. Thiamin juga mempunyai peran sebagai bagian dari koenzim dalam dekarboksilasi oksidatif asam alfa-keto. Berikut adalah struktur dari thiamin :

Thiamin merupakan gabungan dari molekul basa pirimidin dan tiazol yang dirangkai jembatan metilen. Tiamin mempunyai sifat yang larut dalam alkohol dan air, dapat rusak oleh panas, terutama dengan adanya alkali. Pada kondisi kering, thiamin stabil pada suhu 100°C selama beberapa jam. Kelembaban akan mempercepat kerusakannya. KCKT merupakan suatu metode pemisahan berdasarkan sifat fisika yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian, dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis suatu senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi yang tidak dapat dianalisis dngan kromatografi gas. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi adalah kromatografi yang dikembangkan menggunakan cairan sebagai fase gerak baik cairan polarataupun non polar, dan bekerja pada tekanan tinggi. Dalam kromatografi partisi cair baik fase diam maupun fase gerak berupa cairan, pelarut yang digunakan harus tidak dapat bercampur. Pelarut yang lebih polar biasanya digunakan sebagai fase diam, oleh karena itu sistem ini dinamakan kromatografi fase normal. Bila fase diam yang dipakai senyawa non polar, sedangkan fase geraknya polar atau terbalik dengan sistem fase normal maka sistemnya disebut kromatografi fase. Komponen utama alat yang dipakai dalam yaitu reservoir zat pelarut untuk fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor UV-VIS, dan rekorder. KCKT memerbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase gerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui kolom. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-destruksi dulu kemudian ditreatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisis menggunakan KCKT adalah harus tidak ada endapan dan harus bening. Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase gerak. Waktu ketika analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi dan menghasilkan kromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organic seperti methanol. Thiamin dilarutkan dalam larutan buffer pospat pH 4,5. Pemisahan terhadap thiamin dilakukan dengan menginjeksikan larutan contoh pada sistem KCKT menggunakan kolom fase terikat C18 fase gerak campuran bufferb pospat : methanol (65:35) secara isokratik dengan kecepatan air 0,5

mL/menit. Detektor yang digunakan adalah UV-Vis pada panjang gelombang 254nm. Dengan membandingkan luas area sampel dan standar maka konsentrasi thiamin dapat diketahui. Material dan bahan yang dibutuhkan dalam penetapan ini adalah Corong, Labu ukur 100 mL, Labu ukur 50 mL, Pialagelas 800 ml, Pialagelas 400 mL, Pipet tetes, Pipet colum 5 mL, Pipet serologi, Kertas saring Whatman No.41, dan penyaring milipore 0.22 μm. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Agilent 100, Detektor UV 254 nm, fase gerak methanol : buffer fosfat (65:35), 0,5mL/menit. Pereaksi yang digunakan : a. Buffer fosfat pH 4,5 b. Larutan standard induk Thiamin 1000 ppm c. Larutan single standard Thiamin 50 ppm JENIS- JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbonhidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan

kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. IV. CARA KERJA 1. Pembuatan Fasa Gerak Dicampurkan methanol dengan buffer pospat pada perbandingan 35:65 2. Pembuatan Buffer Pospat Ditimbang sebanyak 5,422 gram Kalium Hidrogen Pospat

Dimasukkan ke dalam labu takar 1L. Ditera dengan aquadest kemuadian dihomogenkan

Disonifikasi 15 menit dan disaring dengan kertas saring whattman 42

3. Pembuatan Standar Thiamin 1000 ppm, 50 ml

Ditimbang 50 mg Thiamin

Dimasukkan kedalam Labu Takar 50 ml

Ditera dengan menggunakan buffer pospat dan dihomogenkan

4. Pembuatan Single Standar 50 ppm sebanyak 50 ml Dimasukkan ke dalam labu takar 50 ml. ditera dengan buffer pospat dan dihomogenkan

Dipipet 2,5 ml larutan standard thiamine 1000 ppm

Disonikasi 15 menit dan disaring dengan kertas whattman 42

5. Preparasi Sampel Dimasukkan ke dalam Labu Takar 50 ml. Ditera dengan buffer pospat dan dihomogenkan

Ditimbang 1 gram sampel

Disiapkan gelas piala 250 ml diisi air agar labu takar tidak terjadi benturan saat disonikasi

PERHITUNGAN 1. Pembuatan Standar Thiamin 1000 ppm sebanyak 50 ml Massa Thiamin =

1000 𝑚𝑔 1000 𝑚𝑙

𝑥50 𝑚𝑙

= 50 mg 2. Pembuatan Deret Standar 50 ppm V1.C1 = V2.C2 V1 x 1000 ppm = 50 ml x 50 ppm V1 =

50 𝑚𝑙 𝑥 50 𝑝𝑝𝑚 1000 𝑝𝑝𝑚

Diencerkan 20x sebanyak 50 ml. Ditera dengan buffer pospat dan dihomogenkan. Disonikasi selama 15 menit

