Inhibitory

Marian Kuczek Department of Experimental and Molecular Biology, University of Opole, Kominka 4, 45-035 Opole, Poland

Stała Michaelisa W 1913 roku Leonor Michaelis i Maund Menten opisali zależność szybkości reakcji katalizowanej enzymem inwertazą drożdżową od stężenia substratu, czyli od stężenia sacharozy. Sacharaza, dawniej zwana inwertazą katalizuje reakcję równowagową hydrolizy sacharozy.

W wyniku hydrolizy sacharozy, zmienia się skręcalność optyczna roztworu, z prawoskrętnego staje się lewoskrętny, stąd pochodzi stara nazwa enzymu, inwersja czyli odwrócenie. W tamtych czasach można było badać aktywność optyczną stosunkowo stężonych roztworów cukru. Jeżeli za miarę szybkości reakcji hydrolizy przyjmowano szybkość zmiany kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego, wówczas szybkość reakcji nie zależała od stężenia sacharozy i zależała wprost proporcjonalnie od stężenia enzymu. Reakcje, których szybkość nie zależy od stężenia substratu nazywa się reakcjami zerowego rzędu (patrz kinetyka reakcji chemicznych). Wcześniej, Michaelis celem wyjaśnienia zerowego rzędu reakcji wysunął przypuszczenie, że enzym z substratem wchodzi w reakcję równowagową tworząc kompleks enzym - substrat, dalsze badania kinetyki tej reakcji powierzył Mount Menten. Menten, założyła, że reakcja hydrolizy sacharozy jest reakcją pierwszego rzędu, czyli pominęła w swoich rozważaniach stężenie wody. Podejście takie jest często stosowane w badaniach kinetycznych, gdyż zużycie wody w roztworze wodnym podczas hydrolizy jest praktycznie niezauważalne. Drugie uproszczenie, to ograniczyła się do badania szybkości początkowej reakcji, czyli przyjęła: 1. Stężenie substratu nie zmienia się w wyniku powstawania kompleksu enzym substrat (ES), oraz nie zmienia się w istotnym stopniu podczas przebiegu reakcji, czyli reakcja biegnie ze stałą szybkością. 2. Zaniedbała szybkość reakcji odwrotnej, syntezy sacharozy z glukozy i fruktozy.

Szybkość reakcji. Szybkością reakcji nazywamy pochodną stężenia substratu(ów) lub produktu(ów) po czasie reakcji. Ze względów praktycznych zamiast równia różniczkowego stosuje się równanie różnicowe a umownie nazywa się je różniczkowym. v=

− d[S ] dt

v≈

∆ [S] ∆t

Szybkość reakcji inwersji (hydrolizy) sacharozy Menten badała wagowo i w przeciwieństwie do wcześniejszych badaczy mogła oznaczyć stężenia produktów reakcji przy bardzo małych stężeniach sacharozy.

Wykonanie W pierwszych latach ubiegłego stulecia stężenie cukrów redukujących badano wagowo. W wyniku reakcji zasadowego roztworu soli miedzi 2 powstaje osad tlenku miedzi 1. Osad ten odsączano, przemywano, suszono i ważono. Metoda ta była bardzo pracochłonna. W 1944 roku opisano kolorymetryczną metodę oznaczania cukrów redukujących i od tego czasu jest to najczęściej stosowania metoda.

Do kolejnych probówek dodaje się 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 3, 9 cm 3 0.2 M roztworu sacharozy w 0.1 M buforze octanowym o pH 4.5, dopełnia się do 9 cm3 buforem octanowym, miesza się i wstawia do łaźni wodnej o temperaturze 323 K. Po 10 minutach inkubacji w łaźni wodnej, kolejno do każdej probówki, w odstępach co 10 min, dodaje się po 1 cm3 ekstraktu białek z drożdży ponownie miesza się i umieszcza w łaźni wodnej. Stężenia sacharozy wynoszą kolejno: 0, 1, 2, 4, 10, 20, 60, 180 mM.

W takich samych odstępach czasu (co 10 min), po każdych 10 minutach dalszej inkubacji, z kolejnych probówek pobiera się po 0.1 cm3 roztworu, dodaje do 2.9 cm3 odczynnika odbiałczającego, miesza, po 5 mim odwirowuje osad białka.

Do 1 cm3 supernatantu dodaje się 1 cm3 odczynnika miedziowego (zasadowy roztwór winianu miedziowego), miesza, wstawia do wrzącej łaźni wodnej na 20 min. Po ostudzeniu dodaje się 1 cm3 odczynnika arseno-molibdenowego, wstrząsa do usunięcia wydzielonego dwutlenku węgla, dodaje się 7 cm3 wody, miesza i mierzy absorbancję przy 660 nm. Stężenie cukrów redukujących odczytuje się z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej.

Przedstawiona poniżej na wykresie zależność stężenia produktów reakcji od czasu początkowo układa się liniowo, czyli reakcja w początkowej części wykresu zachodzi z prawie stałą szybkością. Po długim czasie szybkość reakcji zmniejsza się, reakcja osiąga stan końcowy.

Wykres nachylenia krzywych początkowego przyrostu stężenia produktów reakcji od czasu, czyli wykres szybkości początkowej reakcji od stężenia substratu, przedstawia wycinek hiperboli.

Wraz ze wzrostem stężenia substratu, zwiększa się szybkość reakcji i asymptotycznie zbliża się do wartości zwanej szybkością maksymalną Vm. Krzywą zależności szybkości początkowej reakcji od stężenia sacharozy Menten opisała równaniem zwanym równaniem Michaelis-Menten. Równanie to jest uproszczonym rozwiązaniem równania reakcji równowagowej po której następuje reakcja nieodwracalna: E + S = ES ES = E + P gdzie: E - enzym, S - substrat, ES - kompleks enzym substrat, P - produkt. Zakładając, że szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia kompleksu ES, że szybkość maksymalna, czyli szybkość początkowa reakcji przy nieskończenie wielkim stężeniu substratu, jest wprost proporcjonalna do całkowitego stężenia enzymu, gdyż przy maksymalnie dużym stężeniu substratu, wystąpi maksymalne przesunięcie równowagi reakcji w kierunku powstawania kompleksu ES. W warunkach gdy mierzy się szybkość początkową reakcji można zaniedbać ubytek stężenia substratu oraz przy znikomym stężeniu produktu reakcji można założyć, że nie powstaje kompleks EP (enzym-produkt) w wyniku reakcji: E + P = EP. Stała równowagi reakcji dysocjacji ES K=

[E ][S ] [ES ]

Przyjmując, że stężenie enzymu [E] w stanie równowagi jest równe stężeniu całkowitemu enzymu [E(0)] pomniejszonemu o stężenie [ES], molowe stężenie substratu jest tysiące razy większe od stężenia enzymu zatem powstawanie kompleksu ES nie zmienia w istotnym stopniu stężenia substratu, równanie to przyjmuje postać:

K=

([ E ( 0)] − [ ES ])[ S ] [ ES ]

[ES ] =

[E (0)][S ] K + [S ]

Podstawiając Vm za [E(0)] i v (oznaczoną szybkość początkową reakcji) za [ES], co można zrobić gdyż zależność pomiędzy podstawianymi wartościami jest wprost proporcjonalna, powiązane są ze sobą tą samą stałą proporcjonalności zwaną stałą katalityczną, otrzymuje się równanie Michaelis - Menten, z tego równania można obliczyć stałą równowagi reakcji dysocjacji kompleksu ES. Stała równowagi K została nazwana stałą Michaelisa Km.

v=

Km =

Vm[S ] Km + [S ] (Vm − v )[S ] v

Michaelis L. and Menten M. (1913) Biochem. Z. 49, 333-369. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. (1944) J. Biol. Chem. 153, 375-80.

Inhibitory Enzymami nazywane są białka wykazujące funkcje katalizatorów. Katalizator to związek, który dodany do środowiska reakcji zwiększa jej szybkość. Związki zmniejszające szybkość reakcji nazwano inhibitorami. Jest stosunkowo mało reakcji, zwłaszcza związków organicznych, które zachodzą w temperaturze pokojowej bez katalizatorów. Katalizator, by zmieniał szybkość reakcji, musi brać udział w niej, nie ma sytuacji by sama jego obecność wystarczyła. Wszystkie znane mechanizmy katalizy enzymatycznej polegają na katalizie kwasowo-zasadowej. Należy jednak zwrócić uwagę, że kwasami mogą być kationy metali, podczas gdy ligandy tych kationów, czyli związki tworzące z kationami metali związki kompleksowe, mogą być zasadami. Inhibitor może zatem zmieniać szybkość reakcji gdyż reaguje z substratem (substratami) lub też dlatego, że reaguje z katalizatorem. W tym kontekście enzymy nie wykazują żadnych nadprzyrodzonych cech. Kinetyka reakcji enzymatycznych jest zgodna z prawami kinetyki chemicznej, również z tym zastrzeżeniem, że nie wszystkie z tych praw znamy. Biorąc jednak pod uwagę Teorię Stanu Przejściowego, nie obserwuje się w kinetyce enzymatycznej niczego co by ją odróżniało od kinetyki innych reakcji chemicznych. Nawet taka cecha jak swoistość enzymów, okazuje sie dogmatem. Dzięki temu, że enzymy są stosunkowo mało swoiste względem substratów, czasem spotyka się związki, które reaguję z enzymem (katalizatorem) i zmniejszają jego stężenie, są to właśnie inhibitory. Tego typu inhibitory zazwyczaj są bardzo "silnymi inhibitorami", często znane są jako bardzo dobre trucizny, czasem zwane lekami. Pozostałe inhibitory, to związki reagujące zazwyczaj z substratami, kompleksami enzymów z substratami (ES), ewentualnie są to związki denaturujące białka lub

związki denaturujące białko a wykazujące ograniczone powinowactwo do konkretnych enzymów, tzw. znaczniki centrum aktywnego. Ze względów komercyjnych, konieczności głoszenia dogmatu o doskonałych lekach, już trzeciej generacji, ile jeszcze tych generacji będzie ?, w literaturze podręcznikowej i popularno-naukowej spotykamy głównie częściową interpretację zjawiska inhibicji enzymów i podział na swoiste, są to konkurencyjne (kompetycyjne), akompetycyjne oraz nieswoiste, są to niekompetycyjne. Jednakże najczęściej inhibitory udaje się zakwalifikować do określonego typu tylko na podstawie badań kinetyki reakcji w wąskim zakresie stężeń substratów i inhibitorów, podczas gdy w szerszym zakresie wykazuję cechy dwóch typów.

Najczęściej wymienianym inhibitorem konkurencyjnym jest sól kwasu malonowego dla dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu związanego z błoną mitochondrialną. Dehydrogenaza bursztynianowa, katalizuje utlenianie bursztynianu (soli kwasu bursztynowego) przez koenzym Q (ubichinon). Enzym, tak jak większość enzymów jest mało swoisty, równie dobrze katalizuje reakcję utleniania bursztynianu innymi utleniaczami. Badając szybkość reakcji w roztworach wodnych wygodnie jest użyć błękit metylenowy zamiast naturalnego koenzymu. W roztworze wodnym, w obecności dehydrogenazy bursztynianowej oraz soli kwasu bursztynowego błękit metylenowy ulega redukcji do bezbarwnego związku. Za miarę szybkości reakcji przyjmuje się szybkość zmniejszania się absorbancji roztworu w zakresie światła czerwonego. Jeżeli do roztworu doda się trochę soli kwasu malonowego i przy zmiennym stężeniu bursztynianu wyznaczy się szybkość maksymalną oraz stałą Michaelisa, okazuje się że stała Michaelisa ulega znacznemu zwiększeniu, nie ulega zmianie

szybkość maksymalna. Czyli reakcja w obecności inhibitora osiąga taką samą szybkość maksymalną lecz przy znacznie większym stężeniu substratu. Na tej podstawie wysunięto przypuszczenie o konkurencji substratu (bursztynianu) z inhibitorem (malonianem) o miejsce w centrum katalitycznym enzymu. Czyli, inhibitorem konkurencyjnym (kompetycyjnym) nazywa się związek podobny do substratu, który pasuje do centrum katalitycznego enzymu, tworzy z enzymem kompleks podobny do kompleksu enzymu z substratem, lecz niereaktywny.

Przykład ten jest wyjątkowym przypadkiem. Inne przypadki inhibitorów konkurencyjnych wykazują zazwyczaj mieszane działanie, inhibitora konkurencyjnego i akompetycyjnego. Inhibitorem akompetycyjnym nazywa się związek, który dodany do reagującego roztworu enzymu z substratami zmniejsza wartość osiąganej szybkości maksymalnej i zmniejsza stałą Michaelisa. W wyniku analogicznych przekształceń algebraicznych do tych, które zastosowała Menten, można wysunąć hipotezę o równowagowej reakcji kompleksu enzymu z substratem oraz z inhibitorem. Trzeci przypadek, gdy zmniejszeniu ulega wartość asymptotyczna szybkości

maksymalnej a pozostaje bez zmiany stała Michaelisa, spotykany jest najczęściej, te inhibitory nazwano niekompetycyjnymi.

Po analogicznych do wykonanych przez M. Menten uproszczonych przekształceniach algebraicznych równań różniczkowych szybkości reakcji otrzymuje się uproszczone równanie szybkości reakcji enzymatycznej w obecności inhibitorów. v=

Vm[ S ] Ia   [ Ic]   Km 1 +  + [ S ] 1 +  Kc  Ka   

Fs =

1 [ Ic] 1+ Kc

Fes =

1 [ Ia] 1+ Ka

Gdzie Ic inhibitor konkurencyjny, Ia inhibitor akompetycyjny, Fs, Fes ułamki molowe odpowiednio enzymu lub substratu oraz kompleksu enzym-substrat dostępne w reakcji1. 1 Marian Kuczek. (2002) Biosystems 66, 11-20.

Wyżej przedstawione przypadki inhibicji nie wyjaśniają mechanizmu działania “bardzo silnych” inhibitorów, które przy stężeniach tysiące razy mniejszych od stężenia naturalnego substratu, wyraźnie zmniejszają szybkość reakcji. Często takie inhibitory wykazują cechy inhibitorów kompetycyjnych. Jeden przykład jest powszechnie znany, jest to kwas szczawiowy. In vivo nie jest tak bardzo trujący, dawką półletalną podobno jest około 100 g płynu do chłodnicy samochodowej. In vitro połowicznie hamuje dehydrogenazę mleczanową w stężeniu nieco poniżej 2 10^(-5) M. Ten typ inhibicji był wyjaśniony w 1946 roku przez Paulinga2, praca jego została przypomniana po ponad dwudziestu latach przez Wolfendena3. Tego typu inhibitory nazywane są analogami stanu przejściowego substratu. Stan przejściowy substratu pospolicie jest nazywany stanem wzbudzonym substratu, istnieje niezwykle krótko, nie można go otrzymać. Analog stanu przejściowego to związek trwały o bardzo podobnej budowie, który może analogicznie oddziaływać z enzymem jak stan przejściowy substratu.

Prawie wszystkie znane inhibitory kompetycyjne, czyli analogi substratów lub produktów, są kiepskimi inhibitorami, ich Ki jest co najwyżej równe stałej substratowej. Zatem by całkowicie zahamować aktywność enzymu inhibitor kompetycyjny musi być użyty w stężeniu wielokrotnie przewyższającym stężenie substratu, takie stężenia prawie nigdy nie są możliwe do osiągnięcia w warunkach in 2 L. Pauling, Molecular Architecture and Biological Reactions, Chem.Eng.,News. 1946. 24, 1375.

3 R. Wolfenden. Nature. 1969, 223, 704

vivo.. W 1969 roku było znanych zaledwie kilka analogów substratów, które wykazywały znacznie wyższe powinowactwo do enzymów niż substraty, Wolfenden wysunął przypuszczenie iż te związki są analogami strukturalnymi substratów w ich stanie przejściowy. Generalnie wszystkie reakcje zachodzą przez szereg krótkotrwałych stanów przejściowych. Jeżeli założyć, że kluczowym dla przebiegu reakcji jest stan substratu, w którym może nastąpić zerwanie jakiegoś wiązania chemicznego, wówczas stanem przejściowym substratu będzie stan naprężenia tego wiązania i czas trwania takiego stanu będzie odpowiadał czasowi pojedynczej wibracji wiązania, około 10-13 s. Jest to czas w którym nie można konwencjonalnymi metodami spektroskopowymi wykazać jego istnienia. Jednakże poznanie struktury stanu przejściowego ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia mechanizmu reakcji katalitycznej. Jeżeli rozważać reakcje katalityczne, wówczas należy założyć, że taki stan przejściowy substratu jest niezwykle silnie związany z katalizatorem. Oznacza to że, enzym reaguje z substratem tworząc kompleks "Michaelisa" o stałej dysocjacji Km, następnie przechodzi w kompleks aktywny, w którym zarówno substrat jak i enzym występują w stanie wzbudzonym. Powinowactwo substratu i enzymu w tym stanie wzbudzonym jest tak duże i stała dysocjacji kompleksu tak mała, że zazwyczaj nie można zauważyć uwalniania z centrum katalitycznego stanu wzbudzonego substratu, czyli stanu przejściowego. Reakcja enzymatyczna tylko dlatego zachodzi, że stan przejściowy jest nietrwały i natychmiast przechodzi w jeden ze stanów stabilnych, czyli z kompleksu aktywnego powstaje na powrót kompleks enzym-substrat lub kompleks enzym-produkt o znowu małym powinowactwie enzymu do produktu i stosunkowo dużej Kp (stałej równowagi dysocjacji kompleksu enzym-produkt) porównywalnej co do wielkości z Km. Szybkość reakcji enzymatycznych ulega przyspieszeniu w stosunku do niekatalitycznych reakcji zazwyczaj 1010 do 1015 razy, czyli jeżeli reakcja enzymatyczna przebiega w przeciągu 1 sekundy, to identyczny efekt niekatalitycznej reakcji wystąpi po 300 do 30.000.000 lat. Każda reakcja enzymatyczna przebiega przez minimum trzy pośrednie etapy, często metodami kinetycznymi można wykazać znacznie więcej takich pośrednich etapów, których czas półtrwania wynosi kilka milisekund. Według teorii stanu przejściowego bardzo krótki okres czasu całego cyklu reakcji, cząsteczka substratu spędza w postaci kluczowego dla procesu katalizy stanu, który nazywa się stanem przejściowym. Kompleks tego stanu przejściowego z enzymem powinien wykazywać stałą dysocjacji rzędu 10-14 do 10-23 M. Jeżeli możliwe było by otrzymane związku, który jest stanem przejściowym substratu, wówczas byłby to doskonały inhibitor, jednakże taki związek z natury swojej jest nietrwały. Jeżeli nie można otrzymać stanu przejściowego substratu, to może można otrzymać związek inny, podobny do stanu przejściowego, który będzie wykazywał nieco słabsze powinowactwo do enzymu, lecz będzie związkiem trwałym. Poniżej przedstawiono fragment reakcji w centrum katalitycznym hydrolaz "serynowych". Stanem przejściowym podczas hydrolizy estrów i amidów kwasów karboksylowych jest "tetraedryczna struktura grupy karbonylowej". Związki analogiczne z tą strukturą znalazły zastosowanie jako doskonałe trucizny a czasem jako środki owadobójcze.

Stan przejściowy substratu to inaczej substrat w stanie wzbudzonym, czyli wysokoreaktywny. Wszystkie hydrolazy to katalizatory przyspieszające reakcje przenoszenia ugrupowań takich jak acylowe, glikozydowe itp. na wodę, zwykle na anion OH, rolę takiego akceptora przenoszonej grupy mogą pełnić także inne związki

niż woda. Taka sytuacja występuje w przypadku niektórych toksyn bakteryjnych. Poniżej hydrolaza nukleozydowa.

O N N

Toksyny: cholery dyfterytu kokluszu

O

ADP H HO

OH

NAD+

R

R = OH- wody lub grupa S- białka wiążącego GTP Km białka wzrasta ok. 103

Takim właśnie inhibitorem transpeptydazy d-alanylowej jest penicylina, uważana jest za analog stanu przejściowego d-alanylo-d-alaniny. Bakterie uzyskują odporność na antybiotyki w wyniku wytworzenia enzymów rozkładających antybiotyki. Z enzymów rozkładających penicylinę najważniejsze są dwa enzymy (rysunek poniżej). Amidaza penicylinowa jest enzymem o znaczeniu technicznym. Z płynów hodowlanych wyselekcjonowanych bakterii, odpornych na naturalną penicylinę, odzyskuje się ten enzym. Enzym związany ze stałym podłożem, często tym stałym podłożem jest porowaty polistyren w postaci drobnych granulek, nazywany jest enzymem immobilizowanym. Można używać takiego enzymu wielokrotnie w reaktorach działających ciągle, przepływowych. Za pomocą amidazy penicylinowej otrzymuje sie z naturalnej penicyliny kwas penicylinoaminowy, który jest substratem do syntezy półsyntetycznych penicylin, czyli takich, które mają z kwasem penicylinoaminowym związany kwas o reszcie analogicznej do stanu przejściowego hydrolizowanej penicyliny. Drugą grupę antybiotyków grupy penicylin, opornych na enzym hydrolizujący pierścień β-laktamowy, otrzymuje się wg strategii zaproponowanej przez Blocha. Bloch, odkrywca biosyntezy cholesterolu, nazwał takie związki "samobójczymi substratami". Najwcześniej poznano dwa samobójcze substraty “β-laktamazy”: kwas klawulanowy – wyizolowany ze szczepów Streptomyces i syntetycznie otrzymany sulbaktam.

H

H

H N

S

C

Penicylina G

N

O O

H

COOH

Amidaza penicylinowa H

Kwas aminopenicylinowy

H S

H2N N O

H

COOH

Acylowanie

COOH

COOH

HN O

Ampicylina

COOH

NH 2

SO3H

Sulbecylina

N O

Cefoperazon

N C2H5

O

Piperacylina

Analogiczne do ugrupowań stanu przejściowego penicylinazy

SULBAMETACYNA = ampicylina + sulbaktam SULPERAZON = cefaloperazon + sulbaktam AUGMENTAN = amoksycylina + kwas klawulanowy Penicylina utleniona - analog sulbaktamu Kwas 6-bromopenicylinowy i 6-bromopenicylina

R''

penicylinaza

R H

S

C

H

H N

R

H

H N

S

N

O

C

CH 2

O

N

O O

R'

COOH

H

R' = H; OH; OCH3; O-CO-CH3 R'' = H - cefalosporyny R'' = OCH3 - cefalomycyny

COOH

β − laktamaza

penicyliny Penicillinum notanum

Cephalosporinum aceremonium Streptomyces lipmani S. clavuligerus

INHIBITORY β -LAKTAMAZY MONOBAKTAMY R' H N

R

H N

R

OH

C

C O

N O

O

N O H

SO3H

Monobaktam

Nokardycyny

COOH

KARBAPENY H

RO

H3C

S O

H

N H

O

Tienamycyny

N

R'

N

OH

O

H

On

CH

H

COOH

Kwas klawulanowy

COOH O

O HO NH 2

S

S

NH

N

N O C

(Amoksacylina)

O

O

O

CH 2

SULTAMYCYLINA

C O

O O

(Sulbaktam)

Samobójcze substraty enzymów Pomysł syntezy bardzo swoistych inhibitorów enzymów zrodził się po słynnej pracy Konrada Blocha z 1968 roku4. Inhibitory takie reagują z enzymem na wzór inhibitorów konkurencyjnych i wywołują nieodwracalną inaktywację enzymów. Inaktywacja występuje tylko wtedy gdy enzym w kompleksie z takim związkiem, katalizuje reakcję tak jak z naturalnym substratem. Do hodowli bakterii, które wymagały obecności w pożywce nienasyconych kwasów tłuszczowych, Bloch dodał kwas tłuszczowy zawierający wiązanie potrójne zamiast podwójnego. Okazało się, że enzym, hydrataza enoilo-CoA, ten enzym który katalizuje reakcję przyłączenia wody do nienasyconego acylu w procesie degradacji kwasów tłuszczowych, ulega trwałej inaktywacji a ów acetylenowy analog kwasu tłuszczowego zostaje trwale przyłączony do enzymu. Enzym zawiera w centrum katalitycznym dwie reszty histydyny. Te też reszty, a konkretnie atomy azotu pierścieni imidazolowych, biorą udział w katalizie reakcji. Atom azotu z przyłączonym jonem wodorowym jest kwasem, nieuprotonowany jest zasadą, czyli reakcja przebiega zgodnie z mechanizmem katalizy kwasowo-zasadowej.

Hydrataza enoilo-CoA katalizuje równowagową reakcję przyłączenia wody do wiązania podwójnego, enzym wg. tego samego mechanizmu także izomeryzację cis-trans. Jeżeli do centrum katalitycznego enzymu zostanie przyłączony analog acetylenowy substratu, wówczas identycznie jak w przypadku naturalnego substratu, zostaje odłączony jon wodorowy od atomu węgla α (przy grupie karboksylowej). Reakcja ta pociąga za sobą przegrupowanie wiązania potrójnego i powstaje silnie reaktywne wiązanie podwójne skumulowane (ugrupowanie allenowe). Centralny atom węgla ugrupowania allenowego jest tak nienasycony w elektrony, czyli posiada duży ładunek dodatni), że natychmiast reaguje z najbliższym elektrodonorowym atomem. Substrat zostaje trwale połączony z azotem pierścieniem imidazolowym histydyny w centrum aktywnym enzymu5.

4 5

Helmkamp GM Jr, Brock DJ, Bloch K. Beta-hydroxydecanoly thioester dehydrase. Specificity of substrates and acetylenic inhibitors. J Biol Chem. 1968 Jun 25;243(12):3229-31. Miesowicz FM, Bloch K. Purification of hog liver isomerase. Mechanism of isomerization of 3-alkenyl and 3-alkynyl thioesters. J Biol Chem. 1979 Jul 10;254(13):5868-77.

Inaktywacja hydratazy enoilo-CoA w wyniku reakcji z acetylenowym analogiem substratu. Związki wywołujące tego typu inaktywację enzymów początkowo nazwane zostały samobójczymi substratami enzymów. Rezultatem kilku następnych prac było: 1. wyjaśnienie mechanizmu działania znanych leków. 2. zaproponowanie ogólnej drogi planowania swoistych kowalencyjnych inaktywatorów enzymów. (E.J. Ariens, Ed., Drug Design Academic Press 1971). Zjawisko było znane znacznie wcześniej. W 1956 r. został opisany mechanizm inaktywacji transaminazy przez 2-aminocyjanoetan (β−aminopropionitryl). Związek ten występuje w postaci amidu kwasu glutaminowego w groszku pachnącym. Gdy nasi obecni przyjaciele, celem wytępienia amerykańskich autochtonów, wytępili bizony, na prerii zaczęły plenić się rośliny, które dawniej występowały stosunkowo rzadko. Jedną z takich roślin jest groszek pachnący. Krowy pasące sie w miejscach jego masowego występowania chorują na chorobę zwaną latyryzmem (nazwa pochodzi od nazwy rodzajowej rośliny). W przewodzie pokarmowym krowy amid kwasu glutaminowego ulega hydrolizie i aminopropionitryl jest inhibitorem transaminaz, dezaminaz, dekarboksylaz aminokwasowych. Szczególnie dobrze inaktywuje ε−dezaminazę lizynową, w efekcie nie powstają "wiązania krzyżowe" kolagenu, krowy dostają rozstępów skóry. Zapewne mają znacznie więcej dolegliwości, lecz istotne jest tylko to, że skóra nie nadaje się do przerobu. Mechanizm reakcji jest bardzo zbliżony do mechanizmu inhibitorów acetylenowych. Substrat przyłącza się trwale do grupy prostetycznej enzymu (fosforan pirydoksalu), lub też łączy go trwale z apoenzymem.

Mechanizm inaktywacji enzymów pirydoksalowych 2-aminocyjanoetanem. W 1943 roku stosując chymotrypsynę jako modelowy enzym zbadano mechanizm inaktywacji esterazy acetylocholinowej przez diizopropylofluorofosforam (DIFP). Związek ten będzie omówiony w skrypcie "Związki neurotoksyczne i psychotropowe".