Isolasi Dan Pemurnian Mikrobia Serta Morfologi Sel Mikrobia.docx

ISOLASI DAN PEMURNIAN MIKROBIA SERTA MORFOLOGI SEL MIKROBIA Mas’arisaldy Khairul Barkatullah1, Gusti Nur Aida Fasha1, dan Witiyasti Imaningsih2 1. Program studi S1 Biologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jendral Ahmad Yani Km 36, Banjarbaru, 70713, lndonesia 2. Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA, Universitas Lambung Mangkurat, Jalan Jendral A. Yani Km 35,8 Banjarbaru, 70713, lndonesia Email: [email protected]

Abstrak Isolasi adalah pemisahan suatu strain mikrobia dari populasi alaminya. Metode isolasi yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir adalah metode streaking dan pour-plate. Kata kunci: aaaaa

1. Pendahuluan Dalam ilmu mikrobiologi, istilah isolasi merujuk pada pemisahan suatu strain mikrobia dari populasi alaminya seperti pada soil flora, skin flora, oral flora, dan gut flora agar dapat mengidentifikasi mikrobia tertentu. Terdapat lima metode plating yang digunakan untuk mengisolasi mikrobia, antara lain adalah streak-plating, pour-plating, spread-plating, soft agar overlay, dan replicaplating. Kelima metode tersebut menggunakan teknik aseptik dan mengharuskan kondisi steril yang terjaga agar resiko kontaminasi di laboratorium dapat diminimalisasi [1 = sanders]. Metode streaking, streak-plate, atau cawan gores adalah metode yang menggunakan prinsip dilusi dengan cara menggoreskan koloni mikrobia pada permukaan agar dalam cawan Petri. Streaking secara umumnya digunakan untuk mengisolasi bakteri. Penggoresan dilakukan menggunakan alat steril seperti jarum ose atau inoculation loop, jarum dipanaskan hingga menyala merah dan setelah panasnya reda dicelupkan kedalam inokulum, jarum kemudian ditarik menggores permukaan agar dengan gerakan zigzag hingga permukaan agar tergores sekitar 30%, jarum kembali dipanaskan dan cawan Petri diputar 90 derajat dan penggoresan diulang hingga dalam jarum tersebut tersisa satu sel bakteri yang dapat tumbuh menjadi koloni. Penggoresan pertama menghasilkan pertumbuhan yang banyak, dan semakin menipis pada tiap goresan hingga akhirnya terbentuk koloni yang terisolasi [2]. Metode pour plate biasanya digunakan untuk menghitung koloni yang terdapat dalam spesimen cair. Pada metode ini, inokulum dari broth diletakkan

pada bagian tengah cawan Petri menggunakan pipet, agar yang telah dicairkan kemudian dituangkan ke cawan Petri berisi inokulum, setelah tercampur dan agar kembali dalam bentuk solid, cawan dibalik dan diinkubasi. Mikrobia akan tumbuh pada permukaan dan di dalam medium, koloni yang terdapat dalam medium biasanya berukuran kecil sedangkan koloni yang terdapat pada permukaan agar memiliki ukuran sama dengan hasil metode streaking [3]. Mikroorganisme yang ada di alam mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasikan ialah dengan metode pengecetan dan pewarnaan menggunakan Gram staining. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologinya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan. Pada umumnya zat warna yang digunakan adalah senyawa-senyawa garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan mikroba tersebut. Sel-sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna, misalnya metilen blue, sehingga hasilnya sel tersebut akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabuangan antara zat warna dengan sel bakteri. Kebanyakan bakteri mudah berekasi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkali. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer. Bakteri-bakteri ini dinamakan bakteri tahan asam dan hal ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies. [4,5]. Jamur atau fungi banyak ditemukan di lingkungan sekitar kita, jamur tumbuh subur terutama di musim hujan karena jamur menyukai habitat yang lembab. Akan tetapi jamur juga dapat ditemukan hampir disemua tempat dimana ada materi organik. Jika lingkungan di sekitarnya 2 embrane 2 , jamur akan mengalami tahapan istirahat atau menghasilkan spora. Cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang jamur disebut mikologi. Kebanyakan jamur termasuk dalam kelompok kapang. Tubuh 2 embrane 2 e kapang berfilamen panjang bercabang yang seperti benang, yang disebut hifa. Hifa akan memanjang dan menyerap makanan dari permukaan substrat (tempat hidup jamur). Hifa membentuk membran benang kusut, disebut mycelium. Umumnya sel khamir lebih besar daripada kebanyakan bakteri, tetapi khamir yang paling kecil tidak sebesar bakteri yang terbesar. Setiap spesies mempunyai bentuk yang khas. Khamir sangat beragam ukurannya, berkisar antara 1 sampai 5 µm, lebarnya dan panjangnya 5 sampai 30 µm atau lebih. Pengamatan mikroskopis sel khamir dapat dilakukan

dengan membuat preparat basah yang diberi larutan methylin blue. Pada pengecatan sederhana yaitu pemberian methylin blue 0.1 %, sel khamir dapat dibedakan antara sel yang mati dengan yang hidup. membran yang mati akarnya berwarna biru. Sedangkan yang hidup tidak berwarna (transparan). Hal ini disebabkan oleh sifat membran sel yang selektif permiabel [6,7] 2. Metode Praktikum Isolasi dan Pemurnian Mikroba, pada praktikum isolasi dan pemurnian mikroba dilakukan dengan dua metoda yaitu metode taburan atau tuang (pour plate) dan metode sebar (spread plate). Langkah pertama yaitu Metode pengambilan sampel yang akan dilakukan pada praktikum ini yaitu, pilih tempat pengambilan sampel, kemudian ambil contoh tanah sampah dari kedalaman 5 cm dari permukaan tanah letakkan didalam plastik klip dan beri label, dan ambil sampel tanah kebun. Langkah selanjutnya yaitu menimbang tanah sampah dan kebun sebanyak 5 gram, masukkan kedalam erlenmenyer yang berisi 0,85% NaCl sebanyak 1/5 ml, dan tutup erlemenyer dengan kapas dan kertas. Terakhir, letakkan di orbital shaker selama 20 menit. Setelah itu dilakukan isolasi mikroba pada masing –masing sampel tanah. Metode gores atau streak plate, menggunakan loop ose lalu menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan harapan pada ujung goresan hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel pada medium. Sel sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya, agar didapatkan biakan murni. Sterilkan tangan dan tempat kerja, hidupkan bunsen, panaskan jarum ose menggunakan bunsen. Ambil sampel (sampel yang digunakan berasal dari tanah dibawah pohon yang berbuah), kemudian goreskan jarum ose ke media agar. Tutup cawan petri, lalu panaskan pinggiran cawan petri di bunsen agar steril, bungkus cawan petri menggunakan kertas. Metode tuang atau pour plate, dilakukan dengan menuangkan suspensi pada cawan petri atau dengan menyemprpotkan suspensi pada cawan petri menggunakan mikropipet, lalu suspensi di ratakan di atas media dengan cara digoyangkan pada permukaan meja laminar air flow membentuk angka delapan. Setelah itu pinggiran cawan petri dipanaskan dengan menggunakan bunsen dan bungkus cawan petri menggunakan kertas. Pewarnaan gram bakteri, panaskan jarum ose dengan menggunakan bunsen yang sebelumnya telah dicelupkan kedalam alkohol 70%, diulangi sebanyak 3 kali. Panaskan mulut tabung reaksi dengan bunsen lalu ambil biakan menggunakan jarum ose dan goreskan di atas gelas benda setelah itu di fiksasi di atas bunsen. Selanjutnya pewarnaan kristal violet selama 1 menit dan bilas dengan aquades, pewarnaan dengan lugol iodine selama 1 menit kemudian dibilas menggunakan aquades, dekolorisasi dengan aseton alkohol selama 30 detik lalu

bilas dengan aquades, terakhir diwarnai dengan safranin selama 1 menit dan dibilas menggunakan aquades dan diamati menggunakan mikroskop. Pewarnaan khamir, panaskan jarum ose menggunakan bunsen yang sebelumnya telah dicelupkan kedalam alkohol 70% ulangi sampai 3 kali, ambil biakan khamir dari tabung reaksi, goreskan pada gelas benda lalu beri pewarna metilen blue 0,1% ratakan lalu tutup menggunakan kaca penutup diamati menggunakan mikroskop. Pewarnaan fungi, panaskan jarum ose menggunakan bunsen yang sebelumnya telah di celupkan kedalam alkohol 70% ulangi sampai 3 kali. Panaskan mulut tabung reaksi dan ambil biakan fungi menggunakan jarum ose, goreskan di gelas benda lalu teteskan larutan lactofenol blue ratakan dan tutup dengan kaca penutup, amati di bawah mikroskop. 3. Hasil dan Pembahasan Tabel 1. Hasil Pengamatan Biakan Bakteri No .

Gambar

Tingkat Pengencera n

Jumlah koloni bakteri NA TB : 7

Ukuran

Bentuk

Margin

Elevasi

Small

1. Irregular, 2. Circular

Undulate

Raised

1.

10-4

2.

10-5

NA TB: 6

Small

Circular

Falmentus

Flate

3.

10-5

NA TS : 81

Small

1. Irregular, 2. Circular

Serrate

Isolat 1 :Umbnate Raised

10-4

NA TS : 304

Isolat 1: titik Isolat 2: Small

Isolat 1: Circular Isolat 2: Irregular

Isolat 1: Underlate Isolat 2: Lobate Isolat 3: Serrate

Flate

10-4

NA TS: 256

1. Small 2. Titik

1. Circular 2. Irregular

1. Undulate 2. Entine

Flate

4.

5.

6.

10-4

NA TB : 14

Small

1. Irregular 2. Circular

1. Undulate 2. Entine

Flate

7.

10-5

NA TS : 166

1. Small 2. Titik

1. Irregular 2. Circular

Undulate

Flate

8.

10-5

NA TS: 1

Big

Irregular

Lobate

Flate

Biakan mikroba yang diambil dari dua jenis tanah yakni tanah bekas jatuhnya buah dan tanah dekat tong sampah memberikan morfologi berbeda meskipun semua menggunakan media NA. Pada cawan Petri pertama yakni biakan pertama pada tanah basah yang diencerkan 10-4, terdapat tujuh koloni mikroba berukuran kecil, dan ada yang berbentuk irregular dan ada yang berbentuk circular, seluruhnya bermargin undulate dan elevasinya naik atau raised. Pada cawan Petri kedua yakni biakan kedua dari tanah basah yang diencerkan 10-5 terdapat enam koloni dengan ukuran kecil dan bentuk circular atau membulat seutuhnya, margin mereka falmentus dan elevasinya flat. Pada cawan Petri ketiga yakni biakan pertama tanah sampah yang diencerkan 10-5 terdapat delapan puluh satu koloni yang seluruhnya berukuran kecil dengan bentuk iregular dan sirkular, margin koloni ini falmentus dan elevasinya flat. Pada cawan Petri keempat yakni biakan kedua tanah sampah yang diencerkan 10-4 terdapat tiga ratus empat koloni yang dibagi menjadi dua isolat, pada isolat pertama ukurannya titik dan bentuknya sirkular dengan margin undelate dan elevasi flat, sementara pada isolat kedua ukurannya small dan bentuknya iregular dengan margin lobate dan keduanya memiliki elevasi flat. Pada cawan Petri kelima yakni biakan ketiga dari tanah sampah memiliki dua ratus lime puluh enam koloni yang dibagi menjadi dua isolat, isolat pertama berukuran kecil dan berbentuk sirkular dan bermargin undulat, sementara isolat kedua berukuran titik dengan bentuk iregular dan bermargin entine, keduanya bereleveasi flat. Pada cawan Petri keenam yakni biakan ketiga dari tanah basah dengan pengenceran 10 4 ditemukan empatbelas mikroba berukuran kecil, terdapat dua jenis mikroba yakni mikroba berbentuk ireguler dan sirkular, bermargin undulate dan entine, namun semuanya memiliki jenis elevasi flat. Pada cawan Petri ketujuh yakni pengamatan tanah sampah keempat terdapat seratus enam puluh enam koloni

dengan dua jenis ukuran yakni kecil dan titik, dua jenis bentuk yakni iregular dan sirkular, namun semuanya memiliki margin undulate dan elevasi flat. Pada cawan Petri kedelapan yakni pengamatan terhadap tanah sampah kelima, terdapat satu koloni, berukuran besar, berbentuk iregular, bermargin lobate, dan berelevasi flat. Kedelapan pengamatan menunjukkan isolat mikroba dengan morfologi beragam. Morfologi dilihat dari ukuran menunjukkan mikroba berukuran titik, kecil, dan besar. Morfologi bentuk menunjukkan mikroba berbentuk sirkular dan iregular. Morfologi margin menunjukkan jenis mikroba yang beragam, dan morfologi elevasi menunjukkan satu jenis mikroba yakni flat kecuali pada pengamatan pertama yakni mikroba berelevasi raised. Perbedaan paling mencolok adalah pada tanah buah tidak terlalu banyak koloni bakteri yang ditemukan namun pada tanah sampah koloni bakteri yang diisolasi mencapai ratusan. Tabel 2. Hasil Pengamatan Morfologi Sel Mikroba No

Nama Biakan

Pewarnaan

Foto Pengamatan

Keterangan

1

Steptococcus

-Perbesaran 400x -Bentuk: Oval dan membentuk rantai pendek - Gram positif

2

Fungi

- Gram A (crystal violet) - Gram B (lugol iodine) - Gram C (aseton alkohol) Gram D (safranin) Laktofenol blue

3

Khamir

- Methylen blue

-Perbesaran 40x

4

Khamir

- Metylen blue

Perbesaran 40x

5.

Bakteri ketebalan

- Gram A (crystal violet) - Gram B (lugol iodine) - Gram C (aseton alkohol) Gram D (safranin)

Perbesaran : 40 x

-Perbesaran 40x

Khamir

6.

- Metylen blue

Perbesaran: 40 x

Pengamatan pewarnaan sel mikroba menunjukkan bahwa terdapat perbedaan dalam teknik pewarnaan sel Streptococcus, fungi, dan khamir. Penggunaan mikroskop untuk mengamati mikroba yang telah diwarnai menunjukkan bahwa Streptococcus setelah diwarnai dengan pewarnaan Gram menunjukkan ciri-ciri Gram-positif. Fungi pada pengamatan ini menunjukkan warna biru pada hifanya setelah diwarnai lactophenol blue sementara khamir menunjukkan selnya yang besar setelah diwarnai dengan methylen blue. 4. Kesimpulan Isolasi mikroba digunakan untuk mengamati morfologi mikroba, terdapat dua jenis teknik isolasi yakni streak-plate dan pour-plate. Morfologi yang diamati antara lain jumlah koloni, ukuran, bentuk, margin serta elevasi. Pewarnaan mikroba bertujuan untuk memperjelas morfologi mikroba agar lebih mudah diamati di bawah mikroskop. Bakteri diwarnai menggunakan Gram staining sementara fungi dan khamir diwarnai dengan methylene blue dan lactofenol blue. DAFTAR PUSTAKA [1] [2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

Sanders, E. R. 2012. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of visualized experiments : JoVE 1(63): 1–15 Junges R., Khan R., Tovpeko Y., Åmdal H.A., Petersen F.C., Morrison D.A. .2017 Markerless Genome Editing in Competent Streptococci. Oral Biology 1537(1): 233-247 Saini, S. 2016. Surface cationized cellulose nanofibrils for the production of contact active antimicrobial surfaces. Carbohydrate Polymers 135(1): 239–247 Peck, M. 2017. A review of contemporary practice and proficiency with Gram staining in anatomical pathology laboratories. Journal of Histotechnology 40(2): 54–61 Gül, B. Y. D. Y. Imer, P. Park, I. Koyuncu. 2018. Selection of quorum quenching (QQ) bacteria for membrane biofouling control: effect of different Gram-staining QQ bacteria, Bacillus sp. T5 and Delftiasp. T6, on microbial population in membrane bioreactors. Water Science & Technology 78(2): 358–366 Brooks, G. F., K. C. Caroll, J. S. Butel, S. A. Morse, T. A. Mietzner. 2013. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical Microbiology. McGraw-Hill, London. Tortora, G. J. 2018. Microbiology. Pearson, New York