Disaring dengan menggunakan kertas saring whattman 42

= 2,5 ml Ppm =

𝐴𝑟 𝑃𝑂4 𝑀𝑟 𝐾𝐻2𝑃𝑂4

𝑥

𝑚 𝑣

34 𝑚𝑔/𝑚𝑚𝑜𝑙

5422 𝑚𝑔

= 136 𝑚𝑔/𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑥

1𝐿

= 1355,5 mg/L Massa = =

𝑀𝑟 𝐾𝐻2𝑃𝑂4 𝐴𝑟 𝑃𝑂4

𝑥 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑉

136 𝑚𝑔/𝑚𝑚𝑜𝑙 34 𝑚𝑔/𝑚𝑚𝑜𝑙

x 1355,5 mg/L x 1L

= 5422 mg = 5,422 gram V. DATA PENGAMATAN a. Tabel data pengamatan fisik sampel dan reagen No

Nama Reagen

Pengamatan Fiska

1 2

Thiamin Tepung Kacang Hijau

Warna Putih Putih

Bau Wujud Tidak berbau Padatan Bau khas Padatan kacang hijau

3

Metanol

Tak berwarna

Baukhas methanol

Cairan

4

Buffer Phospat

Tak berwarna

Tidak berbau

Cairan

5

Aquabides

Tak berwarna

Tidak berbau

Cairan

b. Data Sampel No

Uraian

Luas Area

1. 2.

Standar 50 ppm Sampel

4362755 9279339

VI. PERHITUNGAN 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑇ℎ𝑖𝑎𝑚𝑖𝑛

C standar Thiamin = 𝑉 𝑙𝑎𝑏𝑢 𝑡𝑎𝑘𝑎𝑟 𝑥 𝐹𝑝 =

50 𝑚𝑔 50 25

0.05 𝐿 𝑥 ( )

= 50 mg 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

C sampel terukur = 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑋 𝑐 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟

Retetion Time (Menit) 7.059 7.040

9279339

=4362755 𝑋 50 𝑚𝑔/𝑙 =106.3473 mg/L C sebenarnya

=

𝑐 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑥 𝑣 𝑙𝑎𝑏𝑢 𝑡𝑎𝑘𝑎𝑟 𝑥 𝑓𝑝 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑘𝑔) 𝑚𝑔 50 𝑥 0.05 𝑙 𝑥 ( ) 𝑙 25 1.0030 𝑥 10−3 𝑘𝑔

106.3473

=

= 106.029,2124 mg/kg

VII. PEMBAHASAN Praktik penetapan kadar thiamin dalam sampel tepung kacang hijau secara KCKT ditetapkan melalui pemisahan thiamin pada kolom ODS (Octa Desil Silica). Larutan uji dibawa oleh fasa gerak Buffer Phosphat : Metanol ke mix chamber, kemudian dipompa menuju fasa diam, di dalam fasa diam tersebut terjadi pemisahan sesuai dengan kepolaran sampel dan terpisah. Kemudian yang kepolarannya sama dengan fasa gerak akan terus terbawa ke detector dan terbaca sebagai read-out dalam bentuk kromatogram (Peak area dan waktu retensi). Pada penetapan thiamin dalam sampel kacang hijau secara KCKT menggunakan jenis elusi isokratik yang berarti dalam penggunaan komposisi pelarut/pelarutnya tidak berubah-ubah selama proses elusi. Thiamin merupakan gabungan dari molekul basa pirimidin dan tiazol yang mempunyai sifat yang larut dalam alcohol dan air, dapat rusak oleh panas dan dapat rusak dengan adanya alkali. Itulah yang menyebabkan dalam analisis ini menggunakan fasa gerak yang bersifat sedikit asam. Thiamin dapat rusak dengan adanya panas, oleh sebab itu analisis thiamin kurang cocok dengan menggunakan GC. Pada preparasi sampel dan standar perlu adanya sonikasi yang berfungsi untuk memperkecil ukuran partikel. Ketika ukuran partikelnya mengecil, kolom KCKT terminimalisir terjadinya penyumbatan. Dari hasil analisis didapatkan peak area dan waktu retensi. Ketika standar dianalisis didapatkan peak area sebesar 4362755 dengan waktu retensi yaitu 7.059 menit. Sedangkan pada analisis sampel didapatkan peak area sebesar 9279339 dengan waktu retensi 7.040 menit. Dari data tersebut dapat dianalisa secara kualitatif bahwa sampel mengandung thiamin dengan cara membandingkan waktu retensi dengan standar. Waktu retensi sampel mendekati waktu retensi standar, hal ini menunjukkan bahwa terdapat thiamin dalam sampel tersebut. Untuk analisis secara kuantitatifnya yaitu penentuan kadar thiamin dalam sampel. Untuk menentukan kadar thiamin diperlukan konsentrasi terukur pada sampel dengan cara membagi peak area sampel dengan peak area standar yang kemudian dikalikan dengan konsentrasi dari standar dan kemudian diolah menjadi kadar thiamin yang terdapat di dalam sampel. Dari hasil pengolahan data didapatkan konsentrasi kadar thiamin dalam sampel yaitu sebesar 106.029,2124 mg/kg.

VIII. KESIMPULAN Kesimpulan : jadi dari hasil penetapan kadar thiamin dalam sampel kacang hijau menghasilkan kadar thiamin sebesar 106.029,2124 mg/kg IX. DAFTAR PUSTAKA Arifin,Zaenal dan Ismail,Drs.H.E. Krisnandi. 2012. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Bogor : Sekolah Menengah Analis Kiia Bogor. Valls, Felicidad, dkk. 1999. Determination of Thiamin in Cook Sausages. Spain: Universidad De Burgos